誘導およびマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形のマイクロ CT イメージング
Summary
このプロトコルはマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形病の誘導を示し、使用造影病変の負担を測定するマイクロ コンピューター断層撮影。このメソッドは、分子基盤と脳海綿静脈奇形の潜在的な治療とその他の脳血管疾患を勉強する確立されたマウス モデルの価値を高めます。
Abstract
突然変異、 CCM1 (別名 KRIT1)、CCM2、またはCCM3 (別名 PDCD10)遺伝子は人間の脳海綿静脈奇形 (CCM) を引き起こします。CCM 病気のマウスモデルはCcm遺伝子は生後のタモキシフェンによる削除によって設けられています。これらのマウスのモデル分子機構と CCM の病気のための治療上のアプローチを調査するための非常に貴重なツールを提供します。これらの動物モデルの完全な値を活用する病変負担と進行を評価する正確な定量的な方法が欠かせません。ここでは、CCM 病マウスモデルでの誘導を示す、コントラストの使用強化 x 線マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) マウス脳におけるメジャー CCM 病変負担します。生後日 1 (P1)、 Ccm2の floxed の対立遺伝子を切断するのに Cdh5 CreErt2 遺伝子から Cre リコンビナーゼ アクティビティを有効にするのに 4-hydroxytamoxifen (第 4 はレディース) を使用しました。マウス脳における CCM の病変は、P8 で分析しました。マイクロ CT によるヨウ素・ ルゴール液脳組織のコントラストを高めるため使用しています。スキャン パラメーターを最適化し、約 25 μ m の最小機能サイズにつながる 9.5 μ m のボクセル ディメンションを利用しました。この解像度で世界的にかつ正確に、CCM 性病変の容積と数を測定し、高品質マウス脳の CCM 病変の 3次元マッピングを提供するのに十分です。このメソッドは、CCM と他の脳血管疾患の分子基盤と潜在的な療法を研究するため設立されたマウス モデルの価値を高めます。
Introduction
CCM は壁が薄く、人間の人口1で最大 0.5% の有病率と脳の血管の奇形を拡張します。CCM は、3 つの遺伝子の 1 つの機能喪失変異による支配的な障害として継承できる: CCM1 (別名Krit1)、 CCM2、およびCCM3 ( PDCD10とも呼ばれる)2,3,4 ,5,6。これらの遺伝子は、単一の複雑な信号に存在。
モデル CCM 疾患、CCM7,8,9,10は、CCM の遺伝子の下流の経路を理解し、様々 なモデルが開発されています。最も堅牢なモデルは、新生の子犬8,10P1 をタモキシフェン誘導Cdh5 CreERT2とCcmの遺伝子のいずれかを条件付きで削除することです。これらの子犬は、CCM 以降の P6 から脳の病変を開発し、検索メカニズムのための前臨床試験および CCM 病気の治療に治療薬のための理想的なモデルをする予定です。
マウス脳における CCM 病変負担を組織ベースのメソッドは、非常に時間がかかるアプローチによって主に測定し、捜査対象となるバイアス10、11,12。MRI 法は、成体マウス モデル9,13CCM 病変負担を評価するために使用されています。ただし、専門性の高い小さな動物 MRI 計測器と一夜にして数時間の長いスキャン時間は、CCM の病変を識別するための満足のいく解決を達成するために必要です。また、新生仔マウスの CCM の病変を検出するための MRI の使用かどうかは報告されていない、解像度は感度を制限可能性があります。
最近、画像、CCM 病変14,15を分析してマイクロ CT 技術を開発しました。この高解像度、時間とコスト効果の高い方法劇的に解明と治療研究で CCM 病モデルの値をブーストしました。コントラストを向上させる、全体のマウント染色法は、軟部組織、マウス胚16,17のマイクロ CT イメージングのために使用されています。以前は、染色、オスミウム ベース マイクロ CT イメージング脳14CCM 病変のコントラストを高めるために使用している我々。本稿で我々 は毒性の低い、非破壊、使用、コスト効率の高い試薬、ヨウ素によるマイクロ CT 画像のコントラストを高めるため、ルゴール液。ヨウ素脳内に拡散することができますで、血液18の親和性が高い。
詳しいプロトコルはイメージングと共に新生児マウス モデルにおける CCM 斑の誘導とコントラストに基づくマイクロ CT CCM 病変の解析の紹介します。このマイクロ CT 法 CCM 性病変の容積測定の定量的なグローバルの提供数とマウス脳における CCM 病変の 3次元位置を正確に識別、コストの大幅削減し、これらの動物の表現に必要な時間。
Protocol
Representative Results
Discussion
CCM は、個人1の 0.5% まで影響を与える一般的な血管の奇形です。CCM は、散発的なまたは家族性の形で発生します。患者の予後の CCM 病変がストロークやその他の神経学的な結果を引き起こすことが突然破裂、しばしば明らかではありません。現在、唯一の治療法の選択肢は外科的伴われる高リスク病変を取り除くことです。
人間の CCM 条件で再現された?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、施設、顕微鏡 & シドニー大学で微量分析 (ACMM) のシドニー顕微鏡 & 微量分析研究施設 (AMMRF) およびオーストラリアの中心の科学的な技術的な支援を認めます。これらの研究に支えられたオーストラリアの国民の健康と医療研究評議会 (NHMRC) プロジェクトを与える 161558 と APP1124011 (XZ)。
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
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