Summary
Un protocolo para la caracterización de la composición química de la respiración exhalada en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria nanoelectrospray junto a alta resolución, espectrometría de masas se demuestra.
Abstract
Exhalado compuestos orgánicos volátiles (COV) han despertado un gran interés, ya que pueden servir como biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad y la exposición ambiental de una manera no invasiva. En este trabajo, presentamos un protocolo para caracterizar los COVs exhalados en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (s-nanoESI-HRMS). La fuente Sec nanoESI casera fácilmente nace basada en una fuente de nanoESI comercial. Se observaron cientos de picos en los espectros de masa fondo resta de aire espirado, y los valores de exactitud total son-4.0-13,5 ppm y-20.3-1,3 ppm en los modos de detección de iones positivos y negativos, respectivamente. Las cumbres fueron asignadas con la composición elemental exacta según la masa exacta y el patrón isotópico. Menos de 30 s se utiliza para la medición de una exhalación, y tarda aproximadamente 7 minutos para seis mediciones replicadas.
Introduction
Con rápido desarrollo de técnicas analíticas modernas, se han identificado cientos de compuestos orgánicos volátiles (COV) en aire espirado humana1. Estos VOCs resultan sobre todo de aire alveolar (~ 350 mL en un adulto sano) y el espacio muerto anatómico del aire (~ 150 mL)2, que son afectadas por cuerpo metabolismo3,4,5,6,7 ,8 y9de la contaminación ambiental, respectivamente. Como resultado, si, estos VOCs son prometedores para utilizarse como biomarcadores para diagnóstico de enfermedades y la exposición ambiental de una manera no invasiva.
Cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS) es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo de exhalado COV2, técnicas directas de MS, que se han desarrollado para el análisis en tiempo real de la respiración, tienen las ventajas de hora de resolución y preparación previa de muestra simple. Técnicas directas de MS, como la reacción de transferencia de protones MS (PTR-MS)10, seleccionan tubo de flujo de iones MS (SIFT-MS)11, secundaria electrospray ionización MS (SESI-MS)12,13 (también nombrado como extractiva electrospray ionización, MS, MS EESI14,15), trace gas atmosférico analizador (TAGA)16 y plasma ionización MS (PI-EM)17 han sido investigados en años recientes.
Entre todas las técnicas de MS directas, SESI es conocido como una ionización suave universal técnica19,20,21; y la fuente es fácil de personalizar y junto a diferentes tipos de espectrómetros de masas, por ejemplo, el tiempo de vuelo espectrómetro de masas8,15, trampa de iones masa espectrómetro14 y orbitrap espectrómetro de masas12 ,18. Hasta ahora, SESI-MS ha utilizado con éxito en el diagnóstico de las enfermedades respiratorias22, medir el ritmo circadiano3,6,23, farmacocinética7,8, y revela caminos metabólicos4, etcetera. Más recientemente, se ha convertido una fuente comercial de SESI en disponible.
En este estudio, una fuente de ionización fácil y compacto nanoelectrospray secundaria (Sec-nanoESI) fue establecida y acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución. Se presentaron las mediciones en tiempo real de COVs exhalados en la respiración.
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Protocol
PRECAUCIÓN: Consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice equipo de protección personal, por ejemplo, bata, guantes, gafas, pantalón largo y zapatos cerrados).
1. establecer la fuente Sec nanoESI
- Configurar una fuente Sec nanoESI según el proceso SESI, es decir, el gas de respiración se introduce para intersecar un penacho de electrospray e ionizado por las gotitas cargadas (figura 1). Las fuentes que construyó en los laboratorios individuales dependen de la interfaz del espectrómetro de masas utilizada24,25. Aquí, establecer la fuente Sec nanoESI basada en una fuente de nanoESI comercial (figura 2) e implementar a un espectrómetro de masas orbitrap con cuadrupolo benchtop.
Nota: El cuerpo principal de la fuente es una cámara de acero inoxidable cúbica (longitud 25 mm, diámetro interior 13 mm) (figura 2b) con una entrada (ID 4 mm) para introducir el capilar nanoESI en la cámara. Así, la cámara no es completamente sellada (figura 2b). - Instalar dos tubos de acero inoxidable (longitud 8 mm, diámetro exterior 5 mm, diámetro interior 3 mm) a cada lado de la cámara de suministro de gas.
- Equipar dos ventanas de cuarzo (diámetro interior 14 mm) en la parte superior e inferior de la cámara para comprobar la posición de la punta del capilar de nanoESI y nanoESI spray ya sea ojos o un microscopio digital.
- Soldar la cámara en el cono de barrido del espectrómetro de masas.
Nota: El diseño puede cambiar dependiendo de la particular geometría de la interfaz de la presión atmosférica del espectrómetro de masas utilizado en los laboratorios individuales.
2. optimización del instrumento
- Calibrar el espectrómetro de masas en ambos modos de detección de iones positivos y negativos según las instrucciones del fabricante. Mediante la aplicación de calibración, parámetros de espectrómetro de masas, como objetivo potenciales y condiciones de detección, se optimizan para dar buena sensibilidad y forma de pico en un valor de resolución especificada. Aquí se utiliza la resolución total de 70000.
- Realizar calibraciones Q Exactive completadas mediante la fuente comercial de ESI; sin embargo, calibración de masas se puede realizar con cualquier fuente compatible, incluso personalizados.
- Ajustar la temperatura del tubo de transferencia de iones (ITT) de la espectrómetro de masa > 100 ° C. Aunque la temperatura más alta se puede fijar a 350 ° C, puede causar la descomposición de algunos compuestos. Así, 150° C se utiliza en este experimento.
Nota: Para los espectrómetros de masas con un orificio de toma de muestras en lugar de ITT, del orificio de muestreo se ajusta la temperatura > 100 ° C. - Para el tipo de solvente y flujo ESI, seleccione el disolvente ESI apropiado sobre la base de propiedades de solvente (por ejemplo, la polaridad y volatilidad) y compuestos específicos (e.g., afinidad protónica). Una mezcla de agua y metanol en diferentes proporciones se ha utilizado comúnmente como solvente ESI25. En este experimento, utilizan el agua que contiene el ácido fórmico 0,1% (v/v), eficiencia de ionización alta ha reportado este solvente13,19,23. Fijar el caudal de disolvente de la ESI en el rango de 0-1.5 μL/min y 200 nL/min.
Nota: Degas ESI solventes por 30 min antes de su uso. - Optimizar parámetros de fuente Sec nanoESI, principalmente nanoESI voltaje y posición de la punta capilar de nanoESI. La tensión habitualmente oscila entre 2.0 y 4.5 kV. Uso 2.5 kV aquí.
Nota: Se aplica un voltaje más alto ESI como los aumentos de la tasa de flujo. La distancia entre la punta y el orificio del espectrómetro de masas puede ajustarse de 1 a 5 mm. Después de la optimización, el nivel de intensidad normalizada (NL) en un espectro de masas debe ser > 1 x 106 y la variación del cromatograma de iones totales (TIC) deben ser < 10% en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. El espectro de masas y TIC se obtienen en el rango de masas de m/z 50-750. - Aplique gas puro a la fuente. Este es un paso opcional, con el objetivo de reducir la influencia de compuestos orgánicos volátiles del aire interior. Gas nitrógeno de alta pureza (N2, 99.99%) o aire puro puede ser utilizado. Con la presencia de gas puro, el NL observada en un espectro de masas debe ser > 1 x 105 y la variación de las TIC deben ser < 10% en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. Alta pureza N2 se usa aquí y entregado en 0,8 L/min.
Nota: El caudal total de gas puro y aliento debe ser superior a la tasa de flujo a través del orificio del espectrómetro de masas.
3. medición de aire espirado
- Inhalar el aire interior y realizar una espiración normal que exhale todo el aire de los pulmones con un caudal constante. Monitorear la tasa de flujo de exhalación por un manómetro o un medidor de flujo visible al sujeto. Use tubería de teflón (PTFE) para entregar el gas de respiración23.
- Para evitar la condensación del vapor de agua dentro de la tubería, calentar el tubo a una temperatura de 80-100 oC7,23,27 o utilizar un Nafion secador28,29. En este experimento, el sujeto exhala en 0,4 L/min controlado por un medidor de flujo.
- Conecte la entrada del metro de flujo en una tubería de Nafion (longitud 60 cm) para remover el vapor de agua en el aire espirado y conectar la salida del metro de flujo en una tubería de PTFE (longitud 13 cm, diámetro interior 4 mm). Toma < 30 s para una medición de la exhalación.
- Realizar las mediciones replicadas de 4-628,29.
- Para minimizar los efectos de confusión, que los participantes de comer, beber y cepillarse sus dientes por lo menos 30 min antes de las mediciones23.
Nota: Para minimizar la influencia de compuestos orgánicos volátiles del aire interior, se ha divulgado para inhalar gas puro en lugar de aire interior26. Cuando se utiliza una tubería de Nafion, se pueden perder algunos compuestos polares. - Durante la medición, seguir comprobando si la intensidad de iones supera el límite de detección lineal del instrumento o no. La saturación de la señal puede conducir a un pico de artefacto que no resultan prácticamente de compuesto en la muestra. Inhalando por la nariz, se eliminaría parte del ambiente COV y partículas; sin embargo, cabe destacar que también se pueden detectar compuestos en los pasos nasales.
4. obtener una huella de aliento y un rastro de tiempo de un compuesto
- Obtener los cromatogramas y espectros de masas. Utilizar el software (por ejemplo, Xcalibur) registro cromatogramas y espectros de masas. Porque este es el análisis directo de MS y no separación cromatográfica se realiza, el cromatograma de iones totales (TIC) indica realmente la huella del tiempo de todas las señales detectadas en los espectros de masas y el cromatograma de iones extraídos (EIC) muestra la huella del tiempo de un compuesto especificada.
Nota: Para otros espectrómetros de masas comerciales, los cromatogramas y espectros de masas pueden obtenerse el correspondiente software de adquisición de datos. - Obtener una huella de respiración exhalada seleccionando una serie de exploraciones en las TIC cuando se mide la respiración exhalada. Obtener un espectro de masas que representa un promedio de estas exploraciones por el software.
- Para eliminar picos de fondo de la huella digital de la respiración, utilice la herramienta de fondo de restar en el software. Por favor consulte la guía del usuario suministrada por el fabricante. En Resumen, seleccione el mismo número de análisis cuando no se introduce muestra de aliento y restar el espectro de masas de fondo de la huella digital de la respiración.
Nota: En este método, el umbral para identificar las características de la huella digital de la respiración se define como tres veces la desviación estándar de la señal de fondo. Otros espectrómetros de masa comerciales, de fondo se puede realizar por el software de adquisición de datos correspondiente.
- Para eliminar picos de fondo de la huella digital de la respiración, utilice la herramienta de fondo de restar en el software. Por favor consulte la guía del usuario suministrada por el fabricante. En Resumen, seleccione el mismo número de análisis cuando no se introduce muestra de aliento y restar el espectro de masas de fondo de la huella digital de la respiración.
- Obtener un seguimiento de tiempo de un determinado compuesto. Seleccionar el pico de un objetivo compuesto en la huella de la respiración y el tiempo de rastro del compuesto es adquirida posteriormente por el software.
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Representative Results
La figura 3 muestra las huellas de la respiración en el rango de masas de m/z 50-750 registrados en ambos modos de detección de iones positivos y negativos. picos de 291 (intensidad máxima > 5.0x104) y 173 (intensidad máxima > 3.0x104) se han observado en las huellas de respiración resta de fondo en los modos de detección de iones positivos y negativos, respectivamente. Para identificar picos en los espectros de masas, consulte las publicaciones anteriores para detalles12,18,24,29. En Resumen, se han detectado metabolitos volátiles y compuestos orgánicos volátiles del aire interior. Por ejemplo, el pico en m/z 74.0606 (figura 3a) resultados de exhalado N, N-Dimetilformamida o aminoactone según la base de datos humana de Metabolome (HMDB); a m/z 462.1447 y m/z 536.1638 (figura 3a) es de los aductos de exhalado amoníaco y polisiloxanos (contaminantes de laboratorio)12. Los valores de exactitud típica masa en modos de detección de iones positivos y negativos son-4.0-13,5 ppm y-20.3-1,3 ppm, respectivamente. Figura 4 presenta la huella del tiempo de indol, un compuesto endógeno típico, que es detectado por seis mediciones replicadas de respiración exhalada de un tema. Tarda menos de 7 min para todas las mediciones de seis.
Figura 1. Esquema para el análisis de SESI-MS de VOCs en aire espirado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. (a) un diagrama esquemático y (b) una foto de la fuente s-nanoESI utilizada en este experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Aliento de fondo resta las huellas dactilares obtienen en (a) positiva y (b) modos de detección de iones negativos en el rango de masas de m/z 50-750. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Rastro de tiempo de indole detectado por seis mediciones replicadas de respiración exhalada de un tema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Construcción de la fuente Sec nanoESI basada en una fuente de nanoESI comercial, la eficiencia de ionización es mayor que la de usar una fuente ESI30. Además, la eficacia de la ionización es mejorada en una cámara cerrada, como aislantes el proceso desde el aire ambiente de fondo y al mismo tiempo facilita la mezcla entre la muestra de gas y la nube de aerosol. Mediante el uso de un Sec-nanoESI, menos parámetros deben optimizarse en comparación con una fuente ESI, haciéndolo más fácil para la instalación, uso y mantenimiento.
Si no se observa ninguna señal o sensibilidad disminuye significativamente cuando se realiza el análisis de aliento por Sec-nanoESI-MS, uno debe comprobar la posición de la punta capilar spray y también la formación de gotas en la punta del tubo capilar. Alinee la punta con el orificio del espectrómetro de masas. Cambiar el capilar spray uno nuevo si el capilar spray está bloqueado o está contaminada la punta. En caso contrario, compruebe si el ITT del instrumento está bloqueado o contaminado. Reemplace o limpie el ITT si es necesario. Desactivar tensión ESI antes de verificar el spray capilar. Fijar la temperatura del ITT a temperatura ambiente y esperar a que la temperatura desciende.
SESI-HRMS ha demostrado ser una técnica sensible y selectiva para respiración en tiempo real análisis4,6,12. En los últimos años, esta técnica se ha aplicado con éxito a medición variación circadiana3,6, identificación de rutas metabólicas5, monitorización farmacocinética7,8, etcetera . Últimamente, los aminoácidos en la respiración humana se han correctamente cuantificados por SESI-MS por primera vez, que es un avance notable en el análisis cuantitativo5. Con otras investigaciones, SESI-HRMS se podría establecer como un método no invasivo de clínico útil y eficiente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 91543117).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
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