इस प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता रोग की प्रेरण दर्शाता है और इसके विपरीत का उपयोग करता है बढ़ाया माइक्रो गणना टोमोग्राफी घाव बोझ को मापने के लिए । इस विधि की स्थापना की माउस मॉडल के मूल्य को बढ़ाता है आणविक आधार और मस्तिष्कीय गुफा कुरूपता और अंय मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए संभावित उपचार का अध्ययन ।
CCM1 (उर्फ KRIT1), CCM2, या CCM3 (उर्फ PDCD10) जीन में उत्परिवर्तनों मानव में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता (सीसीएम) के कारण । प्रसव पशुओं में सीसीएम जीन के tamoxifen प्रेरित विलोपन द्वारा सीसीएम रोग के माउस मॉडलों की स्थापना की गई है । इन माउस मॉडलों को आणविक तंत्र और सीसीएम रोग के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं । घाव के बोझ और प्रगति का आकलन करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि इन पशु मॉडलों के पूर्ण मूल्य का दोहन करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक माउस मॉडल में सीसीएम रोग की प्रेरण प्रदर्शन और इसके विपरीत का उपयोग बढ़ाया एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) विधि माउस दिमाग में सीसीएम घाव बोझ को मापने के लिए । प्रसव day 1 (P1) पर हमने 4-hydroxytamoxifen (4HT) को recombinase-Cdh5 CreErt2 के transgene floxed से सट कर Cre एलील गतिविधि को एक्टिवेट करने के लिए इस्तेमाल किया । माउस दिमाग में सीसीएम घावों P8 पर विश्लेषण किया गया । माइक्रो सीटी, आयोडीन आधारित Lugol के समाधान के लिए मस्तिष्क के ऊतकों में इसके विपरीत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम स्कैन मापदंडों अनुकूलित किया है और ९.५ µm, जो लगभग 25 µm के एक न्यूनतम सुविधा आकार के लिए नेतृत्व के एक voxel आयाम का उपयोग. इस संकल्प को सीसीएम घावों की मात्रा और दुनिया भर में और सही संख्या को मापने के लिए पर्याप्त है, और माउस दिमाग में सीसीएम घावों की उच्च गुणवत्ता वाले 3-डी मानचित्रण प्रदान करते हैं । यह विधि सीसीएम और अन्य मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए आणविक आधार और संभावित उपचारों का अध्ययन करने के लिए स्थापित माउस मॉडलों के मूल्य को बढ़ाता है ।
सीसीएम पतली दीवारों, मानव आबादी1में ०.५% तक की व्यापकता के साथ मस्तिष्क में फैली हुई संवहनी विकृतियों रहे हैं । सीसीएम एक प्रमुख तीन जीन में से एक में समारोह उत्परिवर्तनों के नुकसान के कारण विकार के रूप में विरासत में मिला जा सकता है: CCM1 (उर्फ Krit1), CCM2, और CCM3 (जिसे PDCD10भी कहा जाता है)2,3,4 ,5,6. ये जीन एक सिंगल सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स में मौजूद हैं ।
विभिन्न मॉडलों को मॉडल मानव सीसीएम रोग के लिए विकसित किया गया है और सीसीएम जीन के बहाव मार्ग को समझने के लिए कि सीसीएम7,8,9,10के लिए जिम्मेदार हैं. सबसे मजबूत मॉडल सशर्त सीसीएम जीन में से किसी एक tamoxifen-inducible Cdh5-CreERT2 P1 पर नवजात पिल्ले8,10में से किसी एक को नष्ट करने के लिए है । इन पिल्ले P6 आगे से मस्तिष्क में सीसीएम घावों का विकास और सीसीएम रोगों के इलाज में तंत्र और चिकित्सकीय एजेंटों के लिए खोज में पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल होने की उम्मीद कर रहे हैं.
माउस मस्तिष्क में सीसीएम घाव बोझ मुख्य रूप से प्रोटोकॉल आधारित तरीकों से मापा गया है, एक दृष्टिकोण है कि बहुत समय लेने वाली है और जांचकर्ता पूर्वाग्रह के अधीन10,11,12। एमआरआई आधारित तरीकों वयस्क माउस मॉडल9,13में सीसीएम घावों के बोझ का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, एक अति विशिष्ट छोटे जानवर एमआरआई साधन और लंबे समय तक स्कैन-रात के लिए कई घंटे की अवधि के लिए सीसीएम घावों की पहचान करने के लिए एक संतोषजनक समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, क्या एमआरआई नवजात चूहों में सीसीएम घावों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सूचित नहीं किया गया है और संकल्प संवेदनशीलता सीमा हो सकती है ।
हम हाल ही में छवि के लिए एक माइक्रो सीटी तकनीक विकसित की है और सीसीएम घावों14,15का विश्लेषण । इस उच्च संकल्प, समय और लागत प्रभावी विधि नाटकीय रूप से यंत्रवत और चिकित्सीय अध्ययन में सीसीएम रोग मॉडल के मूल्य को बढ़ावा । इसके विपरीत बढ़ाने, पूरे माउंट धुंधला तरीके सूक्ष्म ऊतकों और माउस भ्रूण16,17के माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । इससे पहले, हमने मस्तिष्क में सीसीएम घावों की माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए एक आज़मियम आधारित दाग का इस्तेमाल किया है14. इस पत्र में, हम एक कम विषाक्त, गैर विनाशकारी, और लागत कुशल एजेंट, एक आयोडीन आधारित है Lugol समाधान का इस्तेमाल किया, माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इसके विपरीत बढ़ाने के लिए । आयोडीन मस्तिष्क भर में फैलाना और18रक्त के लिए एक उच्च समानता कर सकते हैं ।
विस्तृत प्रोटोकॉल एक विपरीत आधारित माइक्रो-सीटी के साथ सीसीएम घावों के इमेजिंग और विश्लेषण के साथ साथ एक नवजात माउस मॉडल में सीसीएम घावों की प्रेरण के लिए यहाँ प्रस्तुत किया गया है । इस माइक्रो-सीटी आधारित विधि सीसीएम घावों की मात्रा की मात्रात्मक वैश्विक माप प्रदान करता है, सही संख्या और माउस मस्तिष्क में सीसीएम घावों के 3-डी स्थान की पहचान, और बहुत लागत और इन जानवरों को phenotype करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है ।
सभी पशु नैतिकता और प्रोटोकॉल को सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला पशु कल्याण समिति और तिआनजिन चिकित्सा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रयोगो?…
सीसीएम एक आम संवहनी कुरूपता है कि अप करने के लिए प्रभावित करता है ०.५% व्यक्तियों की1। सीसीएम छिटपुट या पारिवारिक रूप में हो सकता है । रोगी रोग का निदान अक्सर स्पष्ट नहीं है के रूप में सीसीएम घाव?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की सुविधाओं और सिडनी माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis रिसर्च फैसिलिटी (AMMRF) और सिडनी विश्वविद्यालय में ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis (ACMM) की वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं । ये अध्ययन ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान १६१५५८ और APP1124011 (XZ) द्वारा समर्थित थे.
4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |