Summary
Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.
Abstract
Recente studies van de genoom-brede vereniging gericht op atriale fibrillatie (AF) hebben een sterke associatie tussen het genotype en fenotype van de elektrofysiologische in de atria aangegeven. Dat stimuleert ons om te gebruiken van een genetisch gemanipuleerde muismodel om te verhelderen van het mechanisme van AF. Het is echter moeilijk te evalueren van de elektrofysiologische eigenschappen in lymfkliertest atria vanwege hun kleine omvang. Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in Langendorff geperfundeerd lymfkliertest harten. De optische mapping systeem wordt gemonteerd met dubbele high-speed aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor camera's en objectieven van hoge vergroting, om te ontdekken de fluorescentie van een spanning-gevoelige kleurstof en Ca2 + indicator. Om zich te concentreren op de beoordeling van lymfkliertest atria, wordt optische toewijzing uitgevoerd met een oppervlakte van 2 mm × 2 mm of 10 mm x 10 mm, met een 100 × 100 resolutie (20 µm/pixel of 100 µm/pixel) en een sampling rate van maximaal 10 kHz (0.1 ms) op maximum. Een 1-Franse grootte quadripolar elektrode pacing katheter wordt geplaatst in de juiste atrium door de superieure vena cava vermijden van mechanische schade aan het atrium en pacing stimulatie wordt beschikbaar gesteld via de katheter. Een elektrofysiologische studie wordt uitgevoerd met geprogrammeerde stimulatie met inbegrip van constante pacing, burst pacing, en tot de drievoudige extrastimuli ijsberen. Onder een spontane of pacing ritme, boekte de optische toewijzing de actiepotentiaal duur, activering kaart geleiding snelheid en Ca2 + individueel in de linker- en atria van voorbijgaande aard. De geprogrammeerde stimulatie bepaalt daarnaast ook de inducibility van atriale tachyarrhythmias. Precieze activering toewijzing wordt uitgevoerd om de verspreiding van de excitatie in het atrium tijdens een geïnduceerde atriale tachyarrhythmia vast te stellen. Optische toewijzing met een gespecialiseerde instelling in staat stelt een grondige elektrofysiologische evaluatie van het atrium in lymfkliertest pathologische modellen.
Introduction
Het hart bestaat uit 4 kamers in zoogdieren. De bovenste twee holten zijn atria, en de lagere zijn ventrikels. Ventrikels werken als een pomp uitwerpen van bloed naar de systemische of pulmonaire circulatie. Atria ontvangen bloed uit de systemische of pulmonaire aders als resultaat geven en helpen bij het transport van bloed in de ventrikels te verkrijgen van een efficiënte cardiale pomp functie. Vanuit een elektrofysiologische aspect is de belangrijke functie van de atria om het hartritme te reguleren. De elektrische signalen zijn afkomstig uit de sinusknoop die zich bevindt op het kruispunt tussen de superieure vena cava (SVC) en de juiste atrium (RA), dan doorgeven aan de RA en de linkerboezem (LA), en voeren naar de ventrikel via de atrioventriculaire knoop en zijne-Purkinje geleidingssysteem.
Hartritmestoornissen, die hart ritme stoornissen zijn, worden ingedeeld in atriale en ventriculaire volgens hun afkomst. Atriale fibrillatie (AF) is de meest voorkomende duurzame vorm van een aritmie, gekenmerkt door een willekeurige en snelle excitatie van de atria. Recente genetische analyses en studies van het genoom-brede vereniging (GWAS) hebben aangetoond dat de associatie tussen AF en genetische mutaties of monopolymorphisms1,,2,,3,4. Deze bevindingen wijzen erop dat af is ten minste gedeeltelijk gekoppeld aan een genetische oorzaak. Daarom is het van cruciaal belang voor het evalueren van het genotype-fenotype-interacties in de atria met behulp van een genetisch gemanipuleerde diermodel. Het is algemeen aanvaard dat de muis de meest gevestigde zoogdier voor genetische modificatie is.
De optische mapping-techniek is ontwikkeld om te evalueren van de excitatie van het hartweefsel. De waarneming van het lymfkliertest atrium door optische toewijzing wordt echter belemmerd door de relatief kleine omvang. Wij proberen te verwezenlijken van een gedetailleerde beoordeling van het lymfkliertest atrium met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Protocol
Dit dier experiment werd goedgekeurd en uitgevoerd onder de regulering van de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Tokyo medische en tandheelkundige University.
1. voorbereiding
- Stamoplossingen
- Los van de spanning-gevoelige kleurstoffen (di-4-ANEPPS en RH237) en Ca2 + indicator (Rhod-2 ben) met 100% dimethylsulfoxide (DMSO) te maken van stamoplossingen met concentraties van 6 mM, 10 mM en 10 mM, respectievelijk.
- Los de excitatie-contractie (E-C) uncoupler, blebbistatin, met 90% DMSO te maken van een stamoplossing van 50 mM.
- Aliquoot de voorraadoplossingen in een 0,2 mL PCR buis in een donkere kamer en vervangen van de lucht in de voorraad buis met behulp van stikstofgas om te voorkomen dat oxidatie.
- Wikkel de voorraad buizen in aluminiumfolie individueel voor bescherming tegen het licht, en sla deze op-20 ˚C.
- Werkoplossingen
- Bereiden 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + (137 mM NaCl, KCl, 8.0 mM nb2HPO4en 1,5 mM KH2PO4, pH van de 2,7 mM 7,40 aangepast door NaOH)
- 1 L van de Tyrode oplossing (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0.53 mM MgCl2, 0.33 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glucose, en 5.0 mM HEPES, pH 7,40 aangepast door NaOH) voor te bereiden.
- Tyrode de oplossing met een fles van de bovenste filter van 0,22 µm filter en het goed door bubble beluchting met behulp van een lucht-steen aangesloten op een gasfles van O2 beluchten.
2. optische toewijzing in harten Langendorff-geperfundeerd
- Monteren van de optische mapping systeem met behulp van twee aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) camera's (Figuur 1a& b)
- Het monteren van de CMOS-camera's, balk splitter, objectieven, lens revolver, lichtbron, dichroïde spiegels, filters en andere onderdelen in de optische mapping systeem zoals weergegeven in Figuur 1ad ' hôtes.
- Selecteer de vergroting door het veranderen van het objectief in een torentje, uitgerust met verschillende vergrotingen (1.6 X en 5 X).
Opmerking: De grootte van de CMOS-sensor is 10 mm × 10 mm bedragen, met een resolutie van 100 × 100, wat, met 5 X-objectief betekent, dit systeem biedt een ruimtelijke resolutie van 20 µm. - Instellen van het licht van de excitatie met behulp van een licht afgevende diodes (LED) lamp met een golflengte van centrum van 530 nm, doorgegeven door middel van een band-pass filter (520/35 nm), en weergegeven met een dichroïde spiegel (560 nm).
- Record de emissie signaal gedeeld door een splitter (665 nm), in welke instelling camera 1 met een lange pass filter (697/75 nm) detecteert de fluorescentie met een membraan spanning-gevoelige kleurstof (di 4-ANEPPS of RH237), en een camera 2 met een band-pass filter (572/28 nm) detecteert de signaal van de Ca2 + indicator (Rhod2-AM).
- Monteren van het circuit van de perfusie Langendorff
- Buizen van PVC (polyvinylchloride) hechten aan een peristaltische pomp.
- Zet de inname kant van de PVC-buis in Tyrode de oplossing belucht met 100% O2 , zoals vermeld in stap 1.2.3.
- Verbind de kant van de geen kwijting van de PVC-buis met een handgemaakte lucht val, dan regelen de 5 µm filter, drieweg kranen, drukopnemer, Verwarming glas spoel en afgestompte naald 21-gauge (de breinaalden is veranderlijk volgens de grootte van de aorta) achter elkaar , met behulp van andere PVC-buizen.
- Vul het perfusie-circuit met Tyrode de oplossing voor het vermijden van eventuele luchtbellen in het circuit, en de stroom te stoppen totdat het hart is aangesloten op het circuit.
- Heparinization en anesthesie
- Injecteren unfractionated heparine (200 IU, ongeacht het lichaamsgewicht) intraperitoneally in een muis met een 25-meter naald en de 1 mL spuit.
- Anesthetize de muis door een intraperitoneale injectie van pentobarbital (65mg/kg) 10 minuten na de injectie met heparine.
- Cannulation en perfusie
- Plaats de muis in de liggende positie. Bevestigen dieren is verdoofd door gebrek aan respons tot teen snuifje. Open de buikwand onder het procesniveau van de xiphoid met behulp van schaar. Maak een dwarse snede in het middenrif, gesneden van beide zijden van de ribben in de mediale axillaire lijn zonder schade aan het hart en spiegelen de anterior borstwand naar boven. Verder gebogen pincet achter het hart, en houd de aflopende aorta, slokdarm en vena cava inferior. Vervolgens accijnzen het hart met een schaar snel samen met de aangrenzende vaartuigen en weefsel, zoals de aorta, longen, luchtpijp, slokdarm, vetweefsel en zwezerik.
- Het hart met 10 mL ijskoud PBS wassen in een petrischaal en de aangrenzende weefsel te verwijderen.
- Het puntje van de 21-gauge afgestompte naald verbonden met het perfusie-circuit in de oplopende aorta introduceren, en repareren met draad onder een stereomicroscoop.
- Beginnen te perfuse het hart voor 10 min met de Tyrode oplossing belucht met 100% O2.
- Toezicht op de perfusie druk continu met de drukopnemer aangesloten op de versterker en recorder.
- Houd de perfusie druk tussen 80-100 mmHg (meestal overeenkomend met 2-5 mL/min. voor het debiet) tijdens alle volgende stappen.
- Tijdens de eerste perfusie (stap 2.4.4.), het invoegen van de dun polyethyleen (PE) buis (buitendiameter: 0.8 mm) in het Permanent Veterinair Comité, en op te lossen met een draad. Plaats vervolgens het hart in de verwarmde glazen zaal (Figuur 1b& c).
- Een 24-gauge inwonende naald punctie (buitendiameter: 0,7 mm) in de linker ventriculaire (LV) holte via de ventriculaire apex voor het voorkomen van schade aan het atrium en verwijderen van de innerlijke naald verlaten de externe canule in de LV.
- Invoering van een katheter elektrode 1-Franse grootte aangepaste gemaakt door de PE buis in het Permanent Veterinair Comité voor het uitvoeren van elektrische stimulatie in de RA. Indien nodig, verder de katheter in de rechter ventrikel (RV) voor ventriculaire ijsberen.
- Plaats een pin-elektrode in de ventriculaire apex continu opnemen de bipolaire elektrocardiogrammen (ECG) tussen de pin elektrode en cannulation de naald in de oplopende aorta (Figuur 1 c).
- Blijven volgen van de druk van het ECG en perfusie tijdens de hele studie.
- Uitschakelen van het licht, en het volgende experiment uit te voeren in een donkere kamer.
- Ga naar stap 2.5. voor een enkele opname van de membraan spanning of 2.6. voor een dubbele opname van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande aard.
- Kleuring voor een enkele opname van de membraan-spanning
- Het handhaven van de oplossing van de perfusie tijdens deze kleuring protocol voor een enkele opname van de membraan spanning op 37 ˚C verwarmd.
- Verdun 8.3 µL van de stockoplossing di-4-ANEPPS (6 mM) met 10 mL van de Tyrode oplossing (de eindconcentratie is 5 µM).
- Infundeer het totale volume (10 mL) van de verdunde oplossing van di-4-ANEPPS naar het hart via de route van de perfusie voor 2-5 min, gevolgd door een wassen met Tyrode de oplossing gedurende 5 minuten.
- Verdun 5 µL van de stockoplossing van de blebbistatin (50 mM) met 1mL van de Tyrode oplossing (de eindconcentratie is 250 µM).
- Het beheren van het totale bedrag van de verdunde blebbistatin oplossing via de perfusie-route.
- Sla stap 2.6 en ga naar stap 2.7 voor wassen.
- Kleuring voor een dubbele opname van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande aard
- Bewaar de Tyrode de oplossing op kamertemperatuur.
Opmerking: Deze eerste instelling van de temperatuur verschilt van die in de kleuring voor een enkele opname van de membraan spanning (stap 2.5.). - Het beheren van de blebbistatin op dezelfde manier als in stap 2.5.4 en 2.5.5.
- Mix 3 µL van Rhod2AM stockoplossing (10 mM) en 30 µL van polyoxyethyleen-polyoxypropylene blokcopolymeren F-127 (20% in DMSO), waarna het mengsel met 10 mL Tyrode de oplossing verdund.
- Het totale bedrag van de Rhod2AM oplossing (3 µM) laden via dezelfde route als de blebbistatin meer dan 2-5 min.
- 7 µL van RH237 stockoplossing (10 mM) met 10 mL Tyrode de oplossing verdund.
- Beheren van het totale bedrag van de verdunde oplossing van RH237 (7 µM) meer dan 2-5 min.
- Na voltooiing van de hierboven beschreven procedure, start om te Verwarm de Tyrode de oplossing op 37 ˚C.
- Bewaar de Tyrode de oplossing op kamertemperatuur.
- Wassen
- Houd de temperatuur van de Tyrode oplossing op 37 ˚C in het volgende experiment.
- Perfuse het hart met Tyrode de oplossing voor minstens 5 min te wassen de buitensporige kleurstoffen.
Opmerking: Er is geen noodzaak om het debiet tijdens deze wassing uit stap (zie stap 2.4.6.) - Bevestig de verdwijning van elke beweging artefact te wijten aan de contracties, en de homogene kleuring in het perfused hart.
- Bemonsterings- en data-analyse
- Zet de dekking glas (25 mm × 60 mm) op het perfused hart zorgvuldig, als u wilt afvlakken van de atriale oppervlak zonder teveel mechanische stress, en voorkomen dat beweging artefact van trillingen van de oplossing. Bevestigen dat het atrium aan het glas cover op de juiste manier hecht.
- Record de fluorescentie door de CMOS-camera's met een sampling rate maximaal 0,1 ms voor di 4-ANEPPS en 1 ms voor de RH237 en Rhod2AM vlekken.
- Het analyseren van de verkregen opnames met behulp van de software analyseren, volgens de instructies van de fabrikant voor de feitelijke werking van de software.
- Maak een plattegrond van de activering en de film na het uitpakken van de regio van belang, drift verwijdering, temporele filtering en 3 X 3 weggooien van5.
3. elektrofysiologische studie
- Instellen van de pacing elektroden en stimulator
- Bevestigen van het contact van de tip van de op maat gemaakte pacing elektrode in de RA aan het weefsel voor stimulatie (zie stap 2.4.9.).
- Alle pacing prikkels van de pacing katheter aangesloten op de programmeerbare stimulator leveren.
- Bepaling van de pacing drempel
- Set de pacing interval tussen 100 en 150 ms (pulsbreedte van 0,4 ms), het vermijden van elke intrinsieke ritme overtreft de pacing tarief.
- Constante pacing stimulatie voor ten minste 20 beats te verkrijgen een stabiele atriale pacing leveren.
- Vastgesteldop de pacing output 5 mV, vervolgens geleidelijk te verminderen tot de geleverde pacing kan berichtenactiviteit niet depolarize het atrium.
- Bevestig de atriale excitatie door de aanwezigheid van P-golven in het ECG en/of een atriale excitatie-signaal door de optische recording.
- Het minimum pacing uitvoer welk vermag depolarize het atrium als de pacing drempel te bepalen.
- Stel de pacing uitgang voor de volgende studies op tweemaal de pacing drempel.
- Constante en burst pacing
- Leveren constant pacing voor 99 beats, met een pacing interval vanaf 150 ms, of het langste interval dat vermijdt overtreft het intrinsieke ritme.
- Verminder de pacing interval geleidelijk met 5 ms stappen, tot 40 ms of totdat het interval is bereikt die niet verkrijgen van 1:1 vangst van het atrium.
- Enkele extrastimulus pacing
- De pacing lengte van de cyclus van het basis station (S1) ingesteld op 120 ms, 100 ms, en 80 ms, tenzij de intrinsieke ritme overtreft het basis station of de pacing mislukt te verkrijgen atriale excitatie van 1:1.
- Stel het aantal ijsberen prikkels tot 10 beats voor de fundamentele trein station.
- De eerste extrastimulus (S2)-10 MS voor de lengte van de basiscyclus instellen
- S2 leveren na de laatste pacing stimulans van het basis station.
- Korter het interval van de koppeling van S2 geleidelijk met 5 ms stappen, totdat de S2 niet depolarize het atrium.
- Het bepalen van de effectieve refractaire periode (ERP) als het langste interval van de S2 die niet aan de depolarize van het atrium.
- Evalueren de ERP met ten minste 3 verschillende basiscyclus lengtes om te beoordelen van de aanpassing van het tarief van de ERP.
- Twee- en driepersoonskamers extrastimuli ijsberen om te induceren atriale tachyarrhythmias
- Het interval van de S2 naar een punt 20 ms buiten de ERP van S2 's resetten indien ze geen ritmestoornissen in acht worden genomen.
- Het toevoegen van een tweede extrastimulus (S3), beginnend met hetzelfde interval als S2.
- Verlagen het interval van de koppeling tussen S2 en S3 geleidelijk met 5 ms stappen totdat de S3 niet depolarize het atrium.
- Reset het interval van de S2 naar een punt 10 ms buiten de ERP, herhaal dan stap 3.5.3.
- Reset de S2 en S3 intervallen op punten 20 ms buiten elke ERP.
- Het toevoegen van een derde extrastimulus (S4), beginnend met hetzelfde interval als S3.
- Verlagen het interval van de koppeling tussen de S3 en S4 geleidelijk met 5 ms stappen totdat de S4 niet aan de depolarize van het atrium.
- De S3 interval reset naar een punt 10 ms buiten de ERP, herhaal dan stap 3.5.7.
- Reset de S2 en S3 intervallen op punten 10 ms buiten de ERP, herhaal dan stap 3.5.7.
- De inducibility van atriale tachyarrhythmias definiëren door de reproduceerbare inductie ook geprogrammeerde stimuli gebruiken.
- Evaluatie van de inducibility van atriale tachyarrhythmias
- Continu opnemen het ECG tijdens alle pacing protocollen (stap 3.3-3.5.).
- Optische opnamen tijdens en na elke stimulatie, opnemen van de inductie van atriale tachycardie (AT) of herhaalde atriale reactie (RAR) uitvoeren
- Bevestig de reproduceerbaarheid door hetzelfde pacing protocol toe te passen wanneer AF of een RAR wordt geïnduceerd.
Representative Results
De optische toewijzing experimenten zijn uitgevoerd met behulp van de apparaten, zoals weergegeven in Figuur 1a. Het schema van het optische systeem wordt geïllustreerd in Figuur 1b. Het systeem biedt een hoge resolutie analyse van de membraanpotentiaal en Ca2 + in het atrium van voorbijgaande aard.
Zoals afgebeeld in Figuur 1 c en d, bevindt de geïsoleerde kern zich in een kamer temperatuurgevoelig. Een 1-Franse grootte elektrode katheter wordt geplaatst in de RA door middel van een PE-buis ingevoegd in het Permanent Veterinair Comité, en een andere inwonende PE buis wordt ingevoegd in de holte van de LV van de apex van de LV te vermijden van overmatige druk op de kamer van het hart. Voor een gelijktijdige ECG opnemen, de kathode (ECG lood [-]) is verbonden met de naald van de cannulation en de anode (ECG lood [+]) is aangesloten op de elektrode van de pin in de ventriculaire apex ingevoegd. De functie van deze vergadering is om te voorkomen dat elke mechanische beschadiging van de atria.
Voor de evaluatie van de spanning van de membraan, fluorescentie met behulp van di-4-ANEPPS opgenomen met tot een 10.000 frames/s sampling rate (Figuur 2). De kaart van de activering is opgehaald tijdens het constante pacing verlost van de RA. De fijne toewijzing maakt de analyse van het patroon van de gedetailleerde geleiding in kleine lymfkliertest atria.
Figuur 3 ziet u sporen van de vertegenwoordiger van de membraan spanningen en Ca2 + voorbijgaande in de LA met behulp van RH237 en Rhod2AM tijdens de constante afpassen van de RA. We verminderen de samplefrequentie voor de toewijzing tot 1000 frames/s te verkrijgen van een voldoende signaal/ruisverhouding van het signaal van de Rhod2AM met de huidige instelling. Het systeem biedt echter een voldoende kwaliteit voor het analyseren van de relatie tussen de actiepotentiaal en Ca2 + van voorbijgaande aard.
Wij voeren dan een inductie van een atriale tachyarrhythmia met geprogrammeerde stimulatie met behulp van muizen onder een pathologische aandoening. Figuur 4 vertoont een optische recording van een geïnduceerde AT in een lymfkliertest atrium gekleurd met di-4-ANEPPS. De muis ondergaat een dwarse aorta vernauwing procedure om te passen een overbelasting van de druk op het atrium 10 dagen voordat het experiment6. We induceren AT door triple extrastimuli pacing (120/100/100/80), en de verspreiding van het terugkerende circuit waarnemen.
Figuur 1. Optische mapping systeem. a. algemene vergadering van de elektrofysiologie/optische mapping systeem. b. schematische voorstelling van de samenstelling van de optische mapping systeem: de blauwe pijl geeft de excitatie lichte gegenereerd door de lichtbron. De objectief kunnen worden uitgewisseld met het torentje. Het uitgestraalde licht uit het gekleurd hart is verdeeld tussen camera 1 en camera 2. Camera 1 detecteert de lange golflengte signalen voor de spanning van het membraan en camera 2 records de golflengtes met een bandfilter filter van 580 min of meer 20 nm voor de Ca2 + voorbijgaande aard. Tijdens de procedure, de ECG en perfusie druk worden continu geregistreerd en het ECG-signaal is ook gelijktijdig geïmporteerd in de optische kaart opnamesoftware. c. voorbereiding van de geïsoleerde harten: de harten worden gecanuleerd met een afgestompte naald via de oplopende aorta voor perfusie. De kathode is verbonden met de naald van de cannulation voor gelijktijdige ECG opnames, en de anode met de pin-elektrode is geplaatst in de ventriculaire apex. d. Cannulation buis en de elektroden: het hart is gecanuleerd met een naald 21-gauge afgestompte voor perfusie (cannulation naald). De grootte van een 1-Franse stimuleren elektrode (elektrode) wordt geplaatst in het juiste atrium door een polyethyleen buis ingevoegd in de superieure vena cava. De glazen kamer is opgewarmd op 37 ˚C door verwarmd water circuleren in de holte van de kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Kaart van de activering in het atrium. a. representatieve activering kaarten in de voorste weergave met een objectief met 5 X en b. in de achterste weergave met een 1.6 X-objectief. (Deelvenster links) Schematische voorstelling van de geïsoleerde hart en atrium. (Rechtervenster) Kaart van de activering van de linkerboezem verkregen met di-4-ANEPPS kleuring op 10.000 frames/s. De opname wordt uitgevoerd onder constante pacing met de stimulerende elektrode geplaatst in de juiste atrium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Dubbele registratie van de actiepotentiaal en Ca2 + voorbijgaande aard in de linkerboezem. a. schematische van de geïsoleerde hart. b. representatief beeld van de intensiteit van de fluorescentie in de linkerboezem met behulp van RH237 voor de spanning van de membraan (Vm) en Rhod2AM voor de Ca2 + voorbijgaande aard. De opname wordt uitgevoerd met een 5 X objectief bij 1.000 frames/s. c. Gelijktijdig opnemen van het ECG (boven), RH237 signaal (midden) en Rhod2AM signaal (onder), tijdens de constante pacing met de stimulatie-elektrode in het juiste atrium. De zwarte pijlen geven de stimulatie spikes, en de gele pijlen de ventriculaire excitatie. Een verstrooiing van licht effect van het ventrikel kan ook worden waargenomen (gele pijlpunten) zowel in het RH237 signaal en het signaal van de Rhod2AM. d. een samengevoegde RH237 en Rhod2AM-trace. De actiepotentiaal en voorbijgaande Ca2 + wijzigingen worden tegelijk geregistreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Activering toewijzing tijdens atriale tachycardie. (Deelvenster links) Schematische voorstelling van de geïsoleerde kern. (Midden paneel) De kaart van de activering tijdens een atriale tachycardie (AT). AT was geïnduceerd door triple extrastimuli pacing verlost van het juiste atrium. (Rechtervenster) De kaart van de activering tijdens sinus ritme in de dezelfde muis hart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende film 1. Film van de vertegenwoordiger van de membraanpotentiaal in het atrium met behulp van kleuring met di-4-ANEPPS. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 2. Films van de vertegenwoordiger van de toewijzing van de activering tijdens atriale tachycardie en sinus ritme. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Optische mapping is een gevestigde manoeuvre voor het bestuderen van de cardiale electrofysiologie7, en is een vrij nuttig hulpmiddel om te beoordelen niet alleen Ventriculaire ritmestoornissen8,9, maar ook atriale10,11 . Gelijktijdige toewijzing van de transmembrane potentieel en Ca2 + transiënten is nuttig voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van ritmestoornissen in verband met hartfalen en andere hart-en vaatziekten12,13. Bij het vergelijken van de andere elektrofysiologische beoordelingsmethoden, zoals die met behulp van een enkele cel of een cel blad, een van de absolute superioriteit van optische toewijzing in het perfused hart is de beoordeling van het patroon van de geleiding in het intact atrium en ventrikel, niet alleen tijdens de sinus ritme, maar ook tijdens geïnduceerde aritmieën14. Een poging om te gebruiken lymfkliertest harten, vooral het atrium, als een surrogaat van de mens is opgetreden problemen voornamelijk te wijten aan hun kleine omvang, maar de muis is een aantrekkelijke experimenteel model op het gebied van de evaluatie in een genetisch gemanipuleerde dieren model, en dit probleem moet worden opgelost. Onze aanpak biedt één richting om het te lossen.
Hoewel onze optische toewijzing apparaat eigenlijk vergelijkbaar met het conventionele systeem voor hele lymfkliertest hart15 was, heeft onze methode het voordeel van de beoordeling van het lymfkliertest atrium doordat enkele wijzigingen aan. Eerst, we voortgezet om het verkrijgen van een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van maximaal 0,1 ms/frame en 20 µm/pixel, en deze hoge resolutie toewijzing bijgedragen tot een meer nauwkeurige meting van de geleiding snelheid en vermeerdering patroon in het lymfkliertest atrium. Ten tweede, om te voorkomen dat geen onnodige mechanische schade of stuk van het atrium, die de elektrofysiologische eigenschappen 16,17 veranderen kan, een inwonende naald wordt ingevoegd direct de LV te verminderen van de druk van de intra-kamer, studeren in plaats van het invoegen via de LA zoals uitgevoerd in de vorige15. Bovendien, de pacing stimulus wordt geleverd via een aangepaste maakte 1-Franse grootte elektrode katheter geplaatst in de RA, maar niet door een naald elektrode, die het atrium kunnen verwonden. Alle pennen worden vermeden bij de vaststelling van de atriale aanhangsel, die werden gebruikt in de afgelopen studie15. Ten derde, in termen van de beoordeling van het onderliggende mechanisme van de ritmestoornissen, een geprogrammeerde stimulatie-protocol voor het opwekken van atriale tachyarrhythmias is cruciaal18,19. Wij voeren geprogrammeerde stimulatie identiek is aan die in klinische elektrofysiologische studies, met inbegrip van burst pacing en maximaal triple extrastimuli pacing, met een wijziging van de pacing interval voor het hart van de muis. Dus, naast de basislijn meting parameters, het protocol kunt het evalueren van de inducibility van het AT. Wanneer nodig, wordt de inducibility van het AT beoordeeld met de administratie van isoproterenol of andere drugs. In onze ervaring tonen de wild-type muizen nauwelijks een ATs zelfs na een volledige stimulatie-protocol. Zo moet de inducibility van AT belangrijke informatie voor de evaluatie van de bijdrage van verscheidene pathologische condities zoals genetische mutaties, chirurgische ingrepen, en het beheer van drugs11. Deze wijzigingen kunnen de nauwkeurige elektrofysiologische beoordeling in het intact lymfkliertest atrium optimaliseren.
Deze methode heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste, met een maximale ruimtelijke resolutie met een 5 X-objectief, het beeldveld (FOV) is beperkt tot een deel van het atrium (dwz. alleen de linker atriale aanhangsel als aangegeven in Figuur 2a). Voor het verkrijgen van de grotere FOV van het atrium, is een 1.6 X-objectief soms beter (Figuur 2b). Ten tweede, zonder de vaststelling van het atrium met pinnen, soms is het moeilijk om te meten de atriale geleiding eigenschappen correct, omdat het atriale oppervlak is gebogen. Dus, wij het glas cover op arbied aan het afvlakken in plaats van vaststelling van het door de pinnen geplaatst. Deze methode is ook gunstig voor de preventie van beweging artefact trillingen van de oplossing. Ten derde, met onze methode, het is heel moeilijk te verkrijgen van de gehele FOV, dus, de voorste en achterste weergave om goed te gebruiken is belangrijker in onze aanpak dan in de andere benadering zoals afgebeeld in Figuur 2. Het voordeel van de voorste weergave zou de duidelijke waarneming van terugkeer in het geval van pathologische voorwaarden, met name in het aanhangsel (Figuur 4). Aan de andere kant, de achterste weergave heeft een voordeel voor het verkrijgen van een goede weergave van de atriale achterste muur, en misschien wel een gedetailleerde opname van de activiteit van de myocardiale mouw startconditie. Wanneer is het moeilijk om een passend beeld te krijgen en om het gebogen oppervlak plat met onze methode, kan het atrium met minimale spanning worden vastgesteld door de pinnen.
Met onze methode zijn er 3 mogelijke problemen, gebrek aan kleuring, ijsberen en aritmie inductie. Voor falen van kleuring, als geen of lichte fluorescentie wordt waargenomen, moet u controleren of de toewijzing van de optische apparatuur voor het correct is gemonteerd, en of het reagens op de juiste manier wordt opgeslagen en gebruikt. De voorwaarde van de perfusie-oplossing is ook cruciaal, ook kunnen beïnvloeden de elektrofysiologische eigenschappen van het hart zelf, dus, de conditie van de oplossing met inbegrip van de pH, temperatuur, en of er voldoende beluchting moet streng worden gecontroleerd. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat eventuele lucht emboli in het hart. Voor de pacing mislukking, als de pacing prikkels kunnen niet het atrium wekken, moeten onderzoekers controleren of de bedrading correct met behulp van een circuit tester is. Wanneer de pacing prikkels correct output zijn, is het probleem de contactpersoon van de elektrode met het weefsel. Herpositionering van de elektroden, kan het probleem oplossen, en onze aanpak met behulp van de pacing katheter maakt het gemakkelijk. Voor problemen in aritmie inductie, kan RV pacing worden gebruikt voor de inductie van een AT in bepaalde beperkte gevallen. Met behulp van een quadripolar elektrode katheter waarvan de distale twee elektroden en de proximale elektroden kunnen worden gesitueerd in de RV en RA, respectievelijk, is het gemakkelijk om te wijzigen de pacing site van de RA de RV. Deze katheter is ook handig voor het verschuiven van de ventriculaire excitatie, wanneer een gelijktijdige ventriculaire activering signaal het atriale excitatie-signaal maskeert.
Deze methode zal bijdragen tot de beoordeling van het genotype-fenotype interacties in de AF gerelateerde genen nieuw gevonden door de roman studies zoals GWAS, met name voor de genen die niet het onderzoek aan te tonen hen door andere benaderingen. Met de vooruitgang van apparaten en technieken, kunnen het elektrofysiologische eigenschappen van de longader mouw, oftewel de belangrijke bron van AF20, worden beoordeeld in het intact hart met deze aanpak.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het programma voor verbetering van onderzoeksomgeving voor jonge onderzoekers uit speciale coördinatie fondsen voor de bevordering van wetenschap en technologie (SCF) (naar T.S.), Grants-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (nr. 16K 09494, T.S., No. 26293052, op T.F.) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan. Wij waarderen Brainvision en Mr. Kenji Tsubokura voor de technische bijstand, en wij waarderen ook de heer John Martin voor zijn taalkundige hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
