Summary
Un protocollo per la caratterizzazione di composizione chimica di respiro esalato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiato ad alta risoluzione in spettrometria di massa è dimostrata.
Abstract
Espirata composti organici volatili (COV) hanno suscitato notevole interesse, dal momento che possono servire come biomarcatori per la diagnosi della malattia e l'esposizione ambientale in modo non invasivo. In questo lavoro, vi presentiamo un protocollo per caratterizzare i COV espirati in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (Sec-nanoESI-HRMS). L'origine di Sec-nanoESI fatti in casa è stato prontamente istituito basata su un'origine commerciale nanoESI. Centinaia di picchi sono stati osservati negli spettri di massa sottratta a sfondo di respiro esalato, e i valori di accuratezza di massa sono -4,0-13,5 ppm e -20,3-1,3 ppm in modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi, rispettivamente. I picchi sono stati assegnati con accurata composizione elementare secondo il modello isotopico e massa accurata. Meno di 30 s è utilizzata per la misurazione di una espirazione, e si impiegano circa 7 minuti per sei misurazioni replicate.
Introduction
Con il rapido sviluppo di moderne tecniche analitiche, centinaia di composti organici volatili (COV) è state identificate nel condensato del respiro umano1. Questi COV derivano principalmente da aria alveolare (~ 350 mL per un adulto sano) e spazio morto anatomico aria (~ 150 mL)2, che sono influenzati da corpo metabolismo3,4,5,6,7 ,8 e inquinamento ambientale9, rispettivamente. Di conseguenza, se identificato, questi composti organici volatili sono promettenti per essere utilizzate come biomarcatori per la diagnosi di malattia e l'esposizione ambientale in modo non invasivo.
Anche se la gas cromatografia spettrometria di massa (GC-MS) è la tecnica più ampiamente usata per l'analisi qualitativa e quantitativa di espirata COV2, tecniche dirette di MS, che sono stati sviluppati per l'analisi in tempo reale respiro, presentano i vantaggi di elevata risoluzione temporale e pre-preparazione semplice del campione. Tecniche dirette di MS, come reazione di trasferimento di protone (PTR-MS) MS10, selezionato tubo di flusso dello ione MS (SIFT-MS)11, (anche denominato come electrospray estrattive secondaria electrospray ionizzazione MS (SESI-MS)12,13 ionizzazione MS, EESI-MS14,15), traccia gas atmosferico analyzer (TAGA)16 e plasma ionizzazione MS (PI-MS)17 sono stati studiati anni recenti.
Tra tutte le tecniche di MS dirette, SESI è ben noto come un'ionizzazione morbida universale tecnica19,20,21; e la fonte è facile da essere personalizzati e accoppiato a diversi tipi di spettrometri di massa, ad esempio, il tempo di volo spettrometro di massa8,15, presa dello ione di massa spettrometro14 e orbitrap spettrometro di massa12 ,18. Fino ad ora, SESI-MS è usato con successo nella diagnosi di malattie respiratorie22, ritmo circadiano3,6,23, farmacocinetica7,8, di misura e rivelando le vie metaboliche4, ecc. Più recentemente, una fonte commerciale di SESI è diventato disponibile.
In questo studio, una sorgente di ionizzazione facile e compatto nanoelectrospray secondario (Sec-nanoESI) è stata istituita e accoppiata ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Misurazioni in tempo reale di COV nell'aria espirata in respiro sono stati presentati.
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Protocol
Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale, ad esempio, camice, guanti, occhiali, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
1. impostare l'origine di Sec-nanoESI
- Impostare un'origine Sec-nanoESI secondo il processo SESI, vale a dire, il gas di respiro è introdotto per intersecare un pennacchio di electrospray e ionizzato dalle goccioline cariche (Figura 1). Le fonti costruite nei laboratori individuali dipendono dall'interfaccia di spettrometro di massa utilizzato24,25. Qui, impostare l'origine di Sec-nanoESI basato su un'origine commerciale nanoESI (Figura 2) e implementare ad uno spettrometro di massa di benchtop quadrupolo orbitrap.
Nota: Il corpo principale della fonte è un alloggiamento in acciaio inox cubico (lunghezza 25 mm, I.D. 13 mm) (Figura 2b) con un ingresso (I.D. 4 mm) per introdurre il capillare di nanoESI nella camera. Così, la camera non è completamente sigillato (Figura 2b). - Installare due tubi di acciaio (lunghezza 8 mm, diametro esterno 5 mm, I.D. 3 mm) su ciascun lato dell'alloggiamento per erogazione di gas.
- Equipaggiare due finestre di quarzo (I.D. 14 mm) sulla parte superiore e inferiore della camera per controllare la posizione della punta del nanoESI capillare e spray nanoESI occhi o un microscopio digitale.
- Saldare la camera al cono sweep di spettrometro di massa.
Nota: Il design può cambiare a seconda della particolare geometria dell'interfaccia pressione atmosferica dello spettrometro utilizzato nei singoli laboratori.
2. ottimizzazione strumento
- Calibrare lo spettrometro di massa in entrambi modi di rilevazione di ioni positivi e negativi secondo le istruzioni del produttore. Mediante l'applicazione di calibrazione, i parametri di spettrometro di massa, quali potenziali di lente e le condizioni di rilevamento, sono ottimizzati per dare buona sensibilità e forma di picco ad un valore di risoluzione specificata. La risoluzione di massa di 70000 è usata qui.
- Realizzi le calibrature Q Exactive complete utilizzando la fonte commerciale di ESI; Tuttavia, la massa calibrazione può essere effettuata con qualsiasi fonte compatibile, tra cui quelli su misura.
- Impostare la temperatura del tubo di trasferimento dello ione (ITT) lo spettrometro di massa > 100 ° c. Anche se il più alta temperatura può essere impostata a 350 ° C, può provocare la decomposizione di alcuni composti. Così, 150° C viene utilizzato in questo esperimento.
Nota: Per gli spettrometri di massa con un orifizio di campionamento invece di ITT, la temperatura dell'orifizio del campionamento è impostata > 100 ° C. - Per il tasso di solvente e la portata ESI, selezionare l'appropriato solvente ESI in base alle proprietà di solvente (ad es., polarità e volatilità) e di composti mirati (ad es., affinità protonica). Una miscela di acqua e metanolo in vari rapporti è stato comunemente utilizzata come solvente ESI25. In questo esperimento, utilizzare acqua contenente acido formico 0.1% (v/v), per efficienza di ionizzazione alta è stato segnalato questo solvente13,19,23. Impostare la portata del solvente ESI nella gamma di 0-1.5 μL/min e 200 nL/min.
Nota: Degas ESI solvente per 30 min prima dell'uso. - Ottimizzare i parametri di sorgente di Sec-nanoESI, principalmente nanoESI tensione e posizione della punta capillare nanoESI. La tensione varia comunemente da 2.0 a 4.5 kV. Uso 2.5 kV qui.
Nota: Più alta tensione di ESI è applicato come gli aumenti di tasso di flusso. La distanza tra la punta e l'orifizio di spettrometro di massa può essere regolata da 1 a 5 mm. Dopo l'ottimizzazione, il livello di intensità normalizzata (NL) osservato in uno spettro di massa deve essere > 1 x 106 e la variazione del cromatogramma ionica totale (TIC) dovrebbe essere < 10% in entrambe le modalità di rilevamento ioni positivi e negativi. Lo spettro di massa e le TIC vengono ottenuti nella gamma massa di m/z 50-750. - Applicare il gas puro all'origine. Si tratta di un passaggio facoltativo, al fine di ridurre l'influenza di COV da aria interna. Gas di elevata purezza dell'azoto (N2, 99,99%) o aria pura può essere utilizzato. Con la presenza di gas puro, NL osservate in uno spettro di massa deve essere > 1 x 105 e la variazione di TIC dovrebbe essere < 10% in entrambe le modalità di rilevamento ioni positivi e negativi. Elevata purezza N2 è usato qui e consegnato a 0,8 L/min.
Nota: La portata totale di gas puro e respiro gas deve essere superiore al tasso di flusso attraverso l'orifizio dello spettrometro.
3. misurazione di respiro esalato
- Inalare l'aria interna ed eseguire un'espirazione normale espirare tutta l'aria nei polmoni ad una portata costante. Monitorare il tasso di flusso di espirazione da un manometro o un misuratore di flusso visibile al soggetto. Utilizzare la tubazione del Teflon (PTFE) per consegnare il respiro gas23.
- Per evitare la condensazione del vapore acqueo all'interno delle tubazioni, riscaldare il tubo ad una temperatura di 80-100 oC7,23,27 o usare un Nafion essiccatore28,29. In questo esperimento, il soggetto espirata a 0,4 L/min controllato da un misuratore di portata.
- Collegare l'ingresso del misuratore di portata ad una tubazione di Nafion (lunghezza 60 cm) per rimuovere il vapore acqueo in respiro esalato e collegare l'uscita del contalitri ad una tubazione di PTFE (lunghezza 13 cm, I.D. 4 mm). Si impiegano < 30 s per una misurazione di espirazione.
- Eseguire 4-6 misure replicate28,29.
- Per ridurre al minimo gli effetti confondenti, avere partecipanti da mangiare, bere e lavarsi i denti almeno 30 min prima le misure23.
Nota: Per ridurre al minimo l'influenza di COV da aria interna, è stato segnalato per inalare gas puro invece di aria interna26. Quando viene utilizzato un tubo di Nafion, potrebbero perdersi alcune composti polari. - Durante la misurazione, mantenere il controllo se l'intensità dello ione supera il limite di rilevamento lineare dello strumento o non. La saturazione del segnale può portare a un picco di artefatto che non comporta praticamente dal composto nel campione. Inalando attraverso il naso, parte di ambiente COV e particelle sarebbe stato rimosso; Tuttavia, è degno di nota che possono essere rilevati anche composti nei passaggi nasali.
4. ottenere un'impronta di respiro e una traccia di tempo di un composto
- Ottenere cromatogrammi e spettri di massa. Utilizzare software (ad es., Xcalibur) per registrare cromatogrammi e spettri di massa. Perché si tratta di analisi diretta di MS e nessuna separazione cromatografica viene eseguita, il cromatogramma ionica totale (TIC) indica in realtà la traccia del tempo di tutti i segnali rilevati negli spettri di massa e il cromatogramma di ioni estratti (EIC) Mostra la traccia del tempo di un composto specificato.
Nota: Per altri spettrometri di massa commerciali, i cromatogrammi e spettri di massa possono essere ottenuti con il corrispondente software di acquisizione dati. - Ottenere un'impronta di respiro esalato selezionando un numero di scansioni nel TIC quando respiro esalato è misurato. Ottenere uno spettro di massa che rappresenta una media di queste scansioni dal software.
- Per eliminare i picchi di sfondo dall'impronta di respiro, è possibile utilizzare lo strumento di sottrarre sfondo nel software. Consultare la Guida utente fornita dal produttore. In breve, selezionare lo stesso numero di scansioni, quando non è stato introdotto nessun campione di respiro e sottrarre lo spettro di massa di sfondo dall'impronta di respiro.
Nota: In questo metodo, la soglia per identificare le caratteristiche nell'impronta digitale respiro è definita come tre volte la deviazione standard del segnale sfondo. Per altri spettrometri di massa commerciali, sottrazione di sfondo può essere eseguita tramite il software di acquisizione di dati corrispondente.
- Per eliminare i picchi di sfondo dall'impronta di respiro, è possibile utilizzare lo strumento di sottrarre sfondo nel software. Consultare la Guida utente fornita dal produttore. In breve, selezionare lo stesso numero di scansioni, quando non è stato introdotto nessun campione di respiro e sottrarre lo spettro di massa di sfondo dall'impronta di respiro.
- Ottenere una traccia di tempo di un composto specificato. Selezionare il picco di un composto mirato nell'impronta di respiro e il tempo traccia del composto viene acquisito successivamente dal software.
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Representative Results
La figura 3 Mostra le impronte di respiro nella gamma massa di m/z 50-750 iscritti tra le due modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi. 291 picchi (intensità di picco > 5.0 X104) e 173 picchi (intensità di picco > 3.0x104) sono stati osservati in impronte digitali respiro sottratto di sfondo in modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi, rispettivamente. Per identificare picchi negli spettri di massa, fare riferimento alle pubblicazioni precedenti per dettagli12,18,24,29. In breve, sono stati rilevati metaboliti volatili sia COV da aria interna. Ad esempio, il picco a m/z 74.0606 (Figura 3a) risultati da espirata N, N-dimetilformammide o aminoactone secondo il Database metaboloma umano (HMDB); punte a m/z 462.1447 e m/z 536.1638 (Figura 3a) sono dagli addotti di espirata ammoniaca e polisilossani (contaminanti laboratorio)12. I valori di accuratezza di massa tipica nella modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi sono -4,0-13,5 ppm e -20,3-1,3 ppm, rispettivamente. Figura 4 presenta il tracciato temporale dell'indolo, un tipico composto endogeno, che viene rilevato da sei misurazioni replicate di respiro esalato da un unico soggetto. Ci vogliono meno di 7 minuti per tutte le sei misurazioni.
Figura 1. Schema per l'analisi di SESI-MS di COV in respiro esalato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. (a) un diagramma schematico e (b) una foto della sorgente Sec-nanoESI utilizzata in questo esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sfondo-sottratto respiro impronte digitali ottenuti in positivo (a) e (b) modalità di rilevamento di ioni negativi nell'intervallo massa di m/z 50-750. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Traccia tempo di indolo rilevato da sei misurazioni replicate di respiro esalato da un unico soggetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Costruire la fonte di Sec-nanoESI basata su un'origine commerciale nanoESI, l'efficienza di ionizzazione è superiore a quello dell'utilizzo di un' origine ESI30. Inoltre, l'efficienza di ionizzazione è ulteriormente migliorata in una camera chiusa, come si isola il processo dall'aria sfondo dell'ambiente e allo stesso tempo facilita la miscelazione tra il campione di gas e il pennacchio di spruzzo. Utilizzando un Sec-nanoESI, meno i parametri devono essere ottimizzati rispetto ad una sorgente ESI, rendendo più facile per installazione, applicazione e manutenzione.
Se non si osserva alcun segnale o sensibilità diminuisce in modo significativo quando si esegue l'analisi dell'espirato di Sec-nanoESI-MS, uno deve controllare la posizione della punta del capillare di spray e anche la formazione di goccioline all'estremità del capillare. Allineare la punta con l'orifizio dello spettrometro. Modificare il capillare di spruzzo uno nuovo se il capillare di spruzzo è ostruito o la punta è contaminata. In caso contrario, verificare se l'ITT dello strumento è bloccato o contaminato. Sostituire o pulire la ITT se necessario. Tensione ESI prima spegnere lo spray di controllo capillare. Impostare la temperatura di ITT a temperatura ambiente e attendere fino a quando la temperatura scende giù.
SESI-HRMS ha dimostrato di essere una tecnica sensibile e selettiva per respiro in tempo reale analisi4,6,12. Negli ultimi anni, questa tecnica è stata applicata correttamente a misura variazione circadiana3,6, monitoraggio farmacocinetica7,8, identificazione di vie metaboliche5, ecc . Ultimamente, gli aminoacidi nel respiro umano sono stati quantificati con successo da SESI-MS per la prima volta, che è un notevole progresso in analisi quantitativa5. Con ulteriori indagini, SESI-HRMS potrebbe affermarsi come un metodo clinico non invadente utile ed efficiente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta finanziariamente dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 91543117).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
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