Summary
Denne protokollen beskriver elektrofysiologiske evaluering av murine atria bruker en optisk kartsystem med en høy timelige og romlig oppløsning, inkludert to innspillinger av membran spenning og Ca2 + forbigående under programmert stimulering gjennom et kateter, spesialiserte elektroden.
Abstract
Genomet hele association-studier som målretting atrieflimmer (AF) har vist en sterk sammenheng mellom genotype og elektrofysiologiske fenotypen i atria. Som oppfordrer oss til å utnytte en genmodifiserte musemodell for å belyse mekanismen av AF. Det er imidlertid vanskelig å vurdere elektrofysiologiske egenskapene i murine atria på grunn av sin lille størrelse. Denne protokollen beskriver elektrofysiologiske evaluering av atria bruker en optisk kartsystem med en høy timelige og romlig oppløsning i Langendorff perfused murine hjerter. Optisk representasjon er montert med dobbelt høyhastighets complementary metal Oxice semiconductor kameraer og forstørring målet linser, å oppdage fluorescens spenning-sensitive fargestoff og Ca2 + indikator. For å fokusere på vurdering av murine atria, utføres optisk kartlegging med et areal på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med 100 × 100 oppløsning (20 µm/bildepunkt eller 100 µm/bildepunkt) og samplingsfrekvens på opptil 10 kHz (0,1 ms) ved maksimal. En 1-fransk størrelse quadripolar elektrode pacing kateter plasseres i høyre atrium gjennom den overlegne vena cava unngå mekanisk skade atrium, og pacing stimulering leveres gjennom kateter. En elektrofysiologiske studie utføres med programmert stimulering inkludert konstant pacing, brast pacing, og tre extrastimuli pacing. Under spontane eller pacing rytme, registrert optisk tilordningen handling potensial varighet, aktivisering kart, ledning hastighet og Ca2 + forbigående enkeltvis i de høyre og venstre atria. I tillegg bestemmer programmert stimulering også inducibility av atrial tachyarrhythmias. Presis aktivisering tilordningen utføres for å identifisere utbredelsen av magnetisering i atriet under en indusert atrial tachyarrhythmia. Optisk kartlegging spesialiserte omgivelser gjør en grundig elektrofysiologiske evaluering av atriet i murine patologisk modeller.
Introduction
Hjertet består av 4 kamre i pattedyr. Øvre kinesere er atria lavere seg er ventriklene. Ventriklene fungere som en pumpe å kaste ut blod til systemisk eller lunge sirkulasjon. Atria får blodet returnerer fra systemisk eller lunge venene og hjelpe transport blod i ventriklene å få en effektiv cardiac pumpe funksjon. Fra en elektrofysiologiske aspektet er atria viktig funksjon å regulere hjerterytmen. De elektriske signalene kommer fra noden sinus ligger i krysset mellom overlegen vena cava (SVC) og høyre atrium (RA), deretter overføres til RA og venstre atrium (LA), og gjennomføre til ventrikkel gjennom atrioventricular node og hans-Purkinje ledning system.
Arytmier, som hjerte rytme lidelser, klassifiseres i atrial og ventrikkel i henhold. Atrieflimmer (AF) er den vanligste vedvarende en arytmi, preget av en tilfeldig og rask magnetisering av atria. Siste genetiske analyser og genom hele association studier (GWAS) har vist tilknytningen mellom AF og genetiske mutasjoner eller monopolymorphisms1,2,3,4. Disse funnene tyder AF er minst delvis forbundet med en genetisk årsak. Derfor er det avgjørende å vurdere genotype-fenotypen samhandlinger i atria ved hjelp av genmodifiserte dyr modell. Det er allment akseptert at musen er det mest etablerte pattedyret for genetisk modifisering.
Den optiske kartlegging teknikken som er utviklet for å evaluere magnetisering av hjertet tissue. Imidlertid er observasjon av murine atrium by optisk kartlegging hindret av den relativt lille størrelsen. Vi prøver å oppnå en detaljert vurdering av murine atrium med høy timelige og romlig oppløsning.
Protocol
Dette dyr eksperimentet ble godkjent og utført under regulering av institusjonelle Animal Care og bruk komité for Tokyo medisinsk og Dental University.
1. forberedelse
- Lager løsninger
- Oppløse spenning-sensitive fargestoffer (di-4-ANEPPS og RH237) og Ca2 + indikator (Rhod-2 er) med 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) å lager løsninger med konsentrasjoner av 6 mM 10 mM og 10 mM, henholdsvis.
- Oppløse eksitasjon-sammentrekning (E-C) uncoupler, blebbistatin, med 90% DMSO å gjøre en 50 mM lagerløsning.
- Aliquot lager løsninger i en 0,2 mL PCR rør i et mørkt rom, og erstatte luften i lager røret ved hjelp av nitrogen gass for å unngå oksidering.
- Pakk lager rør i aluminiumsfolie for beskyttelse mot lyset, og lagre dem på-20 grader.
- Arbeider løsninger
- Forberede 1 L fosfat bufret saltoppløsning (PBS) uten Ca2 + (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.0 mM Na2HPO4og 1,5 mM KH2PO4, pH 7.40 justert av NaOH)
- Forberede 1 L Tyrodes løsning (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 D-glukose og 5.0 mM HEPES, pH 7.40 justert av NaOH).
- Filtrere Tyrodes løsning med filtere 0.22 µm flaske topp og aerate det. godt av boble lufting bruker en luften sten koblet til en O2 gass-sylinder.
2. optisk kartlegging i Langendorff-perfused hjerter
- Montere den optiske kartsystem med to complementary metal Oxice semiconductor (CMOS) kameraer (figur 1a& b)
- Sett sammen det CMOS-kamera, strålen splitter, målet linser, linsen revolver, lyskilden, dichroic speil, filtre og andre deler til den optiske kartsystem som vist i figur 1a& b.
- Velg forstørrelsen ved å endre målet objektivet i et tårn, utstyrt med ulike forstørrelser (1.6 X og 5 X).
Merk: Størrelsen på CMOS-sensor er 10 mm × 10 mm, med 100 × 100 oppløsning, som betyr, med 5 X linsen, dette systemet gir en 20 µm romlig oppløsning. - Angi eksitasjon lys med en lysdiode (LED)-lampe med en center bølgelengde på 530 nm, gikk gjennom et bånd-pass filter (520/35 nm), og med dichroic speil (560 nm).
- Posten utslipp signalet delt en splitter (665 nm), i hvilket innstillingen kamera 1 med en lang høypassfilteret (697/75 nm) oppdager fluorescens benytter en membran spenning-sensitive fargestoff (di 4-ANEPPS eller RH237), og kameraet 2 med et bånd-pass filter (572/28 nm) oppdager den signalet av Ca2 + indikatoren (Rhod2-AM).
- Montere Langendorff perfusjon krets
- Fest polyvinylklorid (PVC) rør til en peristaltiske pumpe.
- Inn Tyrodes løsning karbonisert med 100% O2 som nevnt i trinn 1.2.3 inntaket av PVC-rør.
- Koble utslipp siden PVC-rør til en hånd-laget luft felle, deretter ordne på 5 µm filter, tre-veis stopcocks, trykktransduceren, glass coil, og 21-gauge avstumpet p (pinne nr er foranderlig i henhold til aorta størrelsen) sekvensielt , bruker andre PVC-rør.
- Fyll perfusjon krets med Tyrodes løsning unngå eventuelle luftbobler i krets, og stoppe strømmen før hjertet er koblet til kretsen.
- Heparinization og anestesi
- Injisere unfractionated heparin (200 IE, uavhengig av kroppsvekten) intraperitoneally i en mus med 25-gauge nål og 1-mL sprøyte.
- Bedøve musen ved en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (65mg/kg) 10 min etter heparin injeksjon.
- Cannulation og perfusjon
- Plass musen i supine posisjon. Bekreft dyr er anesthetized av mangel på respons til tå knipe. Åpne bukveggen toppnivå xiphoid prosessen med saks. Gjøre en tverrgående snitt i mellomgulvet, kuttet begge sider av ribbeina på medial axillaris linjen uten skade hjertet og vende fremre brystveggen oppover. Fremme buet tang bak hjertet, og holde synkende aorta, spiserøret og mindreverdig vena cava. Deretter avgiftsdirektoratet hjertet med saks raskt med tilstøtende fartøy og vev, som aorta, lunger, luftrøret, spiserøret, liggende under adipose vev og thymus.
- Legg hjertet med 10 mL iskald PBS i en Petriskål, og fjerne den tilstøtende vev.
- Introdusere spissen av 21-gauge avstumpet nålen koblet perfusjon krets aorta stigende, og fikse det med tråden under en stereomicroscope.
- Start perfuse hjertet i 10 minutter med Tyrodes løsning karbonisert med 100% O2.
- Overvåke perfusjon trykket kontinuerlig med trykktransduceren koblet til forsterker og opptaker.
- Holde perfusjon presset mellom 80-100 mmHg (vanligvis tilsvarende 2-5 mL/min for flyt) i alle de følgende trinnene.
- Under den første perfusjonen (trinn 2.4.4.), setter du inn den tynne polyetylen rør (ytre diameter: 0,8 mm) i SVC, og fikse det med en tråd. Deretter plassere hjertet i oppvarmet glass kammeret (figur 1b& c).
- Punktering en 24-gauge iboende nål (ytre diameter: 0,7 mm) inn i venstre ventrikkel (LV) hulrommet gjennom ventrikkel apex å unngå skade på atrium, og fjerne indre nålen forlater den eksterne kanyle i LV.
- Innføre en 1-fransk størrelse tilpasset laget elektrode kateter gjennom PE røret i SVC å utføre elektrisk stimulering i RA. Hvis nødvendig, fremme kateter i høyre ventrikkel (RV) for ventrikkel pacing.
- Sett inn en pin elektrode i ventrikkel apex kontinuerlig registrere de bipolare elektrokardiogram (ECG) mellom pin elektroden og cannulation nålen i stigende aorta (figur 1 c).
- Fortsette overvåking ECG og perfusjon presset gjennom hele studiet.
- Slå av lyset, og utfør følgende eksperimentet i et mørkt rom.
- Gå til trinn 2.5. for en enkelt innspilling av membran spenning eller 2.6. for en dobbel innspilling av membran spenning og Ca2 + forbigående.
- Flekker for en enkelt innspilling av membran spenning
- Opprettholde perfusjon løsningen oppvarmet på 37 grader i denne fargeprotokoll for en enkelt innspilling av membran spenning.
- Fortynne 8.3 µL av di-4-ANEPPS lager løsningen (6 mM) med 10 mL Tyrode's (siste konsentrasjonen er 5 µM).
- Tilfører det totale volumet (10 mL) av fortynnet di-4-ANEPPS løsningen i hjertet via perfusjon ruten for 2-5 min, etterfulgt av en utvasking med Tyrodes løsning for 5 min.
- Fortynne 5 µL av blebbistatin lager løsningen (50 mM) med 1mL Tyrode's (siste konsentrasjonen er 250 µM).
- Administrere den totale mengden utvannet blebbistatin løsningen via perfusjon rute.
- Hoppe over trinnet 2.6 og fortsetter til trinn 2.7 for bleke.
- Flekker for en dobbel innspilling av membran spenning og Ca2 + forbigående
- Hold den Tyrode løsningen ved romtemperatur.
Merk: Denne første innstillingen av temperaturen er forskjellig fra flekker for en enkelt innspilling av membran spenning (trinn 2.5.). - Administrere blebbistatin på samme måte som i trinn 2.5.4 og 2.5.5.
- Mix 3 µL Rhod2AM lager løsning (10 mM) 30 µL av polyoxyethylene-polyoxypropylene blokkere copolymer F-127 (20% i DMSO) og fortynne blandingen med 10 mL Tyrode's.
- Laste den totale mengden Rhod2AM løsning (3 µM) over 2-5 minutter via samme rute som blebbistatin.
- Fortynne 7 µL RH237 lager løsning (10 mM) med 10 mL Tyrode's.
- Administrere den totale mengden utvannet RH237 løsningen (7 µM) over 2-5 minutter.
- Etter ferdigstillelse av det over fremgangsmåten, begynne å varme den Tyrode løsning på 37 grader.
- Hold den Tyrode løsningen ved romtemperatur.
- Bleke
- Holde temperaturen på Tyrodes løsning på 37 grader i følgende eksperimentet.
- Perfuse hjertet med Tyrodes løsning for minst 5 min å vaske ut de overdreven fargestoffer.
Merk: Det er ikke nødvendig å øke flyt under denne vask ut trinn (se trinn 2.4.6.) - Bekreft forsvinningen av noen bevegelse gjenstand sammentrekninger og den homogen flekker i perfused hjertet.
- Prøvetaking og dataanalyse
- Sett dekselet glasset (25 mm × 60 mm) på perfused hjertet nøye, for å flate atrial overflaten uten for mye mekanisk stress, og hindre bevegelse gjenstand fra vibrasjoner av løsningen. Bekreft at atrium festes til dekket glasset riktig.
- Registrere fluorescens av CMOS-kamera med et utvalg rate til 0,1 ms for di 4-ANEPPS og 1 ms for RH237 og Rhod2AM flekker.
- Analysere innhentet opptakene ved hjelp av analyse programvare, i henhold til produsentens instruksjoner for operasjonen av programvaren.
- Opprette en aktivisering kart og film etter utpakking regionen interesse, drift fjerning, timelige filtrering og 3 X 3 binning5.
3. elektrofysiologiske studie
- Angi pacing elektroder og stimulator
- Bekrefte kontakt av spissen av skreddersydde pacing elektroden i RA til vev for stimulering (se trinn 2.4.9.).
- Levere alle pacing stimuli fra pacing kateter koblet til programmerbare stimulator.
- Fastsettelse av pacing terskelen
- Sett pacing intervallet mellom 100 og 150 ms (pulsbredde på 0,4 ms), unngå noen iboende rytme outpacing pacing hastigheten.
- Lever konstant pacing stimulering for minst 20 beats å få en stabil atrial pacing.
- Angi pacing utgang på 5 mV, deretter gradvis redusere det til de leverte pacing unnlater å depolarize atrium.
- Bekreft atrial magnetisering av tilstedeværelsen av P bølger EKG og/eller en atrial eksitasjon signalet ved optisk innspillingen.
- Bestem minimum pacing avgang som kunne depolarize atrium som pacing grensen.
- Angi pacing utdata for følgende på to ganger pacing terskelen.
- Konstant og burst pacing
- Leverer konstant pacing for 99 beats, med et pacing intervall fra 150 ms eller lengste intervallet som unngår outpacing iboende rytmen.
- Redusere pacing intervallet gradvis med 5 ms trinn ned 40 ms eller til nådde intervallet som ikke klarer å få 1:1 fangst av atrium.
- Enkelt extrastimulus pacing
- Angi pacing syklus lengden av den grunnleggende (S1) 120 ms, 100 ms og 80 ms hvis iboende rytmen overgår grunnleggende stasjonen eller pacing unnlater å få 1:1 atrial eksitasjon.
- Angi antall pacing stimuli til 10 beats for grunnleggende drivverket.
- Angi det første extrastimulus (S2)-10 ms for grunnleggende syklusen lengden.
- Levere S2 etter siste pacing stimulans av grunnleggende stasjonen.
- Forkorte koblingen tidsintervallet S2 gradvis med 5 ms trinn til S2 fikk ikke depolarize atrium.
- Bestemme effektiv ildfast periode (ERP) som det lengste S2 intervallet som ikke klarer å depolarize atrium.
- Evaluere ERP med minst 3 forskjellige grunnleggende syklus lengder for å vurdere hastighet tilpasning av ERP.
- Dobbel og trippel extrastimuli pacing for å indusere atrial tachyarrhythmias
- Tilbakestille S2 intervallet til et punkt 20 ms utenfor ERP S2 hvis ingen arytmi er observert.
- Legge til en andre extrastimulus (S3), starter med det samme intervallet som S2.
- Redusere kopling intervallet mellom S2 og S3 gradvis med 5 ms trinn til S3 ikke depolarize atrium.
- Tilbakestille tidsintervallet S2 til et punkt 10 ms utenfor ERP og deretter gjenta trinn 3.5.3.
- Tilbakestille S2 og S3 intervallene til poeng 20 ms utenfor hver ERP.
- Legge til en tredje extrastimulus (S4), starter med det samme intervallet som S3.
- Redusere kopling intervallet mellom S3 og S4 gradvis med 5 ms trinn til S4 ikke depolarize atrium.
- Tilbakestille S3 intervallet til et punkt 10 ms utenfor ERP og deretter gjenta trinn 3.5.7.
- Tilbakestille S2 og S3 intervallene til punkt 10 ms utenfor ERP og deretter gjenta trinn 3.5.7.
- Definere inducibility for atrial tachyarrhythmias av reproduserbar induksjon med tilsvarende programmert stimuli.
- Evaluering av inducibility av atrial tachyarrhythmias
- Kontinuerlig ta et EKG opptak under alle pacing protokoller (trinn 3.3-3,5.).
- Utføre optisk opptak under og etter hver stimulering, registrere induksjon av en atrial takykardi (AT) eller repeterende atrial svar (RAR).
- Bekreft reproduserbarhet ved å bruke samme pacing protokoll når AF eller en RAR er indusert.
Representative Results
Optisk kartlegging eksperimenter utføres ved hjelp av enhetene som vist i figur 1a. Skjemaet for optiske systemet er illustrert i figur 1b. Systemet gir en høy oppløsning analyse av membran potensial og Ca2 + forbigående i atriet.
Som avbildet i figur 1 c og d, er isolerte hjertet plassert i en temperaturkontrollert kammer. En 1-fransk størrelse elektrode kateter plasseres i RA gjennom en PE rør inn i SVC, og en annen iboende PE tube settes inn i LV hulrommet fra LV apex å unngå overdreven trykk på hjertet kammeret. For en samtidige EKG-opptak, katoden (ECG bly [-]) er koblet til cannulation nålen, og anoden (ECG bly [+]) er koblet til pin elektroden inn ventrikkel apex. Funksjonen i denne samlingen er å unngå atria mekanisk skade.
For evalueringen av membran spenning registreres fluorescens bruker di-4-ANEPPS med opptil en 10.000 bilder/s samplingsfrekvens (figur 2). Aktivisering kartet oppnås under konstant pacing levert fra RA. Fin tilordningen kan analyse av detaljert ledning mønster i små murine atria.
Figur 3 viser representant spor av membran spenninger og Ca2 + forbigående i LA bruker RH237 og Rhod2AM under konstant pacing fra RA. Vi redusere samplingsfrekvensen tilordnet til 1000 rammens/s å få en tilstrekkelig signal/støy-forhold av Rhod2AM med innstillingen finnes. Systemet gir imidlertid en tilstrekkelig kvalitet for å analysere forholdet mellom action potensialet og Ca2 + forbigående.
Vi så utføre en induksjon av en atrial tachyarrhythmia med programmert stimulering bruke mus under en patologisk tilstand. Figur 4 utstillinger en optisk opptak av en indusert på i et murint atrium beiset med di-4-ANEPPS. Musen gjennomgår en tverrgående aorta innsnevring prosedyre for å bruke et press overbelastning på atrium 10 dager før eksperimentet6. Vi induserer AT av trippel extrastimuli pacing (120/100/100/80), og observere utbredelsen av innkommende krets.
Figur 1. Optisk kartsystem. a. generalforsamlingen av elektrofysiologi/optisk representasjon. b. skjematisk av sammensetningen av optisk representasjon: den blå pilen viser magnetisering lys generert av lyskilden. Linsen kan utveksles med dreieskiven. Slippes ut lyset fra farget hjertet er delt mellom kamera 1 og kameraet 2. Kamera 1 oppdager lang bølgelengde signalene for membran spenningen og kameraet 2 poster bølgelengdene med et båndpassfilter av 580 ± 20 nm for Ca2 + forbigående. Under prosedyren ECG og perfusjon trykket registreres kontinuerlig og EKG-signalet er også samtidig importert inn optisk innspillingen programvare. c. tilberedning av isolerte hjerter: hjerter er cannulated med en avstumpet nål via stigende aorta for perfusjon. Samtidige ECG opptak, katoden er koblet til cannulation nålen og anoden med pin elektroden settes inn i ventrikkel apex. d. Cannulation rør og elektrodene: hjertet er cannulated med en 21-gauge avstumpet nål for perfusjon (cannulation p). En 1-fransk størrelse stimulere elektrode (elektrode) plasseres i høyre atrium gjennom en polyetylen rør inn den overlegne vena cava. Glass kammeret varmet på 37 grader av oppvarmet vann sirkulerer i hulrom i kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Aktivisering kart i atriet. a. representant aktivisering kart i fremre visningen med 5 X linsen og b. i den bakre visningen med en 1,6 X linsen. (Venstre panel) Skjematisk av isolerte hjertet og atrium. (Høyre panel) Aktivisering kart over venstre atrium oppnådd med di-4-ANEPPS flekker på 10.000 bilder/s. Innspillingen utføres under konstant pacing med stimulerende elektroden plassert i høyre atriet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dobbel innspillingen av action potensialet og Ca2 + forbigående i venstre atrium. a. skjematisk av isolerte hjertet. b. representativt bilde av intensiteten av fluorescens i venstre atrium bruker RH237 for membran spenningen (Vm) og Rhod2AM for Ca2 + forbigående. Innspillingen er utført med en 5 X linsen på 1000 rammer/s. c. Samtidig innspillingen av ECG (øverst), RH237 signal (midten) og Rhod2AM signal (nederst), under konstant pacing med stimulering elektroden i høyre atriet. Svarte pilene angir stimulering pigger, og gule piler ventrikkel magnetisering. En lysspredning effekt fra ventrikkel kan også observeres (gul pilspisser) både i RH237 signalet og Rhod2AM signal. d. flettede RH237 og Rhod2AM spor. Handlingen potensialet og forbigående Ca2 + endringene registreres samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Aktivisering kartlegging under atrial takykardi. (Venstre panel) Skjematisk av isolerte hjertet. (Midten panel) Aktivisering kart under en atrial takykardi (AT). AT ble indusert ved trippel extrastimuli pacing levert fra høyre atriet. (Høyre panel) Aktivisering kart under sinus rytmen i samme musen hjertet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Sekvenser komplementære filmen 1. Representant film av membranen i atriet med flekker med di-4-ANEPPS. Klikk her for å laste ned denne filen.
Sekvenser komplementære filmen 2. Representant filmer av aktivisering tilordningen under atrial takykardi og sinus rytme. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Optisk kartlegging er et veletablert manøvrere for å studere cardiac elektrofysiologi7, og er et nyttig verktøy for å vurdere ikke bare ventrikulær arytmi8,9, men også atrial de10,11 . Samtidige tilordning av transmembrane potensial og Ca2 + transienter er nyttig for å forstå de underliggende mekanismene arytmi hjertesvikt og andre hjertesykdommer12,13. Når du sammenligner de andre elektrofysiologiske vurdering metodene, som de som bruker en enkelt celle eller cellen ark, en av de absolutte superiorities av optisk kartlegging i perfused hjertet er vurdering av ledning mønster i intakt atriet og ventrikkel, indusert ikke bare under sinus rytme, men også under arytmi14. Et forsøk på å utnytte murine hjerter, spesielt atrium, som et surrogat av mennesker har oppstått problemer med hovedsakelig på grunn av sin lille størrelse, men musen er en attraktiv eksperimentell modell i vurderingen i en genmodifiserte dyr modell, og problemet må overvinnes. Vår tilnærming gir en retning for å løse den.
Selv om vår optisk kartlegging apparater var i utgangspunktet lik konvensjonelle systemet for hele murine hjerter15, har våre metoden fordelen av å vurdere murine atriet ved å gjøre noen endringer. Først fulgte vi for å få en høy romlig og tidsmessige oppløsning til 0,1 ms/ramme og 20 µm/bildepunkt og denne høyoppløselig tilordningen bidratt til en mer presis måling av varmeledning hastighet og forplantning mønsteret i murine atriet. Andre for å unngå unødvendige mekanisk skade eller strekning av atrium, som kan endre elektrofysiologiske egenskaper 16,17, settes en iboende nålen direkte inn LV å redusere intra-kammer trykk, i stedet for å sette det gjennom LA som utføres i forrige studere15. Videre pacing stimulans leveres gjennom en tilpasset gjort 1-fransk størrelse elektrode kateter plasseres i RA, men ikke av en pinne elektrode, som kan skade atriet. Noen pinner unngås i innfesting atrial appendage, som ble brukt i tidligere studier15. Tredje i vurdering av den underliggende mekanismen av arytmi er programmert stimulering å indusere atrial tachyarrhythmias en avgjørende18,19. Vi utfører programmert stimulering identisk i kliniske elektrofysiologiske studier, inkludert burst pacing og trippel extrastimuli pacing, med en endring av pacing intervallet for musen hjertet. Således, i tillegg til planlagte måling parameterne, protokollen kan vurdere inducibility av AT. Ved behov, vurderes inducibility av AT med administrasjonen av isoproterenol eller andre stoffer. I vår erfaring viser det vill-type mus knapt noen ATs selv etter en full stimulering protokoll. Dermed bør inducibility av AT være viktig informasjon for å vurdere bidrag av flere pathological betingelser som genetiske mutasjoner, kirurgiske prosedyrer og administrasjon av narkotika11. Disse endringene kan optimalisere presis elektrofysiologiske vurdering i intakt murine atriet.
Denne metoden har også noen begrensninger. Først bruker maksimal romlig oppløsning med en 5 X linsen, synsfelt (FOV) er begrenset til en del av atrium (dvs. bare venstre atrial appendage som vist i figur 2a). For å få den større FOV av atrium, er en 1,6 X linsen ofte å foretrekke (figur 2b). Andre uten feste atriet med pinner, er noen ganger det vanskelig å måle egenskapene atrial ledning riktig, fordi atrial overflaten er buet. Så plassert vi dekket glasset på overflaten å flate det istedet for bestemmer det av pinnene. Denne metoden er også gunstig for å forebygge bevegelse gjenstand fra vibrasjoner av løsningen. Tredje vår metoden, er det ganske vanskelig å få den hele FOV, så du bruker visningen fremre og bakre riktig er viktigere i vår tilnærming enn i andre tilnærming som vist i figur 2. Fordelen med visningen fremre ville være klart observasjon av reentry ved pathological betingelser, spesielt i appendage (Figur 4). På den annen side, bakre visningen har en fordel av å få en god utsikt over atrial bakre veggen, og kan være en detaljert innspilling av utløsende aktivitet fra hjerteinfarkt ermet. Når det er vanskelig å få et riktig visning og flat buet overflaten med vår metode, kan atrium være fast med minimal spenning av pinnene.
Med vår metode er det 3 mulige problemer, feil flekker, pacing og arytmi induksjon. Svikt i flekker, hvis ingen eller liten fluorescens er observert, bør du sjekke om optisk kartlegging apparatet er riktig montert, og om reagensen er riktig lagret og brukes. Tilstanden av perfusjon løsningen er også avgjørende, som også kan påvirke elektrofysiologiske egenskapene til hjertet selv, så tilstanden til løsning inkluderer pH, temperatur, og om det var nok lufting må følges strengt. Det er også viktig å unngå noen luft emboli i hjertet. For pacing feil, hvis pacing stimuli ikke opphisse atrium, bør forskere sjekke om ledninger er riktig bruker krets tester. Når pacing stimuli er riktig produseres, er problemet kontakt av elektroden med vevet. Omplassering av elektrodene kan løse problemet, og vår tilnærming med pacing kateter gjør det enkelt. For problemer med arytmi induksjon, kan RV pacing brukes for induksjon av en AT begrenset iblant. Bruke et quadripolar elektrode kateter som den distale to elektroder og proksimale elektrodene kan plasseres i RV og RA, henholdsvis, er det enkelt å endre pacing området fra RA til RV. Denne kateter er også nyttig for skiftende ventrikkel magnetisering når et samtidig ventrikkel aktivering signal masker atrial eksitasjon signalet.
Denne metoden vil bidra til å vurdere genotype-fenotypen interaksjoner i AF relatert gener nylig funnet av romanen studiene som GWAS, spesielt for gener som etterforskningen kunne vise dem av andre tilnærminger. Med utviklingen av enheter og teknikker, kan elektrofysiologiske egenskaper for pulmonary blodåre ermet, som er det viktig AF20, vurderes i intakt hjertet med denne tilnærmingen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av programmet for forbedring av forskningsmiljø for unge forskere fra koordinering midler for å fremme vitenskap og teknologi (SCF) (til T.S.), Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning (nr. 16K 09494, T.S., nr. 26293052, til T.F.) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan. Vi verdsette Brainvision og Mr. Kenji Tsubokura for teknisk assistanse, og vi setter også pris Mr. John Martin for hans språklige hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
