Summary
이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.
Abstract
최근 게놈 넓은 협회 연구 결과 심 방 섬유 성 연 축 (AF)를 대상으로 유전자는 atria에 electrophysiological 표현 형 사이 강한 협회를 표시 했습니다. 그 우리 AF의 메커니즘을 명료 하 게 하는 유전으로 설계 된 마우스 모델을 활용 하는 것을 권장 합니다. 그러나, 그들의 작은 크기로 인해 murine atria에 electrophysiological 속성을 평가 하기 어렵습니다. 이 프로토콜 electrophysiological atria Langendorff 끼얹는다 murine 마음에 높은 시간적, 공간적 해상도 광학 매핑 시스템을 사용 하 여 평가 설명 합니다. 광학 매핑 시스템 듀얼 고속 보완 금속 산화물 반도체 카메라와 고배율 렌즈, 전압에 민감한 염료 및 캘리포니아2 + 표시기의 형광을 검출 하기 위하여 조립 된다. Murine atria의 평가에 초점, 광학 매핑 2 m m × 2 m m 또는 10 m m x 10 m m, 100 × 100 해상도 (20 µ m/픽셀 또는 100 µ m/픽셀)와 10 khz (0.1 ms) 최대 샘플링 속도의 영역으로 수행 됩니다. 1 프랑스 크기 quadripolar 전극 카 테 터를 서 성 아 트리 움에 기계적 손상을 피하 뛰어난 베 나 정 맥을 통해 오른쪽 아 트리 움으로 배치 되 고는 카 테 테 르 통해 전달 자극 성. 일정 성 등 프로그램 자극 electrophysiological 연구 수행, 서 성, 그리고 트리플 extrastimuli 성 파열. 자연 또는 리듬 성, 광학 매핑 활동 전위 기간, 활성화 지도, 전도 속도, 및 캘리포니아2 + 과도 오른쪽과 왼쪽 atria에 개별적으로 기록. 또한, 프로그램 된 자극은 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility를 결정합니다. 정확한 정품 인증 매핑 유도 atrial tachyarrhythmia 동안 안마당에서 여기의 전파를 식별 하기 위해 수행 됩니다. 특수 설정 광학 매핑 murine 병 적인 모델에서 안마당의 철저 한 electrophysiological 평가 수 있습니다.
Introduction
포유류에서 4 챔버가 마음에 의하여 이루어져 있다. 위 두 개의 챔버는 심 방, 되며 낮은 사람 심. 심 전신 또는 폐 순환 하는 혈액을 추출 펌프 작동 합니다. 심 방 조직 또는 폐 정 맥에서 돌아오는 혈액을 받을 고 심으로 혈액을 운반 효율적인 심장 펌프 기능을 얻기 위해. Electrophysiological 측면에서는 atria의 중요 한 기능은 심장 리듬 조절입니다. 전기 신호 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC)와 오른쪽 아 트리 움 (RA) 사이의 교차점에 있는 부 비 동 노드에서 발생 그리고 RA와 왼쪽된 아 트리 움 (LA), 전파 atrioventricular 노드 및 그의 Purkinje 심 실 하 실시 유도 시스템입니다.
심장 리듬 장애, 부정맥, 심 방 및 심 실 그들의 기원에 따르면로 분류 됩니다. 심 방 섬유 성 연 축 (AF)은 무작위이 고 신속한 여기는 심 방의 특징, 부정맥의 가장 일반적인 지속적인된 형태 이다. 최근 유전 분석 및 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) AF와 유전자 변이 또는 monopolymorphisms,12,,34사이 협회를 보여주었다. 이러한 연구 결과 어 적어도 부분적으로 유전 원인에 연관 나타냅니다. 따라서, 그것은 유전자 조작 동물 모델을 사용 하 여 심 방에 인 자형 표현 형 상호 작용을 평가 하는 중요 한입니다. 그것은 널리는 마우스 유전자 조작에 대 한 가장 설립 된 포유동물은 허용 됩니다.
광학 매핑 기술 심장 조직의 흥분을 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 광학 매핑에 의해 murine 아 트리 움의 관찰의 상대적으로 작은 크기에 의해 방해 된다. 우리는 시간적, 공간적 고해상도 murine 아 트리 움의 상세한 평가 달성 하려고 합니다.
Protocol
이 동물 실험 승인 되었고 수행 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 도쿄 의료 및 치과 대학 규정.
1입니다. 준비
- 재고 솔루션
- 분해 전압에 민감한 염료 (디-4-ANEPPS, 및 RH237) 및 캘리포니아2 + 표시기 (로드 2 오전) 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 각각 6 m m, 10 mM, 10 mM의 농도로 재고 솔루션을 만들기 위해 함께.
- 흥분-수축 (E-C) uncoupler, blebbistatin, 50 m m 재고 솔루션을 만들고 90 %DMSO 디졸브.
- Aliquot 0.2 mL PCR에에서 재고 솔루션, 어두운 방에 튜브 하 고 산화를 피하기 위해 질소 가스를 사용 하 여 재고 튜브에 공기를 대체 합니다.
- 재고 튜브는 빛 으로부터 보호 하기 위해 개별적으로 알루미늄 호 일에 포장 하 고-20 ˚C에 그들을 저장 합니다.
- 작업 솔루션
- 준비 없이 캘리포니아2 + (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 8.0 m m 나2HPO4및 1.5 m m KH2포4, pH 7.40 NaOH에 의해 조정) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1 L
- Tyrode의 솔루션 (135 m m NaCl, 5.4 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 0.53 m m MgCl2, 0.33 m m NaH2포4, 5.5 m m D-포도 당, 및 5.0 mM HEPES, pH 7.40 NaOH에 의해 조정) 1 리터를 준비 합니다.
- 0.22 μ m 병 맨 필터와 Tyrode의 솔루션 필터 및 거품 통 기 통풍 O2 가스 실린더에 연결 하는 공기 돌을 사용 하 여 잘 그것을 공기에 쐬 십시오.
2. 광학 Langendorff 끼얹는다 마음에 매핑
- (그림 1a& b) 두 개의 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 카메라를 사용 하 여 광학 매핑 시스템 조립
- 그림 1a& b에서와 같이 광학 매핑 시스템에 CMOS 카메라, 빔 스플리터, 렌즈, 렌즈 리볼버, 광원, dichroic 거울, 필터 및 기타 부품을 조립.
- 다른 배율 (1.6 X와 5 X)를 장착 한 터렛의 대물 렌즈를 변경 하 여 확대를 선택 합니다.
참고: CMOS 센서의 크기는 10 mm × 10 mm, 100 × 100 해상도, 즉, 5 X 객관적 렌즈,이 시스템은 20 µ m 공간적 해상도 제공 합니다. - 여기 빛 530의 중심 파장으로 발광 다이오드 (LED) 램프를 사용 하 여 설정 nm, 대역 통과 필터를 통과 (520/35 nm), dichroic 거울과 반영 (560 nm).
- 기록 방출 신호는 스플리터로 나눈 (665 nm), 긴 어떤 설정 카메라 1 통과 필터 (697/75 nm) 막 전압에 민감한 염료 (디 4-ANEPPS 또는 RH237), 그리고 카메라 2 대역 통과 필터를 사용 하 여 형광을 감지 (572/28 nm) 감지는 캘리포니아2 + 표시기 (Rhod2-오전)의 신호.
- Langendorff 관류 회로 조립
- 폴 리 염화 비닐 (PVC) 튜브 연동 펌프에 연결 합니다.
- 1.2.3 단계에서 언급 한 대로 100% O2 화난 Tyrode의 솔루션으로 PVC 튜브의 입구 쪽을 넣어.
- 손으로 만든에 어 트랩, PVC 관의 방전 쪽 연결 다음 정렬 5 µ m 필터, 3 방향 stopcocks, 압력 변환기, 난방 유리 코일, 그리고 21-게이지 무딘된 바늘 (바늘 크기는 대동맥 크기에 따라 변경 가능) 순차적으로 다른 PVC 튜브를 사용 하 여.
- 회로, 어떤 기포를 방지 하는 Tyrode의 솔루션 관류 회로 심장 회로에 연결 될 때까지 중단.
- Heparinization 및 마 취
- 25 게이지 바늘과 1 mL 주사기를 사용 하 여 마우스에 intraperitoneally unfractionated 헤 파 린 (몸 무게에 200 IU)를 주입 수 있습니다.
- Anesthetize 마우스 pentobarbital (65 밀리 그램/kg)의 복 주사 하 여 10 분 후에 헤 파 린 주입.
- Cannulation 및 관류
- 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 동물 핀치 발가락에 응답의 부족에 의해 anesthetized 확인 합니다. 가 위를 사용 하 여 칼 프로세스 수준 아래 복 부 벽을 엽니다. 가로 절 개를 횡 경 막에, 마음에 어떤 손상도 없이 중간 겨드랑이 선 갈비뼈의 양쪽 모두를 잘라 만들고 앞쪽 가슴 벽 위쪽으로 플립. 심장, 뒤에 곡선된 겸 자 사전 및 하강 대동맥, 식도, 및 열 등 한 베 나 정 맥. 다음, 인접 한 혈관 및 대동맥, 폐, 기관지, 식도, 지방 조직, 및 thymus 같은 조직 함께 급속 하 게가 위로 마음을 삭제할.
- 페 트리 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL와 함께 마음을 세척 하 고 인접 한 조직을 제거.
- 오름차순 대동맥으로 관류 회로에 연결 된 21-게이지 무딘된 바늘의 팁을 소개 하 고 스레드는 stereomicroscope 아래와 그것을 해결.
- 10 분 마음 100% O2화난 Tyrode의 솔루션 perfuse를 시작 합니다.
- 증폭기와 레코더에 연결 된 압력 트랜스듀서와 관류 압력을 지속적으로 모니터링 합니다.
- 모든 다음 단계를 수행 하는 동안 (일반적으로 2-5 mL/min 흐름 속도 대 한 해당) 80-100 mmHg 사이 관류 압력을 계속.
- 얇은 폴 리 에틸렌 (PE) 관 삽입 초기 관류 (2.4.4 단계.), 동안 (외부 직경: 0.8 m m)는 SVC에 스레드 수정. 다음, 데워 진된 유리 챔버 (그림 1b& c)로 마음을 놓습니다.
- 24 게이지 내재 바늘 찔린 (외경: 0.7 m m) 아 트리 움, 어떤 손상을 방지 하 고 내부 바늘을 제거 하 심 실 정점 통해 왼쪽된 심 실 (LV) 구멍에는 라스베가스에 외부 정을 떠나
- 1 프랑스 크기 사용자 정의 만든 전극 카 테 터는 라스에 전기 자극을 수행할 SVC에서 PE 튜브를 통해 소개 필요한 경우, 심 실 서 성 대 한 우 심 실 (RV)으로 테를 사전.
- 오름차순 대동맥 (그림 1c)에 핀 전극과 cannulation 바늘 사이 지속적으로 바이 폴라 심전도 (ECG)를 기록 하 심 실 꼭대기에 핀 전극을 삽입 합니다.
- 전체 연구를 통해 심전도 관류 압력 모니터링을 계속 합니다.
- 빛을 끄고 어두운 방에서 다음과 같은 실험을 수행.
- 2.5 단계로 이동 합니다. 막 전압 또는 2.6의 단일 기록에 대 한. 막 전압 및 캘리포니아2 + 과도 듀얼 녹화에 대 한.
- 막 전압의 단일 기록에 대 한 얼룩
- 막 전압의 단일 기록에 대 한이 얼룩 프로토콜 중 37 ˚C에서가 열 관류 솔루션을 유지 관리 합니다.
- Tyrode의 솔루션 (최종 농도 5 µ M)의 10 mL와 디-4-ANEPPS 재고 솔루션 (6 m m)의 8.3 µ L를 희석.
- 2-5 분, 5 분에 대 한 Tyrode의 솔루션으로 희미하게 뒤 관류 루트를 통해 마음에 희석된 디-4-ANEPPS 솔루션의 총 볼륨 (10 mL)를 달 이다.
- Tyrode의 솔루션 (최종 농도 250 µ M)의 1 mL와 함께 blebbistatin 재고 솔루션 (50mm)의 5 µ L를 희석.
- 관류 루트를 통해 희석된 blebbistatin 솔루션의 총 금액을 관리 합니다.
- 2.6 단계를 생략 하 고 2.7 유실에 대 한 단계를 수행 하십시오.
- 막 전압 및 캘리포니아2 + 과도 듀얼 녹화에 대 한 얼룩
- 실 온에서 Tyrode의 솔루션을 유지.
참고:이 초기 설정 온도 막 전압 (2.5 단계.)의 단일 기록에 대 한 얼룩에 다릅니다. - blebbistatin 단계 2.5.4 2.5.5에서 동일한 방식으로 관리 합니다.
- 믹스 3 µ L Rhod2AM 재고 솔루션 (10 mM)의 그리고 30 µ L polyoxyethylene polyoxypropylene의 블록 공중 합체 (DMSO에 20%), F-127 Tyrode의 솔루션의 10 mL와 혼합 희석.
- Rhod2AM 솔루션 (3 µ M)의 총 금액을 로드는 blebbistatin로 동일한 경로 통해 2-5 분 이상.
- Tyrode의 솔루션의 10 mL와 함께 RH237 재고 솔루션 (10 mM)의 7 µ L를 희석.
- 희석된 RH237 솔루션 (7 µ M)의 총 금액을 관리 2-5 분 이상.
- 위의 절차의 완료, 후 열 37 ˚C에서 Tyrode의 솔루션을 시작 합니다.
- 실 온에서 Tyrode의 솔루션을 유지.
- 희미하게
- 다음 실험에 37 ˚C에서 Tyrode의 솔루션의 온도 유지.
- 과도 한 염료를 적어도 5 분 동안 Tyrode의 솔루션 마음 perfuse
참고: 단계에 밖으로이 세척 동안 흐름 속도 높일 필요가 있다 (2.4.6 단계로 참조.) - 모든 모션 아티팩트 수축, 및 perfused에 균질 얼룩의 실종을 확인 합니다.
- 샘플링 및 데이터 분석
- 커버 유리 (25 m m × 60 m m) perfused 심장에 신중 하 게, 너무 많은 기계적인 스트레스 없이 심 방 표면에 평평 하 게 놓고 모션 아티팩트는 솔루션의 진동에서 방지. 아 트리 움 적절 하 게 커버 유리에 부착을 확인 합니다.
- 레코드는 샘플링으로 CMOS 카메라에 의해 형광 속도 최대 0.1 ms 디 4-ANEPPS, 및 1 RH237 및 Rhod2AM에 대 한 ms 얼룩.
- 소프트웨어의 실제 작업에 대 한 제조업체의 지침에 따라 얻은 기록 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
- 관심, 드리프트 제거, 시간축 필터링 및 3 X 3 binning5영역 추출 후 활성화 지도 및 영화를 만듭니다.
3. electrophysiological 연구
- 서 성 전극 및 자극 기 설정
- 자극에 대 한 조직에 RA에서 주문 품 서 성 전극의 팁의 접촉을 확인 (단계 2.4.9 참조.).
- 프로그래밍 가능한 자극에 연결 하는 서 성 카 테 터에서 서 성 거 려 모든 자극을 제공 합니다.
- 서 성 임계값의 결정
- 세트 100와 150 ms (0.4 ms의 펄스 폭), 서 성 간격 피하고 어떤 본질적인 리듬 서 성 속도 능가.
- 안정적인 심 성를 적어도 20 비트에 대 한 지속적인 서 성 자극을 제공 합니다.
- 서 출력에서 설정 5 mV, 다음 안마당을 depolarize에 전달 된 서 성 실패까지 점차적으로 감소.
- 광학 녹음 하 여, 심전도 및 심 방 흥분 신호에서 P 파의 존재에 의해 심 여기를 확인 합니다.
- 최소 성 서 성 임계값으로 안마당을 depolarize 수 있는 출력을 결정 합니다.
- 두 번 서 성 임계값에서 다음과 같은 연구에 대 한 서 성 출력을 설정 합니다.
- 상수와 버스트 속도
- 99 박동에 대 한 지속적인 성 제공 150 ms에서 시작 된 서 성 간격 또는 내장 리듬을 능가 피하 긴 간격.
- 5 ms 단계, 아 트리 움의 1:1 캡처를 실패 하는 간격에 도달 될 때까지 또는 40 ms로 진보적으로 서 성 간격을 줄일 수 있습니다.
- 단일 extrastimulus 서 성
- 내장 리듬 outpaces 기본 드라이브 또는 1:1 심 방 흥분을 얻기 위해 서 성 실패 하지 않는 한 120 ms, 100 ms, 및 80 ms 기본 드라이브 (S1)의 서 성 주기 길이 설정 합니다.
- 기본적인 드라이브 기차에 대 한 10 박동 자극 성의 수를 설정 합니다.
- -10 ms 기본 사이클 길이 대 한 첫 번째 extrastimulus (S2)를 설정 합니다.
- 기본 드라이브의 마지막 서 성 자극 후 s 2를 제공 합니다.
- S2 depolarize 안마당에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계, s 2의 커플링 간격을 단축.
- 아 트리 움 depolarize 실패 긴 S2 간격으로 효과적인 내 화물 기간 (ERP)를 결정 합니다.
- ERP의 속도 적응을 평가 하기 위해 3 가지 기본 사이클 길이 ERP를 평가 합니다.
- 더블, 트리플 extrastimuli atrial tachyarrhythmias 유도를 서 성
- 없는 부정맥 관찰 하는 경우 포인트 S2 ERP 밖에 서 20 ms S2 간격 재설정.
- 추가 두 번째 extrastimulus (S3), S2로 동일한 간격으로 시작 합니다.
- S3 depolarize 안마당에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계 S2 및 S3 사이의 커플링 간격을 줄입니다.
- 포인트 10 ms ERP, 밖에 서 s 2의 간격 재설정 다음 3.5.3 단계를 반복 합니다.
- 포인트 각 ERP 밖에 서 20 ms S2 및 S3 간격을 다시 설정 합니다.
- 추가 3 extrastimulus (S4), s 3으로 동일한 간격으로 시작 합니다.
- S4 안마당을 depolarize에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계 S3 및 S4 사이의 커플링 간격을 줄입니다.
- 포인트 10 ms ERP, 외부에 S3 간격 재설정 다음 단계 3.5.7 반복.
- 포인트 10 ms ERP, 외부 S2 및 S3 간격 재설정 다음 단계 3.5.7 반복.
- 마찬가지로 프로그램 된 자극을 사용 하 여 재현할 수 유도 하 여 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility를 정의 합니다.
- 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility의 평가
- 지속적으로 모든 서 성 프로토콜 (3.3-3.5 단계.) 동안에 심전도 기록 합니다.
- 각 자극, 심 방 심 박 급진 (AT) 또는 반복적인 심 응답 (RAR)의 유도 기록 하는 동안 전후 광학 녹음을 수행 합니다.
- AF 또는 RAR 유도 하는 경우 동일한 서 성 프로토콜을 적용 하 여 재현성을 확인 합니다.
Representative Results
광학 매핑 실험 그림 1a와 같이 장치를 사용 하 여 수행 됩니다. 광학 시스템의 스키마는 그림 1b에서 나와 있습니다. 시스템 막 잠재력 및 캘리포니아2 + 안마당에 과도의 고해상도 분석을 제공합니다.
그림 1 c 와 d와 같이, 고립 된 마음 온도 제어 챔버에 배치 됩니다. 1 프랑스 크기 전극 카 테 터 삽입 SVC, PE 튜브를 통해 RA에 배치 되 고 다른 내재 PE 관을 심장 챔버에 과도 한 압력을 피하기 위해 LV 꼭대기에서 LV 구멍에 삽입 됩니다. 동시 ECG 기록에 대 한 음극 (ECG 리드 [-]) cannulation 바늘에 연결 하 고 양극 (ECG 리드 [+]) 심 실 정점에 삽입 핀 전극에 연결 합니다. 이 어셈블리의 기능에 심 방에 기계적 손상을 방지 하는.
막 전압의 평가 대 한 형광 디-4-ANEPPS를 사용 하 여 최대 10000 프레임/s의 샘플링 속도 (그림 2)와 함께 기록 됩니다. 활성화 지도 라스에서 배달 일정 성 하는 동안 얻은 고급 매핑 작은 murine atria에 상세한 전도 패턴의 분석을 수 있습니다.
그림 3 에서는 막 전압 및 캘리포니아2 + 는 라스에서 일정 성 중 RH237 및 Rhod2AM를 사용 하 여 LA에 과도의 대표적인 흔적 우리는 매핑 현재 설정을 Rhod2AM 신호의 충분 한 신호/잡음 비율을 얻기 위해 1000 프레임/s의 샘플링 속도 줄일. 그러나, 시스템 활동 전위 및 캘리포니아2 + 과도 관계를 분석 하기 위한 충분 한 품질을 제공 합니다.
우리는 다음 병 적인 상태에서 마우스를 사용 하 여 프로그램 된 자극 atrial tachyarrhythmia의 유도 수행 합니다. 그림 4 는 유도의 광학 기록 전시 murine 중앙홀에 AT 디-4-ANEPPS로 얼룩진. 마우스는 압력 과부하에 적용할 안마당 10 일전 실험6가로 대동맥 수축 절차를 거칩니다. 우리는 트리플 extrastimuli (120/100/100/80), 서 성 여 AT를 유발 하 고 재진입 회로의 전파를 관찰.
그림 1입니다. 광학 매핑 시스템. a. 전기 생리학/광학 매핑 시스템의 일반 어셈블리입니다. b. 회로도 광학 매핑 시스템의 구성: 파란색 화살표는 광원에 의해 생성 된 여기 빛 나타냅니다. 포대와 대물 렌즈를 교환할 수 있습니다. 얼룩진된 마음에서 내보낸된 빛 카메라 1 카메라 2 사이 분할 됩니다. 막 전압에 대 한 긴 파장 신호를 탐지 하는 카메라 1 고 카메라 2 Ca2 + 과도 대 한 대역 통과 필터 580 ± 20 nm의 파장을 기록 한다. 절차 동안, ECG 및 관류 압력은 지속적으로 기록 하 고 ECG 신호는 또한 동시에 레코딩 소프트웨어 광학 지도에 가져올. c. 준비의 고립 된 마음: 마음은 관류에 대 한 오름차순 대동맥을 통해 무딘 바늘 cannulated. 동시 심전도 기록에 대 한 음극 cannulation 바늘에 연결 하 고 핀 전극으로 양극 심 실 정점에 삽입 됩니다. d. Cannulation 튜브와 전극: 심장 관류 (cannulation 바늘)에 대 한 21-게이지 무딘 바늘 cannulated. 전극 (전극)을 자극 하는 1-프랑스 크기 뛰어난 베 나 정 맥에 삽입 하는 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 오른쪽 아 트리 움에 배치 됩니다. 유리 챔버는 챔버의 캐비티에 순환 온수 물으로 37 ˚C에 예 열. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 안마당에서 활성화 지도. 5 X 렌즈, 및 b. 앞쪽 보기 a. 대표적인 활성화 지도 1.6 X 객관적 렌즈 후부 보기에서 (왼쪽 패널) 격리 된 마음과 아 트리 움의 회로도 (오른쪽 패널) 활성화 지도 왼쪽된 아 트리 움의 디-4-ANEPPS 10000 프레임/s에서 얼룩을 얻을. 녹음은 오른쪽 아 트리 움에 배치 하는 자극 전극과 일정 속도에서 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 활동 전위 및 좌 심에서 Ca2 + 과도 듀얼 녹화. a. 격리 된 심장의 도식. b. Ca2 + 과도 막 전압 (Vm) 및 Rhod2AM RH237를 사용 하 여 왼쪽된 안마당에서 형광의 강도의 대표 이미지. 녹음 1000 프레임/s. c. 에서 5 배 목표 렌즈를 사용 하 여 수행 오른쪽 아 트리 움의 자극 전극으로 서 일정 기간 동안 ECG (맨 위), RH237 신호 (중간), 그리고 Rhod2AM 신호 (아래)의 동시 녹음. 검정색 화살표는 자극 스파이크, 그리고 노란색 화살표 심 실 흥분을 나타냅니다. 심 실에서 산란 효과 또한 볼 수 있습니다 (노란색 화살표) 모두 RH237 신호와 Rhod2AM 신호에. d. 는 병합 된 RH237 및 Rhod2AM 추적입니다. 활동 전위 및 과도 Ca2 + 변화 동시에 기록 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 심 방 심 박 급진 동안 정품 인증 매핑. (왼쪽 패널) 격리 된 심장의 회로도 (중간 패널) 동안에 심 방 심 박 급진 (AT) 지도 활성화. AT는 오른쪽 아 트리 움에서 배달 트리플 extrastimuli 서 성에 의해 유발 되었다. (오른쪽 패널) 부 비 동 리듬 같은 마우스 마음에 동안 활성화 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1. 디-4-ANEPPS로 얼룩을 사용 하 여 안마당에 잠재적인 막의 대표적인 영화. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2. 심 방 심 박 급진 및 부 비 동 리듬 동안 정품 인증 매핑의 대표적인 영화. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
광학 매핑 심장 전기 생리학7공부에 대 한 확고 책략 이며 심 실 부정맥8,9, 뿐만 아니라 심 방 들을 평가 하는 매우 유용한 도구10,11 . 막 횡단 잠재력 및 캘리포니아2 + 과도 동시 매핑 심장 마비 및 다른 심장 질환12,13관련 된 부정맥의 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 유용 합니다. 단일 셀 또는 셀 시트를 사용 하 여 같은 다른 electrophysiological 평가 방법 비교 perfused 마음에 광학 매핑의 절대 우월 중 하나입니다 그대로 중앙홀에 전도 패턴의 평가 심 실, 부정맥14를 유도 하는 부 비 동 리듬 중 뿐만 아니라 중. 그러나 Murine 마음, 특히 아 트리 움, 인간의 대리로 서 활용 하는 시도 그들의 작은 크기 때문에 주로 어려움 발생 했습니다, 그리고, 마우스는 유전자 조작 동물에 평가 측면에서 매력적인 실험 모델 모델, 그리고이 문제는 극복 되어야 한다. 우리의 방법은 그것을 해결 하기 위해 한 방향으로 제공 합니다.
비록 우리의 광학 매핑 장치 전체 murine 마음15기존의 시스템에 기본적으로 유사 했다, 우리의 메서드는 murine 안마당을 일부 수정 하 여 평가의 이점이 있다. 첫째, 우리는 최대 0.1 ms/프레임 및 20 µ m/픽셀, 그리고이 고해상도 매핑 murine 안마당에서 전도 속도 및 전파 패턴의 더 정확한 측정에 기여의 높은 공간과 시간 해상도를 추구. 둘째, 불필요 한 기계적 손상이 나 electrophysiological 속성 16,17변경 수, 아 트리 움의 스트레치를 피하기 위해 내재 바늘 내부 챔버 압력을 줄이기 위해 라스베가스에 직접 삽입 됩니다. 이전에 수행 하는 라를 통해 삽입 하는 대신 연구15. 또한, 서 성 자극, RA에 주문 품된 1-프랑스 크기 전극 카 테 테 르 통해 전달 하지만 하지 바늘 전극에 의해는 아 트리 움 손상 수 있습니다. 어떤 핀은 지난 연구15에 사용 했다는 심 돌출부를 해결에 피 한다. 셋째, 평가 부정맥의 기본 메커니즘의 측면에서 atrial tachyarrhythmias 유도 프로그램된 자극 프로토콜은 중요 한18,19입니다. 우리 임상 electrophysiological 연구, 버스트 속도 트리플 extrastimuli 마우스 마음에 대 한 서 성 간격의 수정, 서 성까지 프로그램된 자극 동일을 수행 합니다. 따라서, 초기 측정 매개 변수 외에 프로토콜 AT의 inducibility 평가 수 있습니다. 필요할 때, AT의 inducibility isoproterenol 또는 다른 약물의 관리와 평가 이다. 우리의 경험 야생-타입 마우스는 거의 전체 자극 프로토콜 후에 어떤 ATs 보여. 따라서,의 inducibility 유전자 돌연변이, 수술, 약11의 관리 등 여러 가지 병 적인 조건에의 기여를 평가 하기 위한 중요 한 정보 이어야 한다. 이러한 수정 사항을 그대로 murine 중앙홀에 정확한 electrophysiological 평가 최적화 수 있습니다.
또한이 메서드는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 최대 공간 해상도 5 배 목표 렌즈를 사용 하는 아 트리 움의 한 부분에 국한 시야 (FOV) (즉.에 표시 된 그림 2a로 왼쪽된 심 방 돌출부). 아 트리 움의 더 큰 시야를 얻기위한, 1.6 X 목표 렌즈는 때로는 바람직합니다 (그림 2b). 둘째, 핀 안마당을 고정 하지 않고 가끔은 심 방 전도 속성을 올바르게 측정 하기 어려운 심 방 표면이 곡선 이기 때문에. 그래서, 우리는 핀으로 고정 하는 대신 그것을 버리고 그것의 표면에 커버 유리를 배치. 이 방법은 또한 솔루션의 진동에서 모션 아티팩트를 방지 하기 위한 도움이 됩니다. 셋째, 우리의 방법으로, 그것은 그것의 전체 FOV를 꽤 어려운 그래서, 앞쪽 및 후부 보기를 제대로 사용 하려면 그림 2와 같이 다른 접근 보다 우리의 접근 방식에 더 중요 하다. 이전 보기를 이용 병 적인 조건, 특히 돌출부 (그림 4)에 경우 재입국의 명확한 관찰 될 것 이다. 다른 한편으로, 후부 보기 심 방 후 벽의 좋은 볼을 얻기의 이점이 있다 고 트리거링 심근 소매 활동의 상세한 기록 될 수도 있습니다. 때 그것은 적절 한 보기를 얻을 우리의 방법으로 곡선된 표면 평평 어렵습니다, 아 트리 움 핀에 의해 최소한의 긴장으로 해결할 수 있습니다.
우리의 방법으로, 얼룩, 서 성, 그리고 부정맥 유도의 실패 3 가능한 문제 있다. 얼룩, 없는 경우의 오류에 대 한 또는 약간의 형광 관찰, 여부 광학 매핑 장치는 올바르게 조립, 그리고 시 적절 하 게 저장 및 사용 여부를 확인 해야 합니다. 관류 솔루션의 조건 또한 중요 한는 또한 자체, 그래서, pH, 온도를 포함 한 솔루션의 상태는 심장의 electrophysiological 속성 영향을 줄 수 이며 충분 한 통 기 통풍 엄격 하 게 모니터링 하는 여부. 그것은 또한 마음에 어떤 어 혈을 방지 하는 것이 중요입니다. 실패 속도 대 한 서 성 자극 아 트리 움, 흥분 수 없습니다 하는 경우 연구원은 확인 해야 배선 회로 시험기를 사용 하 여 정확한 인지 합니다. 서 성 자극은 올바르게 출력 하 고, 문제는 조직와 전극의 접촉 이다. 전극의 위치 문제를 해결할 수 있습니다 그리고 우리의 접근 서 성 카 테 터를 사용 하 여 쉽게. 부정맥 유도, 어려움에 대 한 계 서는 일부 제한 된 경우에는의 유도 대 한 사용할 수 있습니다. 원심 두 전극과 인접 전극 수에 위치할 RV 및 RA, 각각 quadripolar 전극 카 테 터를 사용 하 여, 그것은 쉽게 RV에 RA에서 서 성 사이트를 변경 하려면 이 카 테이 터 동시 심 실 활성화 신호 마스크 심 방 흥분 신호 때 이동 하는 심 실 흥분에도 유용 합니다.
이 방법은 기여할 것입니다 유전자 표현 형을 평가 하는 AF에서 상호 작용 관련 유전자 유전자는 다른 방법으로 그들을 표시 조사 실패에 대 한 특히 GWAS, 같은 소설 연구에 의해 새로 발견. 장치 및 기술 진보와 함께이 방법을 그대로 마음에 어20의 중요 한 소스는, 폐 정 맥 소매의 electrophysiological 속성을 평가 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 지원 프로그램에 의해 연구 환경 개선에 대 한 특별 조정 자금에서 젊은 연구자에 대 한 홍보 과학 및 기술 (SCF) (T.S.)를, 보조금에 대 한 과학적 연구 (제 16 K 09494, T.S., No. 26293052, T.F.)를 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의. 부탁 드립니다 Brainvision 및 씨 켄 지 Tsubokura 기술 지원에 대 한 그리고 우리는 또한 그의 언어 지원에 대 한 씨 존 마틴을 감사 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
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