Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56493
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

Summary

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

Abstract

צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.

Introduction

דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג'ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.

לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.

NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור של הקלטה אלקטרודות

  1. מושך האלקטרודות זכוכית
    1. השתמש בהבא פרוטוקול פולר microelectrode (ראה טבלה של חומרים):
      1. קו 1: חום 510 משוך - מהירות 30 פעם 250; קו 2: מחממים למשוך 490 - מהירות 30 פעם 250.
        הערה: יחידות זמן שיתאימו ms 0.5 ליחידה; היחידות האחרות הן יחסיות. הערך של החום צריך להיות מותאם עבור כל נימה לאחר הבדיקה הרמפה מתבצע.
    2. להשתמש במיקרוסקופ (35 x הגדלה) על מנת להבטיח כי הקוטר הפנימי של האלקטרודה משך בטווח של 7-10 מיקרומטר ( איור 1 א'). לאחסן הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק.
  2. אש ליטוש
    1. אש פולנית נימים (80-90% של ערך חום מרבי עבור s 1-2) באמצעות מיקרו-פורג (ראה טבלה של חומרים). ודא הקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה מלוטש 5 מיקרומטר ( איור 1 א') 27-
  3. Bending
    הערה: שני עיקולים נעשות לצורך מקם את האלקטרודות על השריר תחת מטרה בהגדלה.
    1. שימוש המנגנון באיור איור 1B. לתקן את האלקטרודה manipulator ומקם את הטיפ מעל חוט הלהט, לא נוגע את זה
    2. סט חום ערך ל- 60-70% מהמקסימום והקש על דוושת של המיקרו-פורג עבור s 1-2 (ראה טבלה של חומרים) כדי לחמם את הסיב. השתמש של המחט בצורת L כדי להוריד בעדינות את קצה האלקטרודה ( איור 1B מוגדלת). להפוך את העיקול על 90 o ( איור 1C).
    3. החזק האלקטרודה מעל להבת המבער ביד באמצעות מלקחיים ולעשות העיקול השני ממרחק של 7-10 מ מ העיקול הראשון, בזווית של-120 o ( איור 1C).

Figure 1
איור 1. הצעד האחרון של ייצור micropipette. (א) אלקטרודה טיפים לאחר משיכת וליטוש אש. (B.1) ההתקנה עצה כיפוף. (B.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. האלקטרודה ואת הלהט קבועים כך הקצה אלקטרודה הוא ממוקם מעט מעל הגדר ונוגע לא. (C.1) האלקטרודה הקלטה. (C.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. העיקול הראשון יש זווית של-90°, המרחק בין קצה האלקטרודה העיקול הראשון הוא בערך 1 מ מ. גודל בר = 3 מ מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. צעדים הכנה נוסף

  1. הכן, כמו heamolymph (HL3) פתרון (במ מ): 70 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, טרהלוז 5, סוכרוז 115, 5 HEPES ו- 1 מ מ CaCl 2; להתאים את ה-pH ל 7.3 - 7.4. לשמור את הפתרון במקרר ולהפוך אותו טרי כל שבוע.
  2. לגרום גירוי pipets באותה דרך כמו הקלטה זכוכית pipets, חוץ מזה שאין שום צורך לכופף אותם.
    הערה: הכנת גירוי אלקטרודות מתואר בפירוט 28 ו -27. הקוטר סופי לאחר ליטוש אש צריך להיות בטווח של 5-7 מיקרומטר.
  3. הוספה פיפטה גירוי של בעל microelectrode מחובר מזרק.
  4. ייצור לנתיחה צלחות קטנות צלחות פטרי (35 x 10 מ מ) מצופה אפוקסי גומי סיליקון (ראה טבלה של חומרים) כמתואר ב- 28-
    הערה: גומי סיליקון צריך להיות לגמרי מוקשח לפני השימוש.
  5. לבחור הזחלים השלישי-לחלל נודד, לנתח את זה. כפי שמתואר 27 , 28 , 29 , 30-
    הערה: כדי להמחיש עם העיתון ons, השתמש המתח לטוס CD8-GFP (ראה טבלה של חומרים)
    1. באמצעות מלקחיים (ראה טבלה של חומרים), לבחור את הזחלים לחלל רואד 3 מתוך בקבוקון.
    2. להצמיד את הזחלים, הצבת את הסיכה הראשונה האחורי ולהדק אחר הקדמי (סגור את הפה ווים).
    3. HL3 להוסיף פתרון.
    4. לעשות חתך באמצעות מעיין מספריים (ראה טבלה של חומרים) כל הדרך מן הסיכה העליונה לתחתית אחת בצד הגבי של הזחלים.
    5. להצמיד את פילה הזחלים, הנחת 2 סיכות נוספים על השמאלי והימני של הזחלים.
    6. להסיר את האומץ ואת tracheas באמצעות מלקחיים.
    7. לחתוך את העצבים מחוץ חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב.

3. חשמל הקלטות של שלטון

Figure 2
באיור 2. הגדרת הקלטה. המדגם NMJ מוצמדת סיליקון מצופים צלחת פטרי (חץ) ממוקם על השלב מטלטלין של המיקרוסקופ מתחם זקוף מצוידים עם יכולות epifluorescence, מטרה בהגדלה, micromanipulators שני. המיקרוסקופ מוצב על טבלת אנטי רטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הקלטה
    1. מקום צלחת פטרי עם ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ( איור 2). הכנס האלקטרודה הפניה באמבטיה.
    2. למלא האלקטרודה הקלטה עם HL3 פתרון. תחת המטרה 10 x (ראה טבלה של חומרים), לטבול את האלקטרודה לתוך האמבט ומניחים אותו מעל השרירים 6 ו-7 המקטעים בטן 2, 3 או 4 שימוש את micromanipulator ((ראה טבלה של חומרים) איור 3 A.1, A.2).
    3. לעבור המטרה 60 x (ראה טבלה של חומרים). להתמקד באזור עניין באמצעות epi-זריחה או אופטיקה DIC. המקום קצה האלקטרודה מעל סינפטית בוטון ( איור 3 B.1-3).
    4. הקש האלקטרודה בעדינות לתוך השריר. לחץ מופרז עלול נזק NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית ספונטנית. ודא קצה האלקטרודה אינה סתומות - אם זה, להחליף את זה
    5. לעבור על המגבר, לוח A/D המחשב.
    6. לבחור את מצב קלאמפ מתח על המגבר.
    7. להתחיל רכישת התוכנה ולבחור ' ללא פער ' מצב.
    8. להתבונן במראה של mEJCs על מסך המחשב.
    9. לוודא משרעת של mEJCs זה בטווח של 0.2 - 0.7 הערך לא ישים
      הערה: שלטון קטנים יותר לציין כי האלקטרודה ההקלטה יש פגמים או כי זה אינו ממוקם כראוי.

Figure 3
איור 3. ויזואליזציה של סינפטית עם העיתון ons- (א) א brightfield תמונה של המי-קטע מתחת לגיל 10 x הגדלה (A.1) ואזור מסגרת מוגדלת מראה שרירי 6 ו-7 (A.2, החץ מסמן האלקטרודה הקלטה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) סינפטית עם העיתון ons הם דמיינו קו דרוזופילה סמן עצביים מקודדים גנטית (CD8-GFP) באמצעות הדמיה epi-קרינה פלואורסצנטית (B.1) או DIC אופטיקה (B.2). תמונות נלקחים עם ה 60 x אובייקטיבית, הקוביה מסנן עבור GFP הדמיה (ראה טבלה של חומרים). Synaptic עם העיתון ons מסומנים עם החצים, כיסוי של פלורסנט ותמונות DIC מוצג B.3. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. גירוי
    1. באמצעות micromanipulator, תחת פקד חזותי, מקום האלקטרודה גירוי ליד האקסון innervating מקטעים בטן 2-4-
    2. החל לחץ שלילי על ידי משיכת את הבוכנה של המזרק מחובר למחזיק אלקטרודה, כך האקסון עשה בתוך האלקטרודה ( איור 2).
    3. הפעל ממריץ. סובב את כפתור על יחידת בידוד (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את זרם אפס ולאחר מכן בעדינות להגדיל אותו, עד שלטון יופיעו (או עד לסף).
    4. לבצע הגירוי במשטר suprathreshold, עם גירוי הנוכחי עלה כ פעמיים, לעומת הסף עבור הצפיה שלטון.
      הערה: מניסיוננו, עוצמת גירוי כזה הוא אופטימלי כדי למנוע כשלים פוטנציאל הפעולה, פוטנציאל הפעולה ירי. לדוגמה, אם שלטון יופיע הזרם גירוי של 0.2 אמא, להשתמש זרם של 0.4 mA לאורך כל הניסוי.
  2. חותם ההתנגדות
    1. למדוד את ההתנגדות החותם של האלקטרודה macropatch הקלטה על-ידי הפעלת המתג התנגדות האלקטרודה של המגבר כדי " חותם מבחן " עמדה. לצפות כי הערך של עמידות חותם GΩ יוצג " הנוכחי " החלון.
    2. לוודא ההתנגדות החותם הוא בטווח של 0.5 - 2 מ' Ω. ערכים מחוץ לטווח זה מציינים כי האלקטרודה מלוטשים כראוי או לא תקינה מוצבים.
    3. לנטר את ההתנגדות חותם לאורך ההקלטה, מוודא שזה נותרת קבועה לאורך כל הניסוי.

4. ניתוח

  1. ניתוח הקלטות העסקת אישית תוכנה לניתוח (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: המעבדה שלנו משתמשת בתוכנה שבאתר Quantan 31, אשר הוא מותאם אישית עבור הגילוי של שלטון, mEJCs הקליט focally ( איור 4). תוכנה זו מאפשרת הגילוי של פסגות ההרים quantal חופפים quantal מרובת אירועים ( איור 4A) וכולל דיגיטלית מסנן לפי עקומת גאוס. גישות אחרות מתוארים 17.

Figure 4
באיור 4. ניתוח quantal. זיהוי של mEJCs (א) ושלטון (B) על-ידי תוכנת Quantan. אזור האירוע מסומן בירוק, פסגות שסומנו על-ידי ראשי חץ אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקלטות macropatch מוקד מאפשרים ניטור פעילות סינפטית של הנבחרת עם העיתון ons סינפטית (איור 5). כאשר האלקטרודה ממוקמת בחלק העליון בוטון סינפטית (איור 5A, אתר 1), mEJCs המוקלט (איור 5C, אתר 1) יש את amplitudes באופן משמעותי העולה על רמת הרעש וחדד בעליה שלבים (מטווח תת אלפיות השנייה). כאשר האלקטרודה הקלטה הזזת את בוטון סינפטית על ידי מספר מיקרונים (איור 5A, אתר 2), amplitudes של mEJCs המוקלט ירידה כמעט את רמת הרעש (איור 5B, אתר 2). שלטון מוקלטות בקושי ניתן להבחין בין הקולות לרעשי והאריך הם יש עלייה בשלבים (איור 5C, אתר 2 לעומת אתר 1).

מספר מוגבל של אתרי פרסום לתרום שלטון מוקלטות, mEJCs, כמו גם קינטיקה מהירה של זרמי סינפטית הקליט focally, מאפשרת איתור מדויק של האירועים שחרור מוטציות עם פעילות סינפטית מוגברות. בבירור להדגים מצב זה על ידי הקלטות של mEJCs מ- complexin null מוטציה (איור 6A). פעילות ספונטנית הוא גבוה באופן דרסטי ב זו מוטציה32, ולכן mEJPs הקליט intracellularly חופפים ולא ניתן בבירור מכובד אחד מהשני (איור 6B), בזמן הקלטות מוקד22 לאפשר מדויק הזיהוי של אירועים לשחרור ספונטני (איור 4A).

Figure 5
איור 5. הקלטות של שלטון, mEJCs מ בוטון שנבחר. (א) הצבת האלקטרודה על בוטון שנבחר (אתר 1) ולהעביר אותה הרחק בוטון (אתר 2). התמונות להראות CD8-GFP NMJ מתויג דמיינו epi-זריחה (A.1), הקלטה אלקטרודה על סיבי השריר (A.2), ואת כיסויי (A.3, A.4), עם האלקטרודה יונח מעל האתר 1 (A.3) או אתר 2 ( A.4)-קנה מידה בר = 10 מיקרומטר. (B) mEJCs הקליט מ בוטון (אתר 1) בבירור נכבדים מן הרעש הקלטה, יש שלבים עלייה מהירה. לעומת זאת, mEJCs הקליט מאתר 2 לא יכול להבחין בצורה אמינה מפני הרעש הקלטה, amplitudes שלהם מופחתים several-fold, ויש להם זמן-קורס איטי יותר. (ג) Amplitudes של שלטון הקליט מ בוטון (אתר 1) יעלה על ידי רבים-מקפלים ש-amplitudes של שלטון הקליט מאתר 2, ויש להם גם קינטיקה מהירה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. מוקד macropatch לעומת הקלטות תאיים. הקלטות מוקד לאפשר איתור מדויק של mEJCs ב complexin null החשבונאי (A), בזמן הקלטות תאיים (B) תערוכה זו מוטציה לשחרר אירועים חופפים לא ניתן לאתרם באופן אמין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות מדויק של ההעברה הסינאפסית-עם העיתון ons מטמיעים.

ההצלחה של הפרוטוקול המתואר אנושות תלוי היכולת להמחיש בבירור את תחומי עניין, כדי להתאים אישית את הכנת הקלטה אלקטרודות. לפיכך, איכות DIC אופטיקה, מטרה טבילה במים בהגדלה עם זמן ומרחק עבודה וציוד מותאם אישית עבור אש ליטוש וכיפוף של הקלטה אלקטרודות חשובים באופן ביקורתי.

היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת מעקב אחר הפעילות של הסינפסות כמה הממוקמים תחת האלקטרודה הקלטה. יצוין, עם זאת, עם העיתון ons מוצבים בסמוך בקצה האלקטרודה עשוי גם לתרום פעילות המוקלט. . זה קריטי, לכן, כי המיקום של האלקטרודה, כמו גם ההתנגדות חותם, אינו משתנה במהלך הניסוי

היכולת לעקוב אחר פעילות של בוטון יחיד ניתן לשלב באופן פוטנציאלי עם טכנולוגיות הדמיה חדשות. לדוגמה, זיהוי אופטי של פעילות אזורי פעיל בודדים35 יכול להיות משולב עם הקלטות מוקד של שלטון, mEJC, זה יכול הזוג את הרזולוציה המרחבית של זיהוי אופטי עם רזולוציה טמפורלית של הקלטות חשמל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sutter P-97 Sutter instrument P-97 Microelectrode puller
Narishige MF-830 Narishige MF-830 Microforge
WPI MF200 WPI MF200 Microforge
Glass capilaries WPI B150-86-10 Glass capilaries
Microtorch 1WG61 Grainer 1WG61 Microtorch
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning SYLGARD 184 Silicone for dissection plates preparation
Dissection pins Amazon B00J5PMPJA Pins for larvae positioning
Tweezers WPIINC 500342 Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas.
Scissors WPIINC 501778 Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves.
Olympus BX61WI Olympus BX61WI Upright microscope
Olympus Lumplan FL N 60x Olympus UPLFLN 60X Microscope objective 60X
Olympus UPlan FL N 10x Olympus Uplanfl N 10X Microscope objective 10X
Narishige Micromanipulator Narishige MHW-3 Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator
npi Electronic GmbH ELC-03XS npi Electronic GmbH ELC-03XS Electrophysiological amplifier
A.M.P.I Master 8 A.M.P.I. Master 8 Electrical stimulator
A.M.P.I Iso-Flex A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolator
TMC antivibration table TMC 63-9090 Antivibration table
TMC Faraday cage TMC 81-333-90 Faraday cage
Digidata 1322A Axon Instruments Digidata 1322A Digidata
Computer Dell Dell Dimension 5150 Computer with Win XP OS
Electrode holder WPI MEH3SW Electrode holder
Optical filter Omega optical XF 115-2 Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection
pCLAMP 8 Axon Instruments 8.0.0.81 Software for signal recording
Quantan In-house software - Software for signal processing
Canton-S (Wildtype) Bloomington Stock Center 64349 Control fly line
cpx SH1 Generous Gift of J.T. Littleton - Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis
CD8-GFP Bloomington Stock Center 5137 Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
  2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
  3. Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
  4. Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
  5. Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
  6. Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
  7. Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
  8. Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
  9. Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
  10. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
  11. Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
  12. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
  13. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
  14. Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
  15. Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
  16. Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
  17. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
  18. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  19. Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
  20. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
  21. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
  22. Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
  23. Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
  24. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
  25. Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
  26. Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
  27. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
  28. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  29. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  30. Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
  31. Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
  32. Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
  33. Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
  34. Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
  35. Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).

Tags

מדעי המוח גיליון 127 עם העיתון ons סינפטית אלקטרופיזיולוגיה EJC mEJC עצב מסוף זרמים חוץ-תאית סינפטית הקלטות חשמל
מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת <em>דרוזופילה</em> Neuromuscular זחל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal… More

Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (127), e56493, doi:10.3791/56493 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter