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Neuroscience

Drosophila लार्वा Neuromuscular जंक्शन से Synaptic धाराओं की फोकल Macropatch रिकॉर्डिंग

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56493
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

Summary

Synaptic धाराओं के Drosophila तीसरे instar लार्वा neuromuscular जंक्शन पर visualized Synaptic बूटोंस से फोकल दर्ज किया जा सकता है । यह तकनीक एक एकल synaptic bouton की गतिविधि की निगरानी में सक्षम बनाता है ।

Abstract

Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । हम Drosophila लार्वा NMJ में visualized बूटोंस से synaptic धाराओं के फोकल macropatch रिकॉर्डिंग की तकनीक का वर्णन । इस तकनीक रिकॉर्डिंग micropipettes के निर्माण अनुकूलित की आवश्यकता है, साथ ही एक यौगिक एक उच्च इज़ाफ़ा, लंबी दूरी के पानी विसर्जन उद्देश्य, विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत (उद्योग) प्रकाशिकी, और एक फ्लोरोसेंट से सुसज्जित माइक्रोस्कोप अनुलग्नक. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक चयनित synaptic के शीर्ष पर तैनात किया गया है bouton के साथ visualized, महामारी-प्रतिदीप्ति, या दोनों । इस तकनीक का लाभ यह है कि यह रिहाई की साइटों की एक सीमित संख्या के synaptic गतिविधि की निगरानी की अनुमति देता है । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कई माइक्रोन का एक व्यास है, और जारी इलेक्ट्रोड रिम के बाहर तैनात साइटों काफी रिकॉर्ड किए गए धाराओं को प्रभावित नहीं करते. दर्ज synaptic धाराओं तेजी से कैनेटीक्स है और आसानी से हल किया जा सकता है । इन लाभों को बढ़ाया सहज या अतुल्यकालिक synaptic गतिविधि के साथ उत्परिवर्ती फ्लाई लाइनों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं ।

Introduction

Drosophila एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के लिए आणविक synaptic संचरण को नियंत्रित करने के तंत्र का अध्ययन है । Drosophila में neuromuscular प्रणाली glutamatergic है, और इसलिए Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic रिलीज के संरक्षित सुविधाओं का अध्ययन किया जा सकता है । जनवरी और जनवरी के अध्ययन के बाद से1, तीसरे instar लार्वा मोटे तौर पर उत्तेजक जंक्शन क्षमता (EJPs) या धाराओं (EJCs) की निगरानी के द्वारा पैदा की और सहज synaptic संचरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । EJPs आमतौर पर एक तेज गिलास माइक्रो इलेक्ट्रोड के साथ intracellularly दर्ज की गई हैं, और वे सभी बूटोंस दिया मांसपेशी फाइबर पर synapses बनाने सहित पूरे NMJ की गतिविधि को प्रतिबिंबित ।

इसके विपरीत, रिलीज की साइटों की एक सीमित संख्या की गतिविधि फोकल स्थिति द्वारा एक micropipette टिप के पास ंयूरॉन टर्मिनलों या synaptic varicosities दर्ज की जा सकती है । इस तकनीक को मूल रूप से Katz और Miledi2द्वारा नियोजित किया गया था, और फोकल extracellular रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक मेंढक3,4,5, माउस6 सहित कई NMJ तैयारी में कार्यरत किया गया है , 7 , 8, जलीय9,10,11,12,13,14,15,16, और Drosophila17,18,19,20,21,22,23. इस दृष्टिकोण आगे Dudel, जो अनुकूलित macropatch reकोडिंग इलेक्ट्रोड24,25द्वारा विकसित किया गया था । Dudel के कार्यांवयन में, इस तकनीक को बारीकी से मिलान ढीला-पैच-क्लैंप विधि26।

Drosophila लार्वा NMJ स्पष्ट रूप से synaptic बूटोंस परिभाषित किया गया है, और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ंयूरॉन फ्लोरोसेंट टैग के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों ( सामग्री की तालिकादेखें) आसानी से उपलब्ध हैं । ये फायदे हमें एक चयनित synaptic bouton20,21,22से EJCs और mEJCs रिकॉर्ड करने में सक्षम । यहां, हम विस्तार से इस तकनीक का वर्णन ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का निर्माण

  1. ग्लास इलेक्ट्रोड्स
    1. microelectrode खींचने के लिए निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें (देखें सामग्री की तालिका ):
      1. लाइन 1: हीट ५१० Pull-वेग 30 समय २५०; लाइन 2: हीट ४९० Pull-वेग 30 समय २५०.
        नोट: समय इकाइयों ०.५ ms प्रति इकाई के लिए संगत; अन्य इकाइयां सापेक्ष हैं । गर्मी के मूल्य हर रेशा के लिए रैंप पर परीक्षण किया जाता है के बाद समायोजित किया जाना चाहिए ।
    2. एक खुर्दबीन (35x आवर्धन) का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि खींच इलेक्ट्रोड के भीतरी व्यास 7-10 & #181 की सीमा में है; m (< सबल वर्ग = "xfig" > figure 1a ). धूल संचय को रोकने के लिए केशिकाओं को कसकर बंद कंटेनरों में संग्रहित करें ।
  2. आग चमकाने
    1. आग पोलिश केशिकाओं (1-2 s के लिए अधिकतम गर्मी मूल्य का ८०-९०%) एक सूक्ष्म फोर्ज का उपयोग ( सामग्री की मेज देखें) । पॉलिश इलेक्ट्रोड के अंतिम भीतरी व्यास सुनिश्चित करें 5 & #181; m (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ) < सुप वर्ग = "xref" > २७ .
  3. झुकने
    नोट: दो झुकता आदेश एक उच्च आवर्धन उद्देश्य के तहत पेशी के शीर्ष पर इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए बने हैं ।
    1. < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b में दिखाए गए तंत्र का उपयोग करें । जोड़तोड़ में इलेक्ट्रोड को ठीक करें और रेशा पर टिप स्थिति, यह छू नहीं.
    2. ६०-अधिकतम के ७०% के लिए गर्मी मान सेट और माइक्रो के पेडल को प्रेस 1-2 s (सामग्री के तालिका देखें) के लिए रेशा गर्मी । एक एल के आकार सुई धीरे इलेक्ट्रोड की नोक नीचे खींचने के लिए उपयोग करें (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b बढ़े). लगभग ९० पर मोड़ कर o (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
    3. संदंश का उपयोग करके हाथ से मशाल की लौ पर इलेक्ट्रोड पकड़ और पहले मोड़ से 7-10 mm की दूरी पर दूसरा मोड़ बनाने के लिए और लगभग १२० के एक कोण पर o (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"/>
चित्रा 1. micropipette निर्माण के अंतिम चरण. ( एक ) खींच और आग चमकाने के बाद इलेक्ट्रोड युक्तियां । ( B .1 ) टिप झुकने के लिए सेटअप । ( बी .2 ) बॉक्सिंग क्षेत्र सही पर बढ़े हुए दिखाया गया है. इलेक्ट्रोड और रेशा इतना तय कर रहे हैं कि इलेक्ट्रोड टिप तार के ऊपर थोड़ा तैनात है और छू नहीं है. ( C .1 ) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड । ( सी .2 ) बॉक्सिंग क्षेत्र सही पर बढ़े हुए दिखाया गया है. पहले मोड़ लगभग ९० & #176 का एक कोण है, और पहले मोड़ और इलेक्ट्रोड की नोक के बीच की दूरी लगभग 1 मिमी है. स्केल बार = 3 मिमी. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target = "blank" > कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

< p class = "jove_title" > 2. अतिरिक्त तैयारी कदम

  1. तैयार heamolymph-like (HL3) समाधान (मिमी में): ७० NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2 , 10 NaHCO 3 , 5 trehalose, ११५ सुक्रोज, 5 HEPES, और 1 मिमी CaCl 2 ; पीएच को ७.३ के लिए समायोजित करें- ७.४. फ्रिज में रखे घोल को हर हफ्ते फ्रेश करके रखें ।
  2. उत्तेजना pipets उसी तरह रिकॉर्डिंग ग्लास pipets के रूप में, सिवाय वहां उंहें झुकने की जरूरत नहीं है ।
    नोट: उत्तेजना इलेक्ट्रोड की तैयारी में विवरण में वर्णन किया गया है < सुप वर्ग = "xref" > 28 and < सुप class = "xref" > 27 . आग चमकाने के बाद अंतिम व्यास 5-7 की सीमा में होना चाहिए & #181; m.
  3. एक सिरिंज से जुड़े एक microelectrode धारक में एक उत्तेजना पिपेट डालें.
  4. निर्माण विच्छेदन प्लेट्स से छोटे पेट्री व्यंजन (३५ x 10 मिमी) सिलिकॉन रबर epoxy के साथ लेपित (देखें तालिका सामग्री ) में वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > २८ .
    नोट: सिलिकॉन रबर का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से कठोर होना चाहिए ।
  5. एक घूमते हुए तीसरे instar लार्वा उठाओ और यह टुकड़े < सुप वर्ग = "xref" > 27 में वर्णित के रूप में, < सुप class = "xref" > 28 , < सुप class = "xref" > 29 , < सुप क्लास = "xref" > 30 .
    नोट: बूटोंस कल्पना करने के लिए, मक्खी तनाव सीडी-GFP का उपयोग करें (देखें तालिका की सामग्री )
    1. उपयोग संदंश (देखें तालिका सामग्री ), एक शीशी से 3 rd instar लार्वा उठाओ.
    2. लार्वा पिन, पहला पिन पीछे रखने और एक और पिन पूर्वकाल (मुंह हुक करने के लिए बंद).
    3. जोड HL3 समाधान.
    4. एक स्प्रिंग कैंची का उपयोग कर कटौती करने के लिए ( सामग्री की तालिका देखें) ऊपर पिन से लार्वा के पृष्ठीय पक्ष पर नीचे एक करने के लिए सभी तरह.
      5. लार्वा पट्टिका को
    5. पिन करें, लार्वा के बायीं और दाईं ओर 2 अतिरिक्त पिन लगाकर ।
      6. हिम्मत निकाल
    6. और tracheas का प्रयोग संदंश.
    7. बस ventral तंत्रिका कॉर्ड स्प्रिंग कैंची का उपयोग कर के बाहर नसों में कटौती ।
< p class = "jove_title" > 3. EJCs की विद्युत रिकॉर्डिंग

< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"/>
चित्रा 2. रिकॉर्डिंग setup. नमूना सिलिकॉन लेपित पेट्री पकवान (तीर) पर टिकी NMJ ईमानदार यौगिक epifluorescence क्षमताओं, एक उच्च आवर्धन उद्देश्य, और दो micromanipulators से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के चल रहे मंच पर तैनात है । माइक्रोस्कोप एक विरोधी कंपन मेज पर थाना है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. recording
    1. जगह माइक्रोस्कोपी स्टेज पर तैयारी के साथ पेट्री डिश (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) । स्नान में संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें.
    2. HL3 समाधान के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें । 10x उद्देश्य के तहत (सामग्री के तालिका देखें), स्नान में इलेक्ट्रोड विसर्जित और यह मांसपेशियों पर जगह 6 और 7 उदर खंडों के 2, 3, या 4 micromanipulator का उपयोग (देखें सामग्री की मेज) ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ a .1 और a. 2 ).
    3. स्विच करने के लिए उद्देश्य 60x (देखें सामग्री की तालिका ). या तो महामारी-प्रतिदीप्ति या केंद्र प्रकाशिकी का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित । इलेक्ट्रोड की नोक को synaptic के शीर्ष पर रखें bouton (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ बी. १-३ ).
    4. प्रेस इलेक्ट्रोड बहुत धीरे मांसपेशी पर. अत्यधिक दबाव NMJ नुकसान या सहज synaptic गतिविधि में वृद्धि पैदा कर सकता है । सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड की नोक भरा हुआ नहीं है-अगर यह है, इसे बदलें.
    5. एम्पलीफायर, A/D बोर्ड, और कंप्यूटर पर स्विच करें ।
    6. एम्पलीफायर पर वोल्टेज दबाना मोड चुनें.
    7. शुरू करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और चुनें & #39; गैप-free & #39; मोड.
    8. कंप्यूटर स्क्रीन पर mEJCs की उपस्थिति का निरीक्षण ।
    9. सुनिश्चित करें कि mEJCs के आयाम ०.२-०.७ nA.
      की श्रेणी में है नोट: छोटे EJCs संकेत है कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दोष है या कि यह ठीक से तैनात नहीं है ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 3" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"/>
चित्रा 3. synaptic बूटोंस. के दृश्य ( a ) 10x आवर्धन ( a .1 ) के अंतर्गत एक hemi-सेगमेंट की एक brightfield छवि और मांसपेशियों 6 और 7 ( ए .2 , तीर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को दर्शाते हुए बढ़े हुए बॉक्सिंग क्षेत्र). स्केल बार = ५० & #181; एम. ( बी ) Synaptic बूटोंस एक Drosophila लाइन में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ंयूरॉन मार्कर (सीडी-GFP) महामारी-प्रतिदीप्ति इमेजिंग ( b .1 ) या उद्योग ( बी 2 ) का उपयोग कर के साथ visualized हैं । छवियां 60x उद्देश्य और GFP इमेजिंग के लिए फ़िल्टर घन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ लिया जाता है । Synaptiसी बूटोंस तीर से चिह्नित हैं, और फ्लोरोसेंट और उद्योग की छवियों का एक ओवरले B .3 में दिखाया गया है । स्केल बार = 10 & #181; m. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा सुरु = "2" >
  • उत्तेजन
    1. एक micromanipulator का उपयोग कर, एक दृश्य नियंत्रण के तहत, उत्तेजना इलेक्ट्रोड axon innervating उदर खंडों 2-4 के पास रखें.
    2. इलेक्ट्रोड धारक से जुड़े सिरिंज के पिस्टन खींच द्वारा नकारात्मक दबाव लागू होते हैं, ताकि axon इलेक्ट्रोड के अंदर खींच लिया है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
      3. उत्तेजित करता है पर
    3. बारी । अलगाव इकाई पर घुंडी बारी (सामग्री के तालिका देखें) एक शूंय वर्तमान सेट करने के लिए, और फिर धीरे से इसे बढ़ाने के लिए, जब तक EJCs दिखाई देते है (या जब तक दहलीज तक पहुंच गया है) ।
    4. एक suprathreshold शासन में उत्तेजना प्रदर्शन, उत्तेजना वर्तमान के साथ लगभग दो बार वृद्धि हुई, EJCs.
      के अवलोकन के लिए दहलीज की तुलना में नोट: हमारे अनुभव में, ऐसी उत्तेजना तीव्रता कार्रवाई संभावित विफलताओं और कार्रवाई संभावित गोलीबारी से बचने के लिए इष्टतम है । उदाहरण के लिए, यदि EJCs ०.२ ma की उत्तेजना वर्तमान में दिखाई देते हैं, प्रयोग में ०.४ mA की वर्तमान का उपयोग करें ।
  • सील प्रतिरोध
    1. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध स्विच की रिकॉर्डिंग macropatch इलेक्ट्रोड की सील प्रतिरोध करने के लिए एम्पलीफायर की & #34; सील परीक्षण & #34; स्थिति । गौर हो कि जी & #937 में मुहर प्रतिरोध का मूल्य; & #34 में प्रदर्शित किया जाएगा; वर्तमान & #34; window.
    2. सुनिश्चित करें कि सील प्रतिरोध ०.५ की सीमा में है-2 M & #8486;. इस श्रेणी से बाहर मान इंगित करता है कि इलेक्ट्रोड ठीक से नहीं पॉलिश या ठीक से तैनात नहीं है ।
    3. रिकॉर्डिंग भर में सील प्रतिरोध की निगरानी, यकीन है कि यह प्रयोग भर में लगातार बनी हुई है ।
    • < p class = "jove_title" > 4. विश्लेषण

    1. विश्लेषण के लिए अनुकूलित सॉफ्टवेयर को रोजगार रिकॉर्डिंग का विश्लेषण ( सामग्री की तालिका देखें) ।
      नोट: हमारी प्रयोगशाला में घर सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है कुआंतन < सुप वर्ग = "xref" > 31 , जो EJCs और mEJCs का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है फोकल (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4       ). इस सॉफ्टवेयर एक गाऊसी डिजिटल फिल्टर शामिल है और अतिव्यापी बहु quantal घटनाओं में quantal चोटियों का पता लगाने की अनुमति देता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4a ). अंय तरीकों में वर्णित है < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
    < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 4" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"/>
    फिगर 4. Quantal विश्लेषण. डिटेक्शन ऑफ mEJCs ( A ) और EJCs ( B ) द्वारा कुआंतन सॉफ्टवेयर । घटना क्षेत्र हरे रंग में चिह्नित है, और चोटियों लाल ऐरोहेड द्वारा चिह्नित कर रहे हैं । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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    Representative Results

    फोकल macropatch रिकॉर्डिंग चयनित synaptic बूटोंस (चित्र 5) से निगरानी synaptic गतिविधि सक्षम करें । जब इलेक्ट्रोड एक synaptic bouton (चित्रा 5ए, साइट 1) के शीर्ष पर स्थित है, रिकॉर्ड mEJCs (चित्रा 5C, साइट 1) काफी शोर स्तर और तेज बढ़ती चरणों से अधिक एक आयाम है (एक उप मिलीसेकंड रेंज पर). जब रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड synaptic bouton से दूर कई माइक्रोन (चित्रा 5, साइट 2) द्वारा ले जाया गया है, रिकॉर्ड किए गए mEJCs गिरावट के आयाम लगभग शोर स्तर (चित्रा 5B, साइट 2) के लिए. दर्ज EJCs मुश्किल से शोर से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और वे लंबे समय तक बढ़ती चरणों (चित्रा 5C, साइट 2 बनाम 1 साइट) ।

    रिलीज EJCs और mEJCs, साथ ही synaptic धाराओं के तेजी से कैनेटीक्स के रूप में अच्छी तरह से दर्ज करने के लिए योगदान साइटों की सीमित संख्या में फोकल, ऊंचा म्यूटेंट गतिविधि के साथ synaptic में रिलीज की घटनाओं का सही पता लगाने में सक्षम बनाता है । यह स्पष्ट रूप से complexin null उत्परिवर्ती (चित्रा 6A) से mEJCs की रिकॉर्डिंग द्वारा सचित्र किया जा सकता है । सहज गतिविधि इस उत्परिवर्ती३२में काफी ऊंचा है, और इसलिए mEJPs intracellularly ओवरलैप दर्ज की और एक दूसरे से स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता (चित्र घमण्ड), जबकि फोकल रिकॉर्डिंग22 सही सक्षम सहज रिलीज की घटनाओं (चित्र 4a) का पता लगाने ।

    Figure 5
    चित्र 5. किसी चयनित bouton से EJCs और mEJCs की रिकॉर्डिंग. (a) एक चयनित bouton (साइट 1) पर इलेक्ट्रोड रखने और इसे bouton (साइट 2) से दूर ले जा रहा है । छवियों सीडी-GFP टैग की गईं NMJ महामारी के साथ visualized-प्रतिदीप्ति (एक दिखा । 1), मांसपेशी फाइबर (ए. 2) पर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, और ओवरले (a .3, a .4), 1 साइट पर तैनात इलेक्ट्रोड के साथ (a. 3) या साइट 2 ( A. 4). स्केल बार = 10 µm. (B) mEJCs से रिकॉर्ड किया गया bouton (साइट 1) स्पष्ट रूप से रिकॉर्डिंग शोर से प्रतिष्ठित हैं और तेजी से बढ़ती चरणों है. इसके विपरीत, mEJCs 2 साइट से रिकॉर्ड मज़बूती से रिकॉर्डिंग शोर से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, उनके आयाम कई गुना कम कर रहे हैं, और वे एक धीमी समय पाठ्यक्रम है । (ग) bouton से दर्ज EJCs के आयाम (साइट 1) से अधिक कई गुना EJCs के आयाम 2 साइट से दर्ज की है, और वे भी अधिक तेजी से कैनेटीक्स है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6. फोकल macropatch बनाम intracellular रिकॉर्डिंग । फोकल रिकॉर्डिंग complexin नल उत्परिवर्ती (ए) में mEJCs का सही पता लगाने में सक्षम है, जबकि intracellular रिकॉर्डिंग (बी) इस उत्परिवर्ती प्रदर्शन रिलीज घटनाओं कि ओवरलैप और मज़बूती से नहीं पाया जा सकता से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    Drosophila synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है । कई रिकॉर्डिंग विन्यास लार्वा NMJ में इस्तेमाल किया गया है, synaptic क्षमता की intracellular रिकॉर्डिंग सहित, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप के साथ synaptic धाराओं की रिकॉर्डिंग३३,३४, और फोकल macropatch synaptic धाराओं की रिकॉर्डिंग यहां वर्णित है । उत्तरार्द्ध तकनीक visualized बूटोंस में synaptic संचरण की सटीक ठहराव की अनुमति देता है ।

    वर्णित प्रोटोकॉल की सफलता गंभीर रूप से ब्याज के क्षेत्र की कल्पना और इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की तैयारी को अनुकूलित करने की क्षमता पर निर्भर करता है । इस प्रकार, गुणवत्ता उद्योग प्रकाशिकी, एक लंबे समय से काम कर दूरी के साथ एक उच्च आवर्धन जल विसर्जन उद्देश्य, और आग चमकाने और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के झुकने के लिए अनुकूलित उपकरण महत्वपूर्ण हैं ।

    इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के तहत तैनात कर रहे हैं कि कुछ synapses की गतिविधि की निगरानी की अनुमति देता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, इलेक्ट्रोड के रिम के पास तैनात बूटोंस भी दर्ज की गतिविधि के लिए योगदान कर सकते हैं. यह महत्वपूर्ण है, इसलिए, कि इलेक्ट्रोड की स्थिति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सील प्रतिरोध, प्रयोग के पाठ्यक्रम में परिवर्तन नहीं करता है.

    एक एकल bouton की गतिविधि की निगरानी करने की क्षमता संभवतः हाल ही में इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ संयुक्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत सक्रिय क्षेत्र३५ पर गतिविधि का ऑप्टिकल डिटेक्शन EJCs और mEJC के फोकल रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा जा सकता है, और यह विद्युत रिकॉर्डिंग के लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ ऑप्टिकल डिटेक्शन के स्थानिक संकल्प को जोड़े रख सकता है ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    NIH अनुदान R01 MH ०९९५५७ द्वारा समर्थित

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sutter P-97 Sutter instrument P-97 Microelectrode puller
    Narishige MF-830 Narishige MF-830 Microforge
    WPI MF200 WPI MF200 Microforge
    Glass capilaries WPI B150-86-10 Glass capilaries
    Microtorch 1WG61 Grainer 1WG61 Microtorch
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning SYLGARD 184 Silicone for dissection plates preparation
    Dissection pins Amazon B00J5PMPJA Pins for larvae positioning
    Tweezers WPIINC 500342 Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas.
    Scissors WPIINC 501778 Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves.
    Olympus BX61WI Olympus BX61WI Upright microscope
    Olympus Lumplan FL N 60x Olympus UPLFLN 60X Microscope objective 60X
    Olympus UPlan FL N 10x Olympus Uplanfl N 10X Microscope objective 10X
    Narishige Micromanipulator Narishige MHW-3 Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator
    npi Electronic GmbH ELC-03XS npi Electronic GmbH ELC-03XS Electrophysiological amplifier
    A.M.P.I Master 8 A.M.P.I. Master 8 Electrical stimulator
    A.M.P.I Iso-Flex A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolator
    TMC antivibration table TMC 63-9090 Antivibration table
    TMC Faraday cage TMC 81-333-90 Faraday cage
    Digidata 1322A Axon Instruments Digidata 1322A Digidata
    Computer Dell Dell Dimension 5150 Computer with Win XP OS
    Electrode holder WPI MEH3SW Electrode holder
    Optical filter Omega optical XF 115-2 Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection
    pCLAMP 8 Axon Instruments 8.0.0.81 Software for signal recording
    Quantan In-house software - Software for signal processing
    Canton-S (Wildtype) Bloomington Stock Center 64349 Control fly line
    cpx SH1 Generous Gift of J.T. Littleton - Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis
    CD8-GFP Bloomington Stock Center 5137 Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
    2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
    3. Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
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    तंत्रिका विज्ञान १२७ अंक Synaptic बूटोंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी EJC mEJC तंत्रिका टर्मिनल extracellular Synaptic धाराओं विद्युत रिकॉर्डिंग
    <em>Drosophila</em> लार्वा Neuromuscular जंक्शन से Synaptic धाराओं की फोकल Macropatch रिकॉर्डिंग
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    Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal… More

    Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (127), e56493, doi:10.3791/56493 (2017).

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