Summary
Makrofag extracellulära fällor är en nyligen beskriven enhet. Denna artikel koncentrerar sig på konfokalmikroskopi metoder och hur de är visualiseras in vitro- och in-vivo från lungan prover.
Abstract
En primär metod som används för att definiera förekomsten av neutrofila extracellulära fällor (nät) är konfokalmikroskopi. Vi har ändrat etablerade konfokalmikroskopi metoder för att visualisera makrofag extracellulära fällor (METs). Dessa extracellulära fällor definieras av förekomsten av extracellulära kromatin med samtidig uttryck för andra komponenter såsom granule proteaser, citrullinerade histoner och peptidyl arginas deiminase (PAD). Uttrycket av METs allmänhet mäts efter exponering för en stimulans och jämfört med un-stimulerad prover. Prover ingår också för bakgrunden och isotypen kontroll. Celler analyseras med väldefinierade bild analys programvara. Konfokalmikroskopi kan användas för att fastställa förekomsten av METs både in vitro- och in-vivo i lungvävnaden.
Introduction
Neutrofila extracellulära fällor (nät), beskrevs först av Brinkmann o.a. 1 de framställs huvudsakligen i svar på infektion (särskilt till bakterier) och har en viktig roll i värd försvar1,2. De har också beskrivits i Svaren till icke-smittsamma sjukdomar, inklusive vaskulit och systemisk lupus erythematosus (SLE); och till mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetat (PMA)2,3. Det har nyligen erkänts att andra celltyper kan också producera extracellulära fällor, inklusive makrofager. Makrofag extracellulära fällor (METs) är ännu inte en väldefinierad enhet i litteratur4,5. Vi har nyligen etablerade metoder för att upptäcka förekomsten av METs både in vitro- och in-vivo6,7. I den här artikeln beskrivs mätning av METs använder konfokalmikroskopi.
Nyckel dragen av NETosis som skiljer den från andra cellulära vägar (till exempel apoptos8) är extrudering av kromatin i samband med: (1) citrullinering av histoner (H3Cit)9, (2) samtidig uttryck för granule proteaser10 , och (3) deltagande av peptidyl arginin deiminase (PAD) 411,12. Makrofager uttrycker också H3Cit, granule proteaser och PAD, och dessa funktioner kan användas för att fastställa förekomsten av METs.
METs kan ha en särskilt viktig roll i lungan, som makrofag är den dominerande cellen finns i alveolerna och luftvägarna i lungan och har de ursprungliga rollen i att styra cellulära immunsvaret mot infektion/inflammation. Medan mycket av lungan är tomt utrymme (t.ex., i alveolerna), är dessutom METs potentiellt kunna expandera till utrymmet som finns, i motsats till solid organ.
Den mest använda metoden för att definiera förekomsten av nät är av konfokalmikroskopi. Det finns ännu inte ett klart definierat sätt att mäta METs. Tekniken för mätning av nät har anpassats för att mäta förekomsten av METs i detta protokoll. De viktigaste kraven för denna metod är tillgång till konfokalmikroskopi och lämpligt bildprogram för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
detta protokoll följer experiment godkände i: (1) människor av den etiska kommittén av Monash Medical Centre, och (2) djur av den etiska kommittén av University of Melbourne.
1. bronkoalveolär Lavage (BAL) makrofager
- användning BAL att få lungcancer makrofager i: (1) mänskliga försökspersoner genom bronkoskopi 6 och (2) möss med hjälp av intra-trakeal aspiration 13 .
Obs: Förvärv av makrofager allmänhet orsakar vissa aktivering av dessa celler. Makrofager erhålls från patienter som kräver en bronkoskopi att undersöka potentiella medicinska problem och inte alla ämnen kan vara lämpliga för analys av METs (detta måste fastställas för varje enskilt projekt).- Tar BAL lösning och varva ner (500 x g i 10 min) till form en pellet, tvätta två gånger med odlingsmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) med 5% fetalt kalvserum och 1% L-glutamin) vid rumstemperatur och späd sedan celler i 4 mL kultur medi UM.
- Vid behov begära ett formellt differentialräkning, de flesta av cellerna (allmänt > 80%) kommer att makrofager 6.
Obs: Är detta generellt kommer att utföras av en klinisk histologi tjänst med morphologic utseende av olika celler typer 6. - Utför en livskraftig makrofag cell räkna om BAL lösningen med Trypan blå utslagning och en hemocytometer.
Obs: BAL lösning erhålls från människor och möss som nämns i steg 1.1. - Lägg till 1-4 x 10 5 makrofager att 24 brunnar på coverslips i 500 µL av odlingsmedium per brunn och lämna över natten vid 37 ° C; cellerna kommer att följa coverslips. För mänskliga prover, lägga till antibiotika (t.ex., penicillin och streptomycin, 10 4 U/mL) att förhindra bakteriell kontaminering.
2. Immunofluorescens märkning/mikroskopi av BAL makrofager
Obs: celler följs på coverslips som nämnts ovan.
- Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Fixa celler i 2% PARAFORMALDEHYD/natriumperjodat/lysin (PLP) fixativ för 10 min.
- Tvätta cellerna kort i PBS, och sedan permeabilize i 0,2% Tween-20 i PBS för 20 min.
- Blockera celler med 10% kyckling sera i 5% bovint serumalbumin (BSA) utspätt i PBS för 30 min.
- Inkubera med primär- och isotypen kontroll antikroppar för 1 h i rumstemperatur i 1: 100 koncentrationer (mer specifika detaljer listas i Tabell av material) vid 37 ° C.
Obs: För BAL prover, en specifik markör av makrofager krävs vanligtvis inte. - Efter tillägg av primära antikroppar, tvätta cellerna i PBS, och ytterligare Inkubera med motsvarande sekundära antikropparna för 40 min i rumstemperatur.
- Tvätta avsnitten i PBS och montera med DAPI-baserade monteringsmedium för visualisering med confocal Mikroskop (som nämns ovan) på laser excitationer 405, 488, 561 och 647 nm och en 40 X, 1.0 NA olja mål.
3. Lungan vävnadsprover
Obs: för in-vivo studier av lungvävnad, studera proverna efter relevant exponering (t.ex., som beskrivs av O ' Sullivan et al. 7). den exponering som är mest relevanta för detta experiment är smittsamma mikroorganismer, särskilt bakterier. Mus-stammar som kan användas för denna metod är C57BL/6 eller BALB/c möss, 10-12 veckor gamla, vikt 25-30 g och man.
- Euthanize möss, via en intraperitoneal injektion av ketamin (400 mg/kg) och xylazin (40 mg/kg). Öppna brösthålan och exponera lungor och hjärta med hjälp av kirurgisk pincett och sax.
- Ingjuta varma PBS med en 21-gauge nål in i höger kammare för att tvätta ur blodet från fartyg som för 30 s, sedan ingjuta 10 mL 2% PLP fixativ för 30 s (in i höger kammare).
- Använda varma PBS (42 ° C) till lavage öppen brösthålan. Intubation luftstrupen med en 21-gauge nål och en bit av 0,8 mm slangar tillskuret, och injicera 800 µL före värmde (till 42 ° C), låg smältpunkt 3% agaros lösning.
- Tie av luftstrupen med flätad silke (4.0 USP). Placera tråden runt luftstrupen, strax nedanför insättningspunkten av kanylen, och säkra den via en enkel överhandsknop. För att stelna Agarens, administrera iskall PBS runt lungorna. Ta bort lungor och hjärta som ett block från brösthålan med både sax och trubbig dissektion. Ta bort varje lunga individuellt och sedan fixa dem för 16 h i 2% PLP eller formalin vid 4 ° C.
- Lagra exemplaren i PBS vid 4 ° C tills vävnaden snittas. Dessa metoder för att erhålla lungvävnad har varit tidigare beskrivna 13.
- Prover Använd följande steg för att förbereda lungvävnad.
- Fix lungvävnad vävnader (resected i steg 3.1) i 10% naturlig buffrad formalin för 24 h i rumstemperatur. Överföra till 75% etanol och sätta i en vävnadsprocessor på en 12 h cykel, (2,5 h i 75% EtOH, 3 h i absoluta EtOH, 3,5 h i lösningsmedel 3B och 3 h i paraffin).
- Bädda i standard paraffin att skapa formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) block som lagras i rumstemperatur.
Obs: I detta skede är det allmänhet praktiskt att skära lung avsnitten för standard diabilder. - Skär avsnitten FFPE lungan på 4-5 µm tjocklek med en mikrotom och montera på debiteras, bestruket diabilder som tidigare beskrivs av O ' Sullivan et al. 7
- att montera bilder, sätta 3 droppar monteringsmedium på 60 x 24 mm coverslips (storlek 1.5), Invertera bilden på täckglaset och driva ut överflödig medium. Hermetiskt täta med nagellack och förvara i rumstemperatur.
4. Förberedelse/mikroskopi av Lung vävnadsprover
- de-vax, rehydrera och förbehandla FFPE lunga vävnad provet med antigen retrieval lösning.
- Ugn torr FFPE glider under 60 minuter vid 60 ° C. Sedan lägga bilderna i xylen lösning för 30 min och överföring till 70% etanol lösning för 5 min i rumstemperatur. Skölj i kranvatten.
- Plats i eldfast plastfolie och föremål HIER-antigen retrieval i en tryckkokare i 10 min i 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Cool för 20 min. Tvätta två gånger i vatten i 5 min på en rocker, sedan en gång med PBS på rocker.
- Block med 10% kyckling serum i 5% BSA/PBS i 30 min i rumstemperatur.
- Stain vävnaden.
- Att definiera METs i makrofager, lägga till primära antikroppar (MMP-9, H3Cit och F4/80) i 1% BSA/PBS under 16 timmar vid 4 ° C vid 1/100 utspädning (specifika detaljer om antikropp belopp anges i Tabell för material). Tvätta två gånger med PBS för 5 min på en rocker.
- Uppnå fluorescerande upptäckt genom inkubation med motsvarande sekundära antikroppar hos 1% BSA/PBS för 40 min i rumstemperatur. Antikroppar är: (1) kyckling antimus 488 (grön), (2) kyckling anti get 594 (röd) och (3) åsna antimus 647 (långt röd).
- Tvätta avsnitten i PBS och montera med DAPI-innehållande monteringsmedium för kromatin färgning.
- Få fluorescerande bilder med hjälp av en confocal laserscanning huvudet bifogas ett inverterat Mikroskop.
- Excite preparatet med 405, 488, 561 och 647 nm lasrar. Fånga bilder enda plan 512 x 512 pixlar genom att klicka på den linje-sekventiella, utjämning knappen (2 linje genomsnitt) med 20 X 0,1 NA luft och 40 X 1,0 NA olja mål.
- Erhålla minst tio synfält per avsnitt för analys och data för varje resultat (dvs. 10 high-power synfält (HFOV) för kontroll, 10 för stimulerad prov etc., för varje mus).
Obs: För att få ett representativt urval av hela fältet, ett matrix-system kan användas i vilket fältet delas in i olika sektioner och för varje olika prov samma matris används för att markera synfält (t.ex., fältet kan delas in i 9 delar, och från centrum och 4 hörn, två HFOV tas).
5. Tredimensionell (3-D) Imaging av METs
Obs: METs är 3D-strukturer, bilder, som är färdigberett, genom att ta flera z-stacken kan ge värdefull information.
- Avsnitt lung exemplaren från paraffinblock, på 200 µm med en vibratome med en amplitud på 1,8 mm och hastigheten på 0,1-0,5 mm/s.
- Blockera lungvävnad med 20% av respektive serum (10% fetalt kalvserum och 10% kyckling serum) och sedan permeabilize i PBS kompletteras och 3,75% Triton-X 100 för 7 h i rumstemperatur under försiktig skakning.
- Stain avsnitten för 16 h vid 4 ° C med de relevanta primära antikropparna (MMP-9, H3Cit och F4/80) i 200 µL volymer i mikrocentrifugrör (antikropp koncentrationer anges i Tabell för material).
- Tvätta avsnitten i PBS, 3 gånger i 10 min innan inkubation med relevanta sekundära antikroppar i rumstemperatur i 1 h.
- Stain avsnitten lung för DAPI (1:5, 000) i lösning för 20 min, innan att lägga täckglas till mikroskopet glider i PBS.
- Få fluorescens-bilder med hjälp av en inverterad confocal Mikroskop (40 x 1.3 NA) utrustade med 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm och 635 nm lasrar.
- Spela in 3D-z-stackar 0,54 µm tjocklek med optimal z-snittning för målet 40 x 1.3 NA olja.
Obs: Den programvara som används varierar beroende på individuella mikroskopet. Ett exempel på hur programmet kan användas för en Mikroskop tillhandahålls i kompletterande fil 1.
6. Bildanalys
Obs: analys av prover kräver användning av särskilda analys bildprogram och exempel listas i Tabell av material. Medan analysen av resultaten kommer att bero på det specifika program som används, de lista punkterna nedan är viktiga.
- Analys av BAL prover
- definiera antalet makrofager genom att markera den blå kanalen för DAPI och tilldela en minsta storlek för cellerna (t.ex., > 18 µm i diameter). Använda relevanta programvaran, mäter det totala antalet makrofager per fält.
- Räknar antalet celler som har funktioner i en marknadsekonomisk status av närvaron av extracellulära kromatin upptäcks av DAPI med samtidig uttryck av andra markörer (t.ex., MMP12, PAD2 och H3Cit).
Anmärkning: Antalet markörer som kan analyseras beror på antalet lasrar tillgängliga, men helst förutom DAPI, minst två andra markörer bör inkluderas. Andra mindre specifika parametrar för MET uttryck (t.ex., antal celler med extracellulära kromatin och en utvidgad nucleus) kan användas. - För att jämföra uttrycket MET i BAL analysera prover (mellan kontroll, rök, och rök/DNAS behandlade grupper), ett minimum av 100 BAL makrofager per prov.
- Att mäta sekundär antikropp och isotypen kontrollera nivåerna av fluorescens; mäta minst 100 celler i varje prov för deras fluorescens. Mäta den genomsnittliga nivån av bakgrunden fluorescens för varje markör (t.ex., H3Cit) använder standardprogramvara.
- Att definiera MET uttryck, räkna cellerna med den typiska fenotypen (t.ex., extracellulär kromatin med samtidig uttryck för H3Cit och MMP9) och för varje MET, mäta graden av fluorescens markörer (t.ex., H3Cit och MMP9). Utesluta celler som producerar METs om deras färgning inte var ovan bakgrund och isotypen kontroll.
- För mänskliga BAL prover, analysera minst 100 celler för varje prov för procent av makrofager som gör METs. För murina prover, som cellerna är mindre och METs är svårare att definiera, analysera ett större antal celler för varje prov (t.ex., 200 makrofager).
- Analys av lung vävnadsprover
- Använd specifika makrofag markör såsom F4/80 för att fastställa förekomsten av METs i lungvävnad,.
- Definiera förekomsten av METs i lungvävnaden med samtidig localizationen av F4/80 i celler som uttrycker extracellulära kromatin med andra parametrar som anges i avsnitt 6.1.
- Bestämma nivåerna av bakgrunden fluorescens i prover med sekundär antikropp och isotypen kontrollerna. Utesluta METs från analys som inte är ovan bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
METs kan visualiseras från BAL prover, i lungvävnaden och i tjockare lung sektioner med 3D-bilder. Ett exempel på METs visualiseras i en BAL-prov visas i figur 1. Morfologi av METs varierar beroende på deras fas av mognad. Den första detekterbara funktionen på mikroskopi är förflyttning av kärnan till kanten av cellen. Detta följs av extracellulära kromatin med andra co uttryckt medlare, såsom H3Cit och granule proteaser. I de tidigare stadierna har cellen fortfarande en ungefär sfäriska form med extracellulära fällan uttryckt. I senare skeden kännetecknas MET bildandet av töjning av kroppen av cellen.
Lungvävnad METs visas i figur 2. Eftersom lungorna är uppblåst med vätska att definiera lung arkitekturen, pressas METs generellt mot alveolära väggarna. Morfologi av METs varierar också beroende på vilken planet vävnaden skars i. Avsnitten standard används för lung vävnadsprover är 4-5 µm i tjocklek. Tjockare vävnadssnitt aktivera flera bilder tas och METs kan sedan ses i 3-D. Antikropparna kommer bara tränga så långt in lungvävnad och ett snittjocklek på 25-50 µm är optimal. Ett exempel på en 3D-bild visas i figur 3 och i Video 1.
Figur 1: BAL METs. Mänskliga BAL METs bildade efter stimulering på olika stadier av utveckling. METs präglades av extracellulära kromatin med samtidig uttryck för H3Cit och MMP9. Färgning för (A) kromatin, (B) H3Cit, (C) MMP9 och (D) den sammanlagda bilden. Panel skär är isotypen kontroller. Skala barer = 10 µm (15 µm för isotyp). Ett tidigare skede marknadsekonomisk status visas i det övre högra hörnet och har en ungefär sfäriska form. En mer mogen MET visas i mitten av fältet. Bilder är tagna med hjälp av en laser scanning confocal Mikroskop och ett 40 x 1,0 NA olja mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lungvävnad METs. Murina METs i lungvävnad efter stimulering. METs har präglats av extracellulära kromatin med samtidig uttryck för H3Cit, MMP9 och F4/80 (som makrofag markör). Panelen (A) visar en typisk high-power synfält som används för att mäta antalet METs; Paneler (B–F) visar streckad kvadratiska området i högre förstoring. Färgning för (B) kromatin, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 och (F) den sammanlagda bilden. Infoga-panelen är den isotyp-kontrollen. Skala barer = 20 µm (20 µm för isotyp). METs är generellt sköt mot alveolära väggarna. Bilder är tagna med hjälp av en laser scanning confocal Mikroskop och ett 40 x 1.3 NA olja mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tredimensionell bild av lung avsnitt. Mus lungvävnad var fast och skär i 25-35 µm tjocka sektioner. Vävnaden var märkt med markörer för METs och avbildas med sektioner på 1 µm tjocklek. Bilderna kombinerades med en z-stack att skapa en 3-dimensionell bild av en MET. Bilder är tagna med hjälp av en laser scanning confocal Mikroskop och ett 40 x 1.3 NA olja mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: tredimensionell bild av lung avsnitt. Video motsvarar varuprov i figur 3. Axis fästingar = 5 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i denna översyn är baserad på som används för att fastställa förekomsten av nät14. Makrofager är överlägset den dominerande Celltypen i BAL prover och denna metoden för insamling är särskilt lämpad för att studera METs. Om det finns röda blodkroppar i BAL bör dessa celler vara lyserat med hjälp av ammoniumklorid. Förfarandet för BAL allmänhet aktiverar makrofager och därför förväntas att METs finns i FN-stimulerad prover. BAL makrofager är vanligtvis mycket vidhäftande. BAL makrofager generellt behöver inte en specifik markör eftersom dessa celler är den dominerande celltypen och kan också urskiljas genom deras morfologi. Vanligtvis i en BAL, större än 80% av cellerna är makrofager (och neutrofiler är mindre än 5%), och efter flera tvättar, allmänt förblir bara de vidhäftande leukocyter (dvs, makrofager)6. Om det finns tvivel om förmågan att särskilja makrofager från neutrofiler i människor, kan neutrofila markör som neutrofila elastase användas. I lungvävnad krävs en specifik makrofag-markör (e.g., F4/80) som makrofager är svår att skilja från andra celltyper. Makrofager har auto-fluorescens så användningen av bakgrund och isotypen kontroller är viktigt; Detta är särskilt fallet med stimulerad prover.
Det bästa sättet att fastställa förekomsten av METs återstår för att pröva. Specifika vägar/processer, som är gemensamma för både neutrofiler och makrofager är: (1) granulat proteaser, (2) avsikten av histoner och (3) PAD. PAD4 är mer specifika för neutrofiler, medan PAD2 är mer framträdande hos monocyter/makrofager. Användning av F4/80 är en väl accepterade markör för murina makrofager, men mänskliga makrofager har inte sådan väldefinierade markörer och detta kan innebära problem vid bedömningen av mänsklig lungvävnad för MET uttryck. Kan vara svårare att analysera MET uttryck i lungvävnaden som det finns många andra celltyper och METs tenderar att skjutas på alveolära väggarna. När man analyserar vävnadssnitt, visualiseras METs bäst när de är platt i tvärsnitt; om METs är i ett annat plan kan det vara svårt att avgöra om en MET är närvarande. Problemet kan lösas till viss del genom att göra z-stackar för att möjliggöra djupare vävnad (3-D) plan för undersökning av METs och potential att visualisera METs i olika aspekter.
Det finns inte en väl accepterad metod för att fastställa förekomsten av METs i lungan prover. De beskrivna metoderna är baserade på de som används för att visualisera nät. Chow m.fl. beskrev att mitogen PMA inducerad METs i en makrofag cellinje, bedömning av förekomsten av extracellulära kromatin15. En senare studie visade att Mycobacterium tuberculosis inducerad METs in vitro som definieras av närvaron av extracellulära kromatin och H3Cit16. Vi har visat i vivo i en modell av glomerulonefrit, att METs är närvarande i njuren enligt definitionen av co lokaliserade kromatin och Histon myeloperoxidas7. Slutligen har vi visat förekomsten av METs i vitro i mänskliga lungan makrofag av kombinationen av extracellulära kromatin och MMP126. Vår metod kan användas av andra utredare till forskning om denna viktiga aspekt av den inflammatoriska reaktionen.
Det är troligt att METs ska kännas att ha en viktig roll i kronisk inflammatorisk sjukdom. De processer som leder till NETosis är fortfarande inte väldefinierade. Studien av METs kan ge betydande insikter i mekanismerna bakom fällan bildandet. Utvecklingen av protokoll med fler markörer och funktionella studier av METs kommer att ytterligare definiera rollen som METs i sjukdom.
Det finns kritiska steg som vi har identifierat i detta protokoll. De mänskliga BAL urvalen sannolikt har sekundär bakteriell kontaminering och användningen av antibiotika i odlingssubstratet är viktigt för att begränsa kontaminering. De primära och sekundära antikropparna kan variera i sin fluorescens, även med samma tillverkare. Slutligen, analys av lung vävnadsprover är mer komplex än BAL prover och kräver tid att utveckla en standardiserad metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar att göra i förhållande till detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades genom bidrag från Monash University, National Health och medicinska forskningsrådet, och Monash Lung och Sleep Institute. Författarna vill tacka Personalen på klinisk immunologi vid Monash hälsa, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass och Camden Lo av Monash Micro Imaging (MMI) för hjälp med den konfokalmikroskopi imaging, och författarna erkänner MMI faciliteter Monash University. Författarna erkänner de faciliteter och vetenskapligt och tekniskt stöd av Monash histologi plattformen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A.
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
