Summary
इस प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता रोग की प्रेरण दर्शाता है और इसके विपरीत का उपयोग करता है बढ़ाया माइक्रो गणना टोमोग्राफी घाव बोझ को मापने के लिए । इस विधि की स्थापना की माउस मॉडल के मूल्य को बढ़ाता है आणविक आधार और मस्तिष्कीय गुफा कुरूपता और अंय मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए संभावित उपचार का अध्ययन ।
Abstract
CCM1 (उर्फ KRIT1), CCM2, या CCM3 (उर्फ PDCD10) जीन में उत्परिवर्तनों मानव में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता (सीसीएम) के कारण । प्रसव पशुओं में सीसीएम जीन के tamoxifen प्रेरित विलोपन द्वारा सीसीएम रोग के माउस मॉडलों की स्थापना की गई है । इन माउस मॉडलों को आणविक तंत्र और सीसीएम रोग के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं । घाव के बोझ और प्रगति का आकलन करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि इन पशु मॉडलों के पूर्ण मूल्य का दोहन करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक माउस मॉडल में सीसीएम रोग की प्रेरण प्रदर्शन और इसके विपरीत का उपयोग बढ़ाया एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) विधि माउस दिमाग में सीसीएम घाव बोझ को मापने के लिए । प्रसव day 1 (P1) पर हमने 4-hydroxytamoxifen (4HT) को recombinase-Cdh5 CreErt2 के transgene floxed से सट कर Cre एलील गतिविधि को एक्टिवेट करने के लिए इस्तेमाल किया । माउस दिमाग में सीसीएम घावों P8 पर विश्लेषण किया गया । माइक्रो सीटी, आयोडीन आधारित Lugol के समाधान के लिए मस्तिष्क के ऊतकों में इसके विपरीत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम स्कैन मापदंडों अनुकूलित किया है और ९.५ µm, जो लगभग 25 µm के एक न्यूनतम सुविधा आकार के लिए नेतृत्व के एक voxel आयाम का उपयोग. इस संकल्प को सीसीएम घावों की मात्रा और दुनिया भर में और सही संख्या को मापने के लिए पर्याप्त है, और माउस दिमाग में सीसीएम घावों की उच्च गुणवत्ता वाले 3-डी मानचित्रण प्रदान करते हैं । यह विधि सीसीएम और अन्य मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए आणविक आधार और संभावित उपचारों का अध्ययन करने के लिए स्थापित माउस मॉडलों के मूल्य को बढ़ाता है ।
Introduction
सीसीएम पतली दीवारों, मानव आबादी1में ०.५% तक की व्यापकता के साथ मस्तिष्क में फैली हुई संवहनी विकृतियों रहे हैं । सीसीएम एक प्रमुख तीन जीन में से एक में समारोह उत्परिवर्तनों के नुकसान के कारण विकार के रूप में विरासत में मिला जा सकता है: CCM1 (उर्फ Krit1), CCM2, और CCM3 (जिसे PDCD10भी कहा जाता है)2,3,4 ,5,6. ये जीन एक सिंगल सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स में मौजूद हैं ।
विभिन्न मॉडलों को मॉडल मानव सीसीएम रोग के लिए विकसित किया गया है और सीसीएम जीन के बहाव मार्ग को समझने के लिए कि सीसीएम7,8,9,10के लिए जिम्मेदार हैं. सबसे मजबूत मॉडल सशर्त सीसीएम जीन में से किसी एक tamoxifen-inducible Cdh5-CreERT2 P1 पर नवजात पिल्ले8,10में से किसी एक को नष्ट करने के लिए है । इन पिल्ले P6 आगे से मस्तिष्क में सीसीएम घावों का विकास और सीसीएम रोगों के इलाज में तंत्र और चिकित्सकीय एजेंटों के लिए खोज में पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल होने की उम्मीद कर रहे हैं.
माउस मस्तिष्क में सीसीएम घाव बोझ मुख्य रूप से प्रोटोकॉल आधारित तरीकों से मापा गया है, एक दृष्टिकोण है कि बहुत समय लेने वाली है और जांचकर्ता पूर्वाग्रह के अधीन10,11,12। एमआरआई आधारित तरीकों वयस्क माउस मॉडल9,13में सीसीएम घावों के बोझ का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, एक अति विशिष्ट छोटे जानवर एमआरआई साधन और लंबे समय तक स्कैन-रात के लिए कई घंटे की अवधि के लिए सीसीएम घावों की पहचान करने के लिए एक संतोषजनक समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, क्या एमआरआई नवजात चूहों में सीसीएम घावों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सूचित नहीं किया गया है और संकल्प संवेदनशीलता सीमा हो सकती है ।
हम हाल ही में छवि के लिए एक माइक्रो सीटी तकनीक विकसित की है और सीसीएम घावों14,15का विश्लेषण । इस उच्च संकल्प, समय और लागत प्रभावी विधि नाटकीय रूप से यंत्रवत और चिकित्सीय अध्ययन में सीसीएम रोग मॉडल के मूल्य को बढ़ावा । इसके विपरीत बढ़ाने, पूरे माउंट धुंधला तरीके सूक्ष्म ऊतकों और माउस भ्रूण16,17के माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । इससे पहले, हमने मस्तिष्क में सीसीएम घावों की माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए एक आज़मियम आधारित दाग का इस्तेमाल किया है14. इस पत्र में, हम एक कम विषाक्त, गैर विनाशकारी, और लागत कुशल एजेंट, एक आयोडीन आधारित है Lugol समाधान का इस्तेमाल किया, माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इसके विपरीत बढ़ाने के लिए । आयोडीन मस्तिष्क भर में फैलाना और18रक्त के लिए एक उच्च समानता कर सकते हैं ।
विस्तृत प्रोटोकॉल एक विपरीत आधारित माइक्रो-सीटी के साथ सीसीएम घावों के इमेजिंग और विश्लेषण के साथ साथ एक नवजात माउस मॉडल में सीसीएम घावों की प्रेरण के लिए यहाँ प्रस्तुत किया गया है । इस माइक्रो-सीटी आधारित विधि सीसीएम घावों की मात्रा की मात्रात्मक वैश्विक माप प्रदान करता है, सही संख्या और माउस मस्तिष्क में सीसीएम घावों के 3-डी स्थान की पहचान, और बहुत लागत और इन जानवरों को phenotype करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है ।
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Protocol
- पार Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl चूहों with Ccm2 fl/fl & #160; Cdh5-CreErt2 के साथ कूड़े उत्पन्न करने के लिए; Ccm2 fl/fl & #160;( Ccm2 iECKO ) पिल्ले और littermate नियंत्रण ( Ccm2 fl/fl ). Cdh5-CreErt2 and Ccm2 fl/fl पशुओं को पहले बताया जा चुका है < सुप class = "xref" > 19 .
- भंग 4HT में १००% इथेनॉल और स्टोर में-८० & #176; ग 30 & #181 के aliquots में; L (4HT एकाग्रता: 10 mg/ उपयोग के दिन, पतला aliquoted 4HT में मकई का तेल (०.५ मिलीग्राम/
- Intragastrically इंजेक्षन ५० & #181; 4HT (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के एल P1 पर नवजात पिल्ले को प्रयोगात्मक सीसीएम घावों एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करने के लिए प्रेरित ।
- Euthanize नवजात पिल्ले P8 पर कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation. के माध्यम से
- माउस दिल के निलय में एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में पंजाब में 2% paraformaldehyde के 3 मिलीलीटर के साथ एक 29 गेज सुई डालने के द्वारा इंट्रा कार्डियक छिड़काव प्रदर्शन.
सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें. - एक कैंची का उपयोग कर शरीर से सिर अलग । एक कैंची का उपयोग कर सिर से सभी त्वचा को हटा दें और पूरे मस्तिष्क टुकड़े करने के लिए संदंश का उपयोग कर खोपड़ी छील ।
- 7.82 एक्स आवर्धन पर stereomicroscope के साथ मस्तिष्क की छवियों को ले, 1x लाभ, ०.६ गामा, और 20 एमएस जोखिम समय.
- रातोंरात हल में 4% paraformaldehyde के साथ विच्छेदित दिमाग को ठीक ।
सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें.
अगले दिन पर - , एक संदंश का उपयोग कर अलग hindbrains और पंजाब के समाधान के साथ धो लो ।
- hindbrains Lugol & #39; s आयोडीन समाधान के लिए ४८ h.
- के बाद, संक्षेप में हवा सूखी hindbrains को हटाने के लिए अतिरिक्त Lugol & #39; एस आयोडीन समाधान ।
- पैक द Lugol & #39; s आयोडीन सना hindbrains में ०.६५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और सील पूरी तरह से प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ ऊतक सिकुड़ने से बचने के लिए (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ अ ).
- जगह microcentrifuge ट्यूबों में 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों स्पंज के साथ उन्हें स्कैन के दौरान ले जाने से रोकने के लिए (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ बी ).
- खड़ी माउंट माइक्रो सीटी सिस्टम में एक एल्यूमीनियम धारक पर एक ट्यूब में पैक hindbrain ।
- ५४० अनुमानों और 2 एस ५० केवी और 10 डब्ल्यू के स्रोत शर्तों के साथ tomographic डेटासेट (छवि संकल्प ९.५ & #956; m/पिक्सेल) प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग पैरामीटर सेट करें ।
- रेडियोग्राफ स्कैन से स्वचालित रूप से खंगाला जाता है हार्डवेयर-आधारित प्रोजेक्शन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर माइक्रो-सीटी प्रणाली द्वारा आपूर्ति की, 16-bit अक्षीय स्लाइस की एक छवि श्रृंखला का निर्माण (& #34; TXM & #34; फ़ाइल).
- 3-डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खंगाला इमेज फाइल (& #34; TXM & #34; फाइल) को खोलें और & #34 का उपयोग कर मस्तिष्क की कल्पना करें; वॉल्यूम रेंडरिंग & #34; फ़ंक्शन.
- रूपांतरित hindbrain को वांछित अभिविन्यास का प्रयोग & #34; बाउंडिंग बॉक्स & #34; र & #34; कतरना विमान & #34; कामे.
- विस्तारित मोड में परिवर्तित छवि resample और voxel आकार रक्षित करें ।
- create & #34; नया लेबल फ़ील्ड संपादित करें & #34; रूपांतरित छवि (४.३) पर और greyscale तीव्रता का उपयोग करते हुए केवल hindbrain पर प्रकाश डाला. हाइलाइट किए गए क्षेत्रों को
- जोड़ें और चलाएं & #34; लेबल विश्लेषण & #34; पूरे hindbrain ( यानी , कुल मात्रा और क्षेत्रफल) की माप प्राप्त करने के लिए. किसी Excel फ़ाइल में माप निर्यात करें ।
- टयूब hindbrain का उपयोग कर & #34; isosurface प्रतिपादन & #34; function.
- बनाएं & #34; नया लेबल फ़ील्ड संपादित करें & #34; रूपांतरित छवि पर और greyscale तीव्रता का उपयोग कर घावों के साथ हाइलाइट क्षेत्र. हाइलाइट किए गए क्षेत्रों को
- जोड़ें और चलाएँ & #34; लेबल & #34; विश्लेषण hindbrain ( यानी , कुल मात्रा और क्षेत्र) के भीतर घावों की माप प्राप्त करने के लिए. किसी Excel फ़ाइल में माप निर्यात करें ।
- का उपयोग करते हुए घावों की कल्पना करना & #34; उत्पन्न सतह & #34; र & #34; भूतले दृ & #34; कामे.
- स्नैपशॉट वांछित झुकाव पर hindbrain की छवियों या घावों के 3 डी दृश्य के लिए एक फिल्म उत्पंन करते हैं ।
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Representative Results
P1 पर 4HT का एक इंजेक्शन सेरिबैलम में सीसीएम घावों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था । Lugol आयोडीन के विपरीत माइक्रो सीटी पर्याप्त सीसीएम घावों का पता लगाया है और इसकी मात्रा और संख्या को बढ़ाता सकता है । अनुकूलित माइक्रो-सीटी का उपयोग, हम Ccm2iECKO चूहों के hindbrains में सीसीएम घावों की छवि । स्कैन एक्स-रे छवियों माउस मस्तिष्क के 3-डी छवियों का उत्पादन करने के लिए खंगाला गया था, जो विभिन्न गहराई और झुकाव पर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में पूरे घावों के दृश्य की अनुमति दी, और संरचना और मस्तिष्क में घावों के 3-डी स्थान का आकलन. महत्वपूर्ण रूप से, इस छवि डेटासेट भी घाव आकार और घावों की संख्या के कुशल और सटीक ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्रा 1 Ccm2iECKO (बी) के सेरिबैलम में सीसीएम घावों के सफल प्रेरण से पता चलता है लेकिन littermate नियंत्रण (Ccm2fl/fl) (एक) में P8 पर नहीं.
चित्रा 2 माइक्रो-सीटी स्कैन (ए-बी) के लिए एक पैक नमूना से पता चलता है, और प्रतिनिधि माइक्रो सीटी नियंत्रण के स्कैन (Ccm2fl/fl) (सी) और Ccm2 से खंगाला छवियों iECKO (डी-ई) । चित्र 2 E' Ccm2iECKOमें चिह्नित घावों को दिखाता है ।
चित्रा 3 घावों (एक-बी) के साथ एक Ccm2iECKO मस्तिष्क के एक गाया 3-डी छवि दिखाता है । सन्निकट तालिका लेबल किए गए व्यक्तिगत घावों के मात्रात्मक आउटपुट का एक उदाहरण दिखाता है.
चित्र 1 : नवजात चूहे में सीसीएम घावों की प्रेरण । प्रसव दिवस 8 पर Ccm2fl/fl (A) और Ccm2iECKO (B) दिमाग की Macroscopic छवियां । स्केल बार्स (सफेद), 5 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 2 : नमूना तैयारी और 2 डी छवियों को खंगाला । एक microcentrifuge ट्यूब (ए) और 5 एमएल ट्यूब (बी) में पैक नमूना । हरा तीर नमूना दिखाता है । Ccm2fl/fl (सी) और Ccm2iECKO (डी-ई) दिमाग की प्रतिनिधि छवियां । (E ') Ccm2iECKO ब्रेन में घाव चिह्नित । स्केल बार्स (सफेद), 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3 : रेंडर किए गए 3-डी छवियां. घावों (A) और घावों के साथ Ccm2iECKO ब्रेन की रेंडर की गई छवि (ख) । घावों लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं । दाईं ओर तालिका व्यक्तिगत रूप से चिह्नित घावों के गुणात्मक उत्पादन का एक उदाहरण दिखाता है । स्केल बार्स (सफेद), 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
सीसीएम एक आम संवहनी कुरूपता है कि अप करने के लिए प्रभावित करता है ०.५% व्यक्तियों की1। सीसीएम छिटपुट या पारिवारिक रूप में हो सकता है । रोगी रोग का निदान अक्सर स्पष्ट नहीं है के रूप में सीसीएम घावों स्ट्रोक और अन्य स्नायविक परिणाम पैदा करने के लिए अप्रत्याशित रूप से टूटना कर सकते हैं । वर्तमान में, केवल उपचार विकल्प शल्य चिकित्सा घावों को दूर करने के लिए है, जो उच्च जोखिम के साथ कर रहे हैं ।
मानव सीसीएम शर्तों हाल ही में पशु मॉडल7,8,9,10में reproduced किया गया है । ये मॉडल सीसीएम डिजीज में शामिल तंत्र की जांच के लिए अमूल्य औजार उपलब्ध कराते हैं । एक सटीक, कुशल, और मात्रात्मक विश्लेषण विधि इन मॉडलों का पूरा मूल्य का दोहन करने में मदद मिलेगी ।
हम हाल ही में एक विषम एजेंट14के रूप में आज़मियम tetraoxide का उपयोग माउस मॉडल में छवि सीसीएम घावों के लिए एक माइक्रो-सीटी विधि विकसित की है । वर्तमान अध्ययन में, हम बाद में घावों का पता लगाने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के विपरीत बढ़ाने के लिए Lugol के आयोडीन समाधान का उपयोग किया है । Lugol के आयोडीन समाधान आज़मियम tetraoxide की तुलना में कम विषाक्त, गैर विनाशकारी, और सस्ता है । इसलिए, नमूनों अंय प्रयोजनों के लिए reused किया जा सकता है, जैसे प्रोटोकॉल के बाद Lugol आयोडीन समाधान दूर धोया जाता है ।
हमारे माइक्रो-सीटी विधि माउस मस्तिष्क में सीसीएम घावों का पता लगाने के लिए पर्याप्त छवि गुणवत्ता का उत्पादन कर सकता है । नमूना तैयारी सरल है और अत्यधिक विशेष तकनीक की आवश्यकता नहीं है । इस विधि के लगभग एक घंटे के एक स्कैन समय के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन अनुमानों प्रदान कर सकते हैं । माइक्रो-सीटी स्कैन और 3-डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर से datasets के संयोजन मस्तिष्क में सीसीएम घावों का एक 3 डी वैश्विक दृश्य उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. मस्तिष्क शरीर रचना के सापेक्ष घावों की मात्रात्मक और गुणात्मक प्रतिनिधित्व आसानी से प्राप्त होता है । प्रोटोकॉल-आधारित 3-डी पुनर्निर्माण की तुलना में, हमारे विधि अत्यधिक समय है और लागत प्रभावी और अधिक सटीक 3-डी अभ्यावेदन का उत्पादन ।
हालांकि इस पर भी सीमाएं और अहम कदम उठाए जाने पर विचार किया जा रहा है । सबसे पहले, विधि एक माइक्रो सीटी प्रणाली है, जो अत्यधिक विशिष्ट उपकरण है और आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता है । दूसरे, नवजात माउस मस्तिष्क विदारक काफी कोमलता और मस्तिष्क के ऊतकों के आकार के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यह मस्तिष्क में सीसीएम घावों के सटीक माप और दृश्य प्राप्त करने के क्रम में विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । अंत में, माइक्रो-सीटी स्कैन के लिए नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है । Lugol के आयोडीन सना हुआ दिमाग पूरी तरह से पैक किया जाना चाहिए वाष्पीकरण के कारण ऊतक सिकुड़न से बचने के लिए । इसके अलावा, नमूनों को माइक्रो-सीटी स्कैन के दौरान सुरक्षित रूप से रखा जाना चाहिए । स्कैन के दौरान किसी भी आंदोलन और इसलिए ठहराव और दृश्य स्कैन की गुणवत्ता में परिवर्तन होगा ।
हम केवल निश्चित नवजात माउस दिमाग में हमारे विधि लागू किया है । हालांकि, इस विधि की क्षमता अंय विभिंन नमूनों को शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अंय संवहनी कुरूपता अनुसंधान के लिए एक रोमांचक और उपंयास उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों की सुविधाओं और सिडनी माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis रिसर्च फैसिलिटी (AMMRF) और सिडनी विश्वविद्यालय में ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis (ACMM) की वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं । ये अध्ययन ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान १६१५५८ और APP1124011 (XZ) द्वारा समर्थित थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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