Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56478
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bio-informational Pharmacology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Biofunctional Informatics, Tokyo Medical and Dental University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

Abstract

מחקרים שנערכו לאחרונה האגודה הגנום כולו מיקוד פרפור פרוזדורים (AF) הראו קשר חזק בין גנוטיפ פנוטיפ אלקטרופיזיולוגיות בתוך אטריה. זה מעודד אותנו לנצל את מודל העכבר מהונדס התירי את המנגנון של AF. עם זאת, קשה להעריך את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר בשל גודלם הקטן. פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה באמצעות מערכת מיפוי אופטי עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה בליבם מאתר Langendorff perfused. מערכת מיפוי אופטי מורכב עם כפולה במהירות גבוהה משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה מצלמות ועדשות בהגדלה אובייקטיבי, כדי לזהות את זריחה של מתח רגיש צבע ו- Ca2 + מחוון. כדי להתמקד ההערכה של אטריה מאתר, מתבצע מיפוי אופטי עם שטח של 2 מ מ × 2 מ מ או 10 מ"מ x 10 מ מ, עם 100 × 100 רזולוציה (20 מיקרומטר לפיקסל או 100 מיקרומטר לפיקסל), קצב הדגימה של עד 10 קילו-הרץ (0.1 ms) מקסימום. אלקטרודה quadripolar גודל 1-צרפתית צועד קטטר ימוקם אטריום ימין דרך הווריד הנבוב הימנעות נזק מכני האטריום, צועד גירוי מועבר דרך הקטטר. המחקר אלקטרופיזיולוגיות מתבצע באמצעות גירוי מתוכנת כולל צועד קבוע, פרץ צועד, ועד extrastimuli טריפל צועד. תחת ספונטני או צועד קצב, המיפוי אופטי הקליט את פוטנציאל הפעולה משך ההפעלה מפה, מהירות הולכה, Ca2 + ארעי בנפרד בתוך אטריה ימין ועל שמאל. בנוסף, גירוי מתוכנת קובע גם את inducibility של tachyarrhythmias פרפור. מיפוי מדויק ההפעלה מתבצעת כדי לזהות המשכיות עירור באטריום במהלך tachyarrhythmia פרפור המושרה. מיפוי אופטי עם סביבה מיוחדים מאפשרת הערכה אלקטרופיזיולוגיות יסודית של האטריום מאתר דגמים פתולוגיים.

Introduction

הלב מורכב 4 תאי יונקים. שני התאים העליונה הינם אטריה, התחתונות נמצאות החדרים. החדרים לעבוד משאבה כדי להוציא דם מחזור הדם מערכתית או ריאתי. אטריה לקבל דם שחזר מן הורידים מערכתית או ריאתי, ולסייע בהעברת דם לתוך מתגלה כדי לקבל תפקיד משאבת הלב יעיל. מתוך היבט אלקטרופיזיולוגיות, הפונקציה העיקרית אטריה היא לווסת את קצב הלב. האותות החשמליים מקורן הצומת סינוס ממוקם בצומת בין הווריד הנבוב העליון (SVC) לבין העלייה הימנית (RA), ולאחר מכן להפיץ את רא, אטריום שמאל (LA), לנהל את הנוזלים דרך צומת atrioventricular שלו-Purkinje מערכת הולכה.

הפרעות בקצב הלב, אשר הפרעות קצב בלב, מסווגים לתוך חדרית על פי מוצאם, פרפור. פרפור פרוזדורים (AF) היא הצורה הנפוצה ביותר מתמשכת של הפרעה בקצב הלב, המאופיינת על ידי עירור אקראי ומהיר של אטריה. ניתוח גנטי האחרונות ולימודי הגנום כולו האגודה (GWAS) הראו את הקשר בין AF, מוטציות גנטיות או3,2,1,monopolymorphisms4. ממצאים אלה מצביעים על ש-AF משויכת לפחות חלקית הגורם הגנטי. לכן, חיוני כדי להעריך את האינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ אטריה באמצעות מודל בעלי חיים מהונדס. מקובל כי העכבר הוא היונק ביותר על ההנדסה הגנטית.

הטכניקה אופטי מיפוי פותחה כדי להעריך את עירור של רקמת הלב. עם זאת, התבוננות האטריום מאתר על ידי מיפוי אופטי היא הקשו על ידי גודלו הקטן יחסית. אנו מנסים להשיג הערכה מפורטת של האטריום מאתר עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים זו אושרה והופיע תחת ויסות טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה של טוקיו הרפואי ואת שיניים אוניברסיטת.

1. הכנה

  1. פתרונות מניות
    1. להמיס את צבעי רגיש מתח (di-4-ANEPPS, ו RH237) ו- Ca2 + מחוון (אני רוד-2) עם 100% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) להכין מלאי פתרונות עם ריכוזים של 6 מ מ, 10 מ מ ו- 10 מ"מ, בהתאמה.
    2. להמיס את עירור-התכווצות (E-C) uncoupler, blebbistatin, עם 90% דימתיל סולפוקסיד לעשות פתרון מניות 50 מ מ.
    3. Aliquot הפתרונות מניות ב- 0.2 מ ל PCR צינור בחדר חשוך, ולהחליף את האוויר בצינור מניות באמצעות גז חנקן כדי למנוע חמצון.
    4. לעטוף את הצינורות מניות בנייר אלומיניום בנפרד להגנה מפני האור ואחסן אותם ב-20 הלעפה תרוטרפמט.
  2. פתרונות עבודה
    1. להכנת 1 ליטר של תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ללא Ca2 + (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 8.0 מ מ נה2HPO4ו- 1.5 מ מ ח'2PO4, pH 7.40 על ידי NaOH)
    2. להכין 1 ליטר של הפתרון של Tyrode (135 ממ NaCl, 5.4 מ"מ אשלגן כלורי, 1.8 מ"מ CaCl2, מ מ 0.53 MgCl2, 0.33 מ מ NaH2PO4, 5.5 מ"מ D-גלוקוז, ו 5.0 מ"מ HEPES, pH 7.40 על ידי NaOH).
    3. סינון הפתרון של Tyrode עם מסנן העליון של בקבוק מיקרומטר 0.22, לאוורר אותו היטב על ידי לערבב בועות באמצעות אבן אוויר מחובר עם בלון גז של2 O.

2. אופטי מיפוי בליבם Langendorff-perfused

  1. להרכיב מערכת מיפוי אופטי באמצעות שתי מצלמות משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) (איור 1a& b)
    1. להרכיב את מצלמות CMOS קרן הפיצול, המטרה עדשות, עדשה האקדח, מקור האור, מראות ודיקרואיק זוהר, מסננים, חלקים אחרים לתוך מערכת מיפוי אופטי כפי שמוצג באיור 1a& b.
    2. בחר את רמת ההגדלה על-ידי שינוי העדשה המטרה בצריח, מצוידים עם רמות הגדלה שונות (1.6 X ו- 5 X).
      הערה: גודל חיישן CMOS הוא 10 מ מ × 10 מ מ, עם רזולוציה 100 × 100, מה שאומר, עם 5 X עדשת אובייקטיבי, מערכת זו מספקת רזולוציה מרחבית 20 מיקרומטר.
    3. להגדיר את האור עירור באמצעות מנורת דיודות פולטות אור (LED) עם מרכז אורך גל של 530 ננומטר, עברו דרך מסנן הלהקה מעברים (520/35 nm), משתקפת עם מראה ודיקרואיק זוהר (560 ננומטר).
    4. רשומה האות פליטה מחולק במפצל (665 ננומטר), איזו מצלמה הגדרה 1 עם תנועה ארוכה לעבור את הסינון (697/75 ננומטר) מזהה את קרינה פלואורסצנטית באמצעות צבע רגיש מתח הממברנה (di 4-ANEPPS או RH237), מצלמה 2 תשאר עם מסנן הלהקה מעברים (572/28 ננומטר) מזהה אות של Ca2 + המחוון (Rhod2-AM).
  2. להרכיב את המעגל זלוף Langendorff
    1. לצרף צינורות פוליוויניל כלוריד (PVC) משאבה סחרור.
    2. מכניסים לצד צריכת צינור PVC הפתרון של Tyrode מוגזים עם 100% O2 כאמור בשלב 1.2.3.
    3. להתחבר לצד פריקה של צינור PVC מלכודת אויר בעבודת יד ולאחר מכן לארגן את 5 מיקרומטר מסנן, stopcocks משולשת, רגשי לחץ, חימום זכוכית סליל, ואת המחט קהות 21-מד (גודל מחט הוא הפכפך התואמת את גודל האאורטה) ברצף , באמצעות צינורות PVC אחרים.
    4. למלא את המעגל זלוף עם הפתרון של Tyrode הימנעות בועות אוויר בתוך המעגל, לעצור את הזרם עד הלב מחובר המעגל.
  3. Heparinization והרדמה
    1. מזריקים unfractionated הפרין (200 יחב ל, ללא קשר משקל הגוף) intraperitoneally לתוך עכבר באמצעות מחט בקוטר 25 מזרק 1-mL.
    2. עזים ומתנגד העכבר על ידי זריקה בקרום הבטן של פנטוברביטל (65 מ"ג/ק"ג) 10 דקות לאחר הזרקת הפרין.
  4. תעלות זלוף
    1. הנח את העכבר במצב פרקדן. אשר חיות הוא ומורדמת באמצעות חוסר תגובה שאורך צביטה. פתח בקיר הבטן מתחת לרמת מצאתי תהליך באמצעות מספריים. עושים חתך רוחבי של הסרעפת חתך צידי הצלעות בקו בבית השחי המדיאלי ללא נזק ללב, הפוך קיר החזה הקדמי כלפי מעלה. לקדם את המלקחיים מעוקל מאחורי הלב, והחזק את אבי העורקים, הוושט, הכלילי. ואז, לסלק את הלב עם מספריים במהירות יחד עם כלי הסמוכים ורקמות, כגון אבי העורקים, הריאות, קנה הנשימה, הוושט, רקמות adipose וכן התימוס.
    2. לשטוף את הלב עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח בצלחת פטרי, ולהסיר את הרקמות הסמוכות.
    3. להציג את קצה המחט קהות 21-מד מחובר המעגל זלוף לתוך אבי העורקים, לתקן את זה עם חוט תחת stereomicroscope.
    4. להתחיל perfuse את הלב במשך 10 דקות עם הפתרון של Tyrode מוגזים עם 100% O2.
    5. נטר את הלחץ זלוף ברציפות עם מתמר לחץ מחובר מגבר ו מקליט.
    6. לשמור על הלחץ זלוף בין 80-100 מ מ כספית (בדרך כלל תואם ל- 2-5 mL/min עבור קצב הזרימה) במהלך כל השלבים הבאים.
    7. במהלך זלוף הראשונית (שלב 2.4.4.), הוסף את צינור דק פוליאתילן (PE) (הקוטר החיצוני: 0.8 מ מ) לתוך SVC, לתקן את זה עם חוט. אז, במקום הלב אל החדר ומחוממת זכוכית (איור 1b& c).
    8. דקירה מחט שכנה 24-מד (הקוטר החיצוני: 0.7 מ מ) לתוך חלל השמאלי (LV) חדרית דרך השיא חדרית כדי למנוע נזק לאטריום ולהסיר את המחט הפנימי עוזב את הצינורית חיצוני ב LV.
    9. להציג את צנתר אלקטרודה 1-צרפתית גודל מותאם אישית עשה דרך הצינורית PE ב SVC לבצע גירוי חשמלי רע אם יש צורך, לקדם הקטטר לתוך החדר הימני (RV) עבור צועד חדרית.
    10. הכנס אלקטרודה pin השיא חדרית ברציפות להקליט את electrocardiograms דו קוטבי (א) בין ה-pin אלקטרודה, תעלות המחט אבי העורקים (איור 1 c).
    11. המשך ניטור אק ג זלוף הלחץ במהלך המחקר כולה.
    12. לכבות את האור, לבצע את הניסוי הבא בחדר חשוך.
    13. עבור לשלב 2.5. עבור הקלטות יחיד של מתח הממברנה או 2.6. לצורך הקלטה כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + ארעי.
  5. צביעת עבור הקלטה יחיד של מתח הממברנה
    1. לשמור על הפתרון זלוף מחוממת ב 37 הלעפה תרוטרפמט במהלך הפרוטוקול מכתימים עבור הקלטה יחיד של מתח הממברנה.
    2. לדלל µL 8.3 של הפתרון מניות di-4-ANEPPS (6 מ מ) עם 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode (הריכוז הסופי הוא 5 מיקרומטר).
    3. להשרות את הנפח הכולל (10 מ ל) של הפתרון מדולל di-4-ANEPPS אל הלב דרך המסלול זלוף למשך 2-5 דקות, ואחריו כשלון עם הפתרון של Tyrode במשך 5 דקות.
    4. לדלל 5 µL של הפתרון מניות blebbistatin (50 מ"מ) עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode (הריכוז הסופי הוא 250 מיקרומטר).
    5. מחלקים את הכמות הכוללת של הפתרון מדולל blebbistatin דרך המסלול זלוף.
    6. לדלג על שלב 2.6 והמשך לשלב 2.7 עבור שטיפה.
  6. צביעת עבור הקלטה כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + ארעי
    1. לשמור על הפתרון של Tyrode בטמפרטורת החדר.
      הערה: ההגדרה הראשונית של הטמפרטורה היא שונה מזו של צביעת עבור הקלטה יחיד של מתח הממברנה (שלב 2.5.).
    2. לנהל את blebbistatin באותו אופן כמו שלבים 2.5.4 ו 2.5.5.
    3. לערבב 3 µL של Rhod2AM מניות פתרון (10 מ מ), 30 µL של polyoxyethylene-polyoxypropylene בלוק קופולימר F-127 (20% ב דימתיל סולפוקסיד), לאחר מכן לדלל את התערובת עם 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode.
    4. לטעון את הסכום הכולל של Rhod2AM פתרון (3 מיקרומטר) יותר מ 2-5 דקות דרך באותה הדרך כמו blebbistatin.
    5. לדלל 7 µL של RH237 מניות פתרון (10 מ מ) עם 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode.
    6. לנהל את הסכום הכולל של הפתרון RH237 מדולל (7 מיקרומטר) יותר מ 2-5 דקות.
    7. לאחר סיום ההליך לעיל, מתחילים לחמם הפתרון של Tyrode הלעפה תרוטרפמט 37.
  7. שטיפה
    1. לשמור על הטמפרטורה של הפתרון של Tyrode הלעפה תרוטרפמט 37 בניסוי הבא.
    2. Perfuse את הלב עם הפתרון של Tyrode לפחות 5 דקות לשטוף את צבעי מוגזמת.
      הערה: יש צורך להגביר את קצב הזרימה במהלך זה לשטוף את שלב (עיין שלב 2.4.6).
    3. לאשר את היעלמותו של כל חפץ תנועה בשל התכווצויות, ואת ההכתמה הומוגנית בלב perfused.
  8. דיגום וניתוח נתונים
    1. לשים את מכסה הזכוכית (25 מ"מ × 60 מ"מ) על הלב perfused בקפידה, לשטח פני השטח פרפור בלי יותר מדי לחץ מכני, ולמנוע תנועה חפץ מן רטט של הפתרון. לאשר כי האטריום מייחסת מכסה הזכוכית כראוי.
    2. שיא זריחה על ידי המצלמות CMOS עם דגימה בשיעור עד 0.1 מילישניות di 4-ANEPPS, ו- 1 ms עבור RH237 ו- Rhod2AM מכתים.
    3. לנתח את הקלטות שהושג באמצעות תוכנה וניתוח, על פי הוראות היצרן עבור הפעולה בפועל של התוכנה.
    4. ליצור הפעלה מפה של הסרט לאחר חילוץ האזור של עניין, הסרת להיסחף, סינון הטמפורלי, ו 3 X 3 binning5.

3. אלקטרופיזיולוגיות המחקר

  1. הגדרת את אלקטרודות pacing, ממריץ
    1. לאשר את המגע של קצה האלקטרודה pacing בהזמנה אישית ב ר. א לרקמת לגירוי (עיין שלב 2.4.9.).
    2. לספק גירויים כל pacing הקטטר pacing מחובר את ממריץ לתכנות.
  2. קביעת הסף pacing
    1. להגדיר מרווח הזמן pacing בין 100 ו 150 ms (רוחב הדופק של 0.4 ms), הימנעות מהותי חוש קצב הקצב pacing והאנושיים.
    2. לספק גירוי קבוע צועד לפחות 20 פעימות להשיג צועד פרפור יציב.
    3. להגדיר את צועד פלט-5 mV, ואז בהדרגה לצמצם את זה עד בהבטחתו pacing ונמסרו depolarize האטריום.
    4. לאשר את עירור פרפור על ידי הנוכחות של גלי P בא, ו/או אות פרפור עירור על ידי ההקלטה אופטיים.
    5. קבע את המינימום צועד פלט כי הוא מסוגל depolarize האטריום כמו הסף pacing.
    6. להגדיר את הפלט pacing עבור המחקרים הבאים מושחרות pacing פעמיים.
  3. קבוע, פרץ צועד
    1. לספק צועד קבוע עבור פעימות 99, עם מרווח pacing החל מ- 150 מילישניות, או את מרווח הזמן הארוך זה מונע והאנושיים הקצב מהותי.
    2. להפחית את מרווח הזמן pacing בהדרגה עם שלבים 5 מילי-שניות, עד 40 ms או עד להגיע למרווח זה נכשל לקבל 1:1 לכידתו של האטריום.
  4. Extrastimulus יחיד צועד
    1. הגדר אורך מחזור pacing הכונן בסיסי (S1) 120 ms, 100 ms ו- 80 ms אלא אם הקצב מהותי outpaces הכונן בסיסי או שיהיה כשל pacing להשיג עירור פרפור 1:1.
    2. הגדר את המספר של צועד גירויים 10 פעימות לרכבת נסיעה בסיסיים.
    3. הגדר את extrastimulus הראשון (S2)-10 ms אורך מחזור בסיסי.
    4. לספק S2 לאחר הגירוי pacing האחרון של הכונן בסיסי.
    5. לקצר את מרווח הזמן צימוד של S2 בהדרגה עם שלבים 5 מילי-שניות, עד S2 לא יצליח depolarize האטריום.
    6. לקבוע תקופת עקשן יעיל (ERP) בתור הארוך המרווח S2 ואשר depolarize האטריום.
    7. הערכת ERP באורכים שונים מחזור בסיסי לפחות 3 כדי להעריך את קצב העיבוד של ERP.
  5. Extrastimuli כפולים ומשולשים צועד לזירוז tachyarrhythmias פרפור
    1. לאפס את מרווח S2 לנקודת 20 ms מחוץ ERP S2 אם אין הפרעות קצב הם נצפו.
    2. הוסף extrastimulus השני (S3), החל המרווח באותו הזמן כמו S2.
    3. להקטין את מרווח הזמן צימוד בין S2 S3 בהדרגה עם שלבים 5 מילי-שניות עד S3 נכשל depolarize האטריום.
    4. אפס את מרווח הזמן של S2 נקודה 10 ms מחוץ ERP, ולאחר מכן חזור על שלב 3.5.3.
    5. לאפס את המרווחים S2 ו- S3 לנקודות 20 ms מחוץ לכל ERP.
    6. הוסף extrastimulus השלישי (S4), החל המרווח באותו הזמן כמו S3.
    7. להקטין את מרווח הזמן צימוד בין S3 S4 בהדרגה עם שלבים 5 מילי-שניות עד S4 נכשל depolarize האטריום.
    8. לאפס את מרווח S3 לנקודת 10 ms מחוץ ERP, ולאחר מכן חזור על שלב 3.5.7.
    9. לאפס את המרווחים S2 ו- S3 נקודות 10 ms מחוץ ERP, ולאחר מכן חזור על שלב 3.5.7.
    10. להגדיר את inducibility של tachyarrhythmias פרפור מאת אינדוקציה לשחזור באמצעות גירויים מתוכנתים באופן דומה.
  6. הערכת inducibility של tachyarrhythmias פרפור
    1. ללא הרף להקליט א במהלך כל הפרוטוקולים pacing (שלב 3.3-3.5.).
    2. לבצע הקלטות אופטי במהלך ואחרי כל גירוי, כדי להקליט את תנאי הגיוס של פרפור טכיקרדיה (AT) או תגובה פרפור החוזרות על עצמן (RAR).
    3. לאשר את הפארמצבטית על-ידי החלת באותו פרוטוקול pacing כאשר AF או של RAR הוא המושרה.

Representative Results

מיפוי אופטי הניסויים מתבצעים באמצעות המכשירים כפי שמוצג באיור 1a. הסכימה של מערכת אופטית מודגם ב איור 1b. המערכת מספקת ניתוח ברזולוציה גבוהה של פוטנציאל הממברנה, Ca2 + ארעית בתוך הפרוזדור.

כפי שהיא מתוארת באיור 1 c ו- d, בלב המבודד ממוקם בתוך תא טמפרטורה מבוקרת. צנתר אלקטרודה גודל 1-צרפתית מושם ב ר. א דרך צינור PE מוכנס לתוך SVC ולאחר עוד צינור PE שכנה מוכנס לתוך חלל LV מהקודקוד LV כדי למנוע לחץ רב מדי על תא הלב. עבור הקלטה סימולטני אק ג, הקתודה (אק ג עופרת [-]) מחובר המחט תעלות, האנודה (אק ג עופרת [+]) מחובר האלקטרודה pin מוכנס לתוך השיא חדרית. התכונה של הרכבה זו היא למנוע נזק מכני אטריה.

עבור הערכת מתח הממברנה, נרשם עם פלורסצנטיות באמצעות di-4-ANEPPS עד קצב הדגימה מסגרות לשנייה 10,000 (איור 2). המפה הפעלה מתקבל במהלך קבוע צועד נמסר מרע המיפוי בסדר המאפשרת הניתוח של הדפוס הולכה מפורט ב אטריה מאתר קטן.

איור 3 מדגים עקבות נציג של מתח הממברנה, Ca2 + ארעי באל באמצעות RH237 ו- Rhod2AM במהלך קבוע צועד מרע להפחית את קצב הדגימה של המיפוי כדי 1000 מסגרות לשנייה כדי לקבל יחס אות/רעש מספיקות של האות Rhod2AM עם ההגדרה הנוכחית. עם זאת, המערכת מספקת איכות מספיק לניתוח היחסים בין פוטנציאל הפעולה לבין Ca2 + ארעית.

אנחנו לאחר מכן לבצע אינדוקציה של tachyarrhythmia פרפור עם גירוי מתוכנת שימוש בעכברים תחת מצב פתולוגי. איור 4 תערוכות הקלטת האופטי של המושרה AT באטריום מאתר מוכתם di-4-ANEPPS. העכבר עובר הליך התרחבות אבי העורקים רוחבי כדי להחיל עומס הלחץ לאטריום 10 ימים לפני הניסוי6. אנחנו זירוז AT מאת extrastimuli טריפל צועד (120/100/100/80), ולבחון התפשטות של מעגל reentrant.

Figure 1
איור 1. מערכת מיפוי אופטי. א העצרת הכללית של מערכת מיפוי electrophysiology/אופטי. b. מפרטים טכניים של ההרכב של מערכת מיפוי אופטי: החץ הכחול מציין את עירור אור שנוצר על ידי מקור האור. ניתן להחליף את העדשה המטרה עם הצריח. האור הנפלט מכל הלב מוכתם מפוצל בין מצלמה 1 מצלמה 2 תשאר. מצלמה 1 מזהה את האותות אורך גל ארוך עבור מתח הממברנה, מצלמה 2 רשומות אורכי הגל עם מסנן bandpass של 580 nm ± 20 עבור Ca2 + והחולף. במהלך ההליך, הלחץ אק ג זלוף נרשמים באופן רציף, האות א הוא גם לייבא בו-זמנית המפה אופטי תוכנת צריבת. ג הכנה של לבבות בודדים: ליבם הם לצינוריות עם מחט קהות דרך העורקים עבור זלוף. להקלטות אק ג בו זמנית, הקתודה מחובר המחט תעלות, האנודה עם האלקטרודה pin מוכנס לתוך השיא חדרית. האלקטרודות ובשעות תעלות ד : הלב הוא לצינוריות עם מחט קהות 21-מד עבור זלוף (תעלות מחט). בגודל 1-צרפתית מגרה אלקטרודה (אלקטרודה) ממוקם באטריום ימין דרך צינור פוליאתילן מוכנס לתוך הווריד הנבוב. תא זכוכית מחומם ב 37 הלעפה תרוטרפמט על ידי מים מחומם במחזור חלל החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. הפעלת מפה באטריום. א הפעלת נציג מפות בתצוגה קדמית עם 5 X עדשת אובייקטיבי, ו - b בתצוגה האחורי עם עדשה המטרה X 1.6. (משמאל לוח) תיאור סכמטי של אטריום והלב מבודד. (לוח נכון) הפעלת מפה של אטריום שמאל שהושג עם די-4-ANEPPS מכתים-מסגרות 10,000/s. ההקלטה מתבצעת תחת קבוע צועד עם האלקטרודה מגרה ממוקמת ב אטריום ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. הקלטה כפולה של פוטנציאל הפעולה, Ca2 + ארעי ב אטריום שמאל. א סכמטי של הלב מבודד. b. תמונה ייצוגית של האינטנסיביות של זריחה מימדי באמצעות RH237 עבור מתח הממברנה (Vm) ו- Rhod2AM עבור Ca2 + והחולף. ההקלטה מתבצעת עם עדשה המטרה X 5 ב-1000 מסגרות/s. c. הקלטה בו זמנית של אק ג (למעלה), האות RH237 (באמצע), האות Rhod2AM (למטה), בזמן קבוע צועד עם האלקטרודה גירוי ב אטריום ימין. החצים השחורים מציינים גירוי קוצים חיצים צהובים של עירור חדרית. אפקט פיזור אור מן הנוזלים גם יכול להיות שנצפו (חץ צהוב) הן RH237 אות, אות Rhod2AM. ד הממוזג RH237 ו- Rhod2AM לאתר. פוטנציאל הפעולה של Ca2 + שינויים חולף נרשמים בו זמנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. מיפוי ההפעלה במהלך טכיקרדיה פרפור. (משמאל לוח) תיאור סכמטי של הלב מבודד. (התיכון לוח) מפת ההפעלה במהלך טכיקרדיה פרפור (AT). AT הסחרור הושפע extrastimuli טריפל צועד נמסר מהפרוזדור הימני. (לוח נכון) מפת ההפעלה במהלך קצב סינוס בלב העכבר זהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הסרט משלים 1. הסרט מייצג של קרום פוטנציאליים בתוך הפרוזדור באמצעות צביעת עם די-4-ANEPPS. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 2. סרטים נציג של המיפוי הפעלה בזמן פרפור קצב סינוס טכיקרדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

מיפוי אופטי הוא תרגיל ומבוססת ללמוד את הלב אלקטרופיזיולוגיה7, הוא כלי שימושי למדי להעריך לא רק להפרעה8,9, אלא גם אלה פרפור10,11 . מיפוי סימולטני של פוטנציאל transmembrane ו- Ca2 + שנחשולי שימושי להבנת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב ביחס אי ספיקת לב, מחלות לב אחרות,12,13. כאשר משווים את אלקטרופיזיולוגיות להערכת שיטות אחרות, כגון אלה באמצעות תא בודד או גיליון תא, אחד דברים מוחלטים של מיפוי אופטי בלב perfused הוא ההערכה של התבנית הולכה בפרוזדור ללא פגע, החדר, לא רק במהלך קצב סינוס, אלא גם במהלך induced הפרעות קצב14. ניסיון לנצל מאתר לבבות, במיוחד האטריום, בתור פונדקאית של בני אדם נתקל בקשיים בעיקר בשל גודלם הקטן, עם זאת, העכבר הוא מדגם ניסיוני אטרקטיבי מבחינת ההערכה של חיים מהונדס מודל, בעיה זו להכריעו. הגישה שלנו מספק דיירקשן לפתור אותה.

למרות מכשיר אופטי מיפוי שלנו היה בעיקרון דומה למערכת קונבנציונליים עבור כל מאתר לבבות15, השיטה שלנו יש את היתרון של הערכת האטריום מאתר על ידי ביצוע מספר שינויים אליו. ראשית, אנחנו רדף להשיג רזולוציה יכולות גבוהה של עד 0.1 ms/מסגרת 20 מיקרומטר לפיקסל ואת מיפוי ברזולוציה גבוהה זה תרם מדידה מדויקת יותר של דפוס מהירות והתפשטות של הולכה בפרוזדור מאתר. שנית, כדי למנוע פגיעה מכנית מיותרת או מתיחה של האטריום, אשר יכול לשנות מאפייני אלקטרופיזיולוגיות 16,17, שכנה המחט מוחדרת ישירות לתוך בעירוי כדי להפחית את הלחץ אינטרה-הקאמרית, במקום להכניס את זה דרך לה כפי שבוצע הקודם לומדים15. יתר על כן, הגירוי pacing מועבר דרך קטטר אלקטרודה גודל מותאם אישית 1-צרפתית עשוי להציב את רא, אבל לא על ידי אלקטרודה המחט, אשר עלול לפגוע האטריום. סיכות נחסכים בתיקון הפרוזדור, אשר שימשו את לימוד העבר15. שלישית, מבחינת ההערכה של המנגנון הבסיסי של הפרעות בקצב הלב, פרוטוקול גירוי מתוכנת לזירוז tachyarrhythmias פרוזדורים הוא מכריע18,19. אנו מבצעים זהה לזו מתוכנת גירוי במחקרים קליניים אלקטרופיזיולוגיות, כולל פרץ צועד ועד extrastimuli טריפל צועד, עם שינוי של מרווח הזמן pacing ללב העכבר. לכן, בנוסף הפרמטרים מידה בסיסית, הפרוטוקול יכול להעריך את inducibility של AT. בעת הצורך, inducibility של AT שקובעת עם הממשל של isoproterenol או תרופות אחרות. מניסיוננו, העכברים פראי-סוג בקושי מופיעים כל ATs גם לאחר פרוטוקול גירוי מלאה. לפיכך, inducibility של AT צריך להיות מידע חשוב להערכת התרומה של מספר תנאים פתולוגיים כגון מוטציות גנטיות, ניתוחים הממשל של סמים11. שינויים אלה יכול למטב את ההערכה אלקטרופיזיולוגיות מדויק באטריום מאתר ללא פגע.

בשיטה זו יש גם מספר מגבלות. ראשית, שימוש ברזולוציה המרחבית מקסימלית עם עדשה המטרה X 5, שדה הראייה (FOV) מוגבל לחלק של האטריום (כלומר. רק שמאלה הפרוזדור כמו באיור איור 2a). עבור קבלת של FOV גדול יותר של האטריום, עדשה המטרה X 1.6 הוא לפעמים עדיפה (איור 2b). שנית, מבלי לתקן את האטריום עם סיכות, לפעמים קשה למדוד את המאפיינים הולכה פרפור כראוי, כי השטח פרפור עקום. אז, אנחנו במקום הזכוכית המכסה על המשטח לשטח זה במקום לתקן אותה על-ידי סיכות. שיטה זו היא גם מועיל למניעת תנועה חפץ מן התנודות של הפתרון. שלישית, בשיטה שלנו, זה די קשה להשיג את FOV כולו, אז להשתמש התצוגה anterior ואת אחורי כראוי חשוב יותר בגישה שלנו יותר בגישה אחרת כפי שמוצג באיור2. היתרון של התצוגה הקדמי יהיה ברור התבוננות לאטמוספרה במקרה של מצבים פתולוגיים, במיוחד התוספתן (איור 4). מצד שני, הנוף האחורי יש יתרון של קבלת תצוגה טובה של הקיר האחורי פרפור, וייתכן הקלטה מפורטת של מפעילה פעילות מן השרוול שריר הלב. כאשר קשה להשיג קובץ תצוגה מתאים, לשטח פני השטח שלו מעוקל עם השיטה שלנו, ניתן לתקן את האטריום עם המתח מינימלי באמצעות סיכות.

בשיטה שלנו, יש 3 בעיות אפשריות, כשל של צביעת, צועד בקצב הלב אינדוקציה. לכישלון של צביעת, אם אין או קרינה פלואורסצנטית קלה הוא ציין, אתה צריך לבדוק האם המנגנון מיפוי אופטי מורכב כראוי, וה -אם הכימית כראוי המאוחסנים בשימוש. התנאי של הפתרון זלוף הוא גם חיוני, אשר יכולים להשפיע גם את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של הלב עצמו, אז המצב של פתרון כולל את ה-pH, טמפרטורה, ויש במציאותם לערבב מספיק להיות במעקב בלבד. חשוב גם להימנע מכל תסחיף אוויר בלב. עבור צועד כשל, אם הגירויים pacing לא יכול לרגש האטריום, חוקרים צריך לבדוק אם החיווט הנכון באמצעות כבודק במעגל. כאשר הגירויים pacing הם outputted כראוי, הבעיה היא הקשר של האלקטרודה עם הרקמה. מיקום מחדש של האלקטרודות ניתן לפתור את הבעיה, הגישה שלנו בעזרת הצנתר pacing מקלה. על הקושי אינדוקציה בקצב הלב, RV צועד יכול לשמש את אינדוקציה של AT במקרים מסוימים המוגבלת. באמצעות צנתר אלקטרודה quadripolar אשר דיסטלי שתי אלקטרודות ואלקטרודות proximal עשויה להימצא ב RV ו רא, בהתאמה, זה קל לשנות את האתר pacing מרה בקרוואן קטטר זה שימושי גם הסטה של עירור חדרית כאשר אות הפעלה בו-זמנית חדרית מסכות האות עירור פרפור.

שיטה זו תורמת כדי לבדוק את ה-גנוטיפ פנוטיפ באינטראקציה AF הקשורים גנים נמצאו לאחרונה על ידי מחקרים חדשניים כגון GWAS, במיוחד על הגנים אשר החקירה נכשל להראות להם על ידי גישות אחרות. עם ההתקדמות של מכשירים וטכניקות, המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של השרוול וריד ריאתי, אשר הוא מקור חשוב של AF20, יכול להיות מוערך בלב שלם עם גישה זו.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על ידי התוכנית עבור שיפור של סביבת מחקר לחוקרים צעירים מקרנות תיאום מיוחד לקידום המדע, הטכנולוגיה (SCF) (ל ט. ס), Grants-in-Aid למחקר מדעי (מס 16K. 09494, ל ט. ס, מספר 26293052, אל. טי) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT) של יפן. אנו מעריכים Brainvision ואת מר קנג'י Tsubokura לסיוע טכני, אנחנו מעריכים גם מר ג'ון מרטין לסיוע הלשוני שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin SIGMA B0560-1MG E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Rhod2AM Biotium 50024 Ca indicator
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Biotium #59000 To enhance the staining with Rhod2AM
Di-4-ANEPPS Wako 041-29111 Voltage-sensitive dye
Dimethyl sulfoxide Wako 046-21981 Solvent for reagents
Bottle top filter Corning 430513 For filtering Tyrode's solution
Haparin Sodium Mochida Pharmaceutical Co., Ltd N/A To avoid blood clots in the coronary artery
Air stone (φ8 mm x 10 mm) Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho N/A for aeration
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Corporation N/A For an anesthesia
Programmable stimulator Fukuda Denshi BC-05 Fukuda Denshi kindly rented us.
Power Lab AD Instruments Powerlab 26/8SP To record blood pressure and electrocardiogram
Bio Amp AD Instruments ML132 Amprifier for electrocardiogram
BP Amp AD Instruments FE117 Amprifier for blood pressure
LabChart AD Instruments Version 7 Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram
Disposable BP transducer AD Instruments MLT0670 pressure transducer
1-Fr custom made electrode catheter Unique Medical N/A To pace right atrium
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) Natume Seisakujo SP31 Put into superior vena cava to introduce electrode catheter
Millex-SV 5.00 μm Merk Millipore SLSV025LS To filter the circulating Tyrode
24-gauge indwelling needle TERUMO SR-FS2419 Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber
21-gauge needle TERUMO SN-2170 We cut the tip of needle and blunted it by filing
25-guage needle TERUMO NN-2525R
1-ml syringe TERUMO SS-01T
PVC tube TERUMO SF-ET0525 for Langendorff's perfusion circuit
Three-way stopcock TERUMO TS-TL2K for Langendorff's perfusion circuit
Petri dish As one 3-1491-01
Custum made heating glass coil Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Custum made warming glass chamber Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Constant temperature circulating device Lauda E100 connected to heating coil and warming chamber
Cover glass (25 mm × 60 mm) Matsunami C025601 Put on the atria to flatten the recording area
Perista pump ATTO SJ-1211 peristaltic pump
Stemi DV4 Carl Zeiss N/A Stereomicroscope
MiCAM ULTIMA-L2 Brainvision Inc. UL-L2 Optical mapping System
BV_Ana Software Brainvision Inc. BV_Ana Data Analysis Software
THT Macroscope Brainvision Inc. THT-ZS Epi-Illumination Unit
LED Light Source Brainvision Inc. LEX2-G
Dichroic Mirror 560nm Brainvision Inc. DM560 Epi-Illuminatinon
Excitation Filter 520/35nm Semrock, Inc. FF01-520/35-25
Projection lens Plan S 1.0X Carl Zeiss 435200-0000-000
Focus Drive Carl Zeiss 435400-0000-000
Objective lens Revolver Carl Zeiss 435302-0000-000
Manual Focus Column Carl Zeiss 435400-0000-000
Macroscope Base Carl Zeiss 435430-9901-000
Straight Light Guide MORITEX Corporation MSG10-2200S Epi-Illuminatinon
Condenser Lens MORITEX Corporation ML-50
PLANAPO 5.0X Leica Microsystems 10447243 Objective Lens
PLANAPO 1.0X Leica Microsystems 10447157 Objective Lens
PLANAPO 1.6X Leica Microsystems 10447050 Objective Lens
Beam-Splitter Brainvision Inc. FLSP-2
Dichroic Mirror 665nm Brainvision Inc. DM665 Beam-Splitter
Emission Filter 572/28nm Edmund Optics #84-100 Rhod2-AM
Emission Filter 697/75nm Semrock, Inc. FF01-697/75-25 RH237 and Di-4-ANEPPS
0.2 mL PCR tube Greiner Bio-One 671201
aluminum foil Toyo alumi 0020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
  2. Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
  3. Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
  4. Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
  5. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
  6. Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
  7. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
  8. Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
  9. Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
  10. Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
  11. Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
  12. Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
  13. Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
  14. Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
  15. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
  16. Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
  17. Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
  18. Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
  19. Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
  20. Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).

Tags

אופטי רפואה גיליון 132 מיפוי עכבר אטריום Electrophysiological ללמוד פרפור פרוזדורים רגיש מתח לצבוע Ca2 + מחוון פוטנציאל הפעולה הפרעה בקצב הלב
אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ihara, K., Sugiyama, K., Takahashi,… More

Ihara, K., Sugiyama, K., Takahashi, K., Yamazoe, M., Sasano, T., Furukawa, T. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. J. Vis. Exp. (132), e56478, doi:10.3791/56478 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter