Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לעורר תאים עם פפטידים מיטוכונדריאלי נגזר ולהעריך את המפל ואת לוקליזציה של פוספו-חלבונים איתות.

Abstract

פפטידים, נגזר מיטוכונדריאלי (MDPs) הם סוג חדש של פפטידים מקודדים על ידי קריאה פתוחה קטנה מסגרות אחרות הגנים הידועים של הגנום מיטוכונדריאלי. MDPs יש מגוון רחב של השפעות ביולוגיות כגון הגנה על הנוירונים מפני אפופטוזיס, שיפור סמנים מטבוליים, הגנה על תאים מכימותרפיה. Humanin היה MDP הראשון להתגלות, פפטיד הכי נחקרות בקרב משפחת MDP. קולטני ממברנה ואת הזרם איתות המסלולים של humanin יש בקפידה מלווה. MDPs נוספים כגון MOTS-c ו- SHLP1-6 התגלו לאחרונה, מנגנוני איתות שעדיין לא להיות הובהר. כאן נתאר שיטת תרבות המבוססת תא כדי לקבוע את הפונקציה של פפטידים אלה. בפרט, מאפשרים תא טכניקות fractionation בשילוב עם סופג המערבי הקביעה כמותית של ההפעלה, טרנסלוקציה של מולקולת איתות חשוב. אמנם יש שיטות אחרות של תא fractionation, המתואר כאן היא שיטה פשוטה וקלה. שיטות אלה ניתן להבהיר עוד יותר את מנגנון הפעולה של פפטידים אלה וסוכנים טיפוליים אחרים.

Introduction

המתעוררים מחקרים מראים כי מיטוכונדריאלי נגזר פפטידים (MDPs) תפקיד חשוב cytoprotection ואת חילוף החומרים1,2,3. הבנת מסלול התמרה חושית אות בנוכחות MDPs נותן לנו תובנה המנגנון שבאמצעותו MDPs לווסת פונקציות שונות. MDP מזוהה הראשון, humanin, הוכח להגדיל חוץ-תאית מוסדר אות קינאז 1/2 (ERK1/2) זרחון באמצעות הקולטן שלו מחייב4,5. עם זאת, השפעת הזרם הפעלה ERK1/2 הוא עדיין כשתפסעו.

המפל ERK1/2 משמש מתווך חיוני במגוון תהליכים תאיים כולל התפשטות, נדידת תאים, חילוף החומרים הסלולר, הישרדות של אפופטוזיס-6,-7,-8. שננהל את כל אלה תהליכים תאיים שונים, פעילות subcellular לוקליזציה של ERK1/2 מוסדרים בחוזקה על ידי phosphatases ולגרדום חלבונים9,10. בנוסף השינוי post-translational, ונעים דינמי של ERK1/2 גם מסדיר את איתות פונקציה, פעילות וספציפיות11,12. ERK1/2 הוא בעיקר מקומי ציטוזול13. קבוצה של חלבונים עיגון, לגרדום לסייע לשמור על ERK1/2 אלמנטים cytoskeletal, על פני שטח של organelles, או כשמאירים הציטופלסמה13. על גירוי, ERK1/2 הוא phosphorylated, הופך בלתי משויך לזהויות חלבונים עגינת שלה, המאפשר רוברטסונית של ERK1/2 כדי מדורים subcellular אחרים, לרבות גרעין, מיטוכונדריה, גולג'י, lysosomes14, 15 , 16.

למרות humanin ידוע כדי להפעיל את איתות ERK1/2, הפעלת ERK1/2 נצפית רק ב lysates התא סך הכל. כפי שתואר לעיל, מאז לוקליזציה subcellular ERK1/2 ממלא תפקיד מכריע השפעתו במורד הזרם, הניתוח של הן ההתאמה subcellular ואת רמות סך של phosphorylated ERK1/2 יש צורך לספק הבנה מקיפה של הפעלת ERK1/2 humanin-induced והפעלה של מטרות במורד הזרם.

כדי להבין את organelles המטרה של הפעלת ERK1/2, בוצעה fractionation subcellular ואחריו סופג המערבי ERK1 phosphorylated/2. בשיטה זו ניתן ליישם בקלות כפי הוא מנצל ריאגנטים וציוד מעבדה סטנדרטיים. התאים subcellular מבודדים הן טוהר גבוהה, ומאפשר את התוצאות יפורשו אבר המין הגברי. Immunostaining של ERK1/2 עשויה לייצר תוצאות דומות. עם זאת, תאים subcellular מסוימים קשים יחסית להמחיש ויידרש קיבוע מיוחד ושיטות permeabilization. ERK1/2 רמות משתנות של תאים subcellular, וריאציה זו עלולה לגרום אותות שלילי כוזב חיובי ו- false כאשר מסתכלים על כל התא lysates. לכן, immunoblot באמצעות תאים מבודדים subcellular נותן לנו הבנה טובה יותר של לוקליזציה ERK1/2.

צדדיות של השיטה מאפשרת שינויים בפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של ממריצים אחרים כולל טרנסלוקציה של מולקולות איתות אחרות כגון STAT3 או MDPs אחרים. לאחרונה התגלה קטן humanin דמויי פפטידים (SHLPs) מקודדים מאזור rRNA 16 שבו humanin מקודד, יש להם מאפיינים דומים אך ברורים בהשוואה ל ח נ17. לדוגמה, SHLP2 ו- SHLP3 להפעיל ERK1/2 לאחר 8 שעות למרות humanin מפעילה ERK1/2 תוך 5 דק Examining subcellular לוקליזציה של ERK1/2 בתגובה פפטידים שונים ייתן לנו הבנה טובה יותר של הביולוגיה של פפטידים אלה. מתעוררים הראיות הראה לוקליזציה subcellular של מולקולות איתות ממלא תפקיד מכריע שלהם אפקטים במורד הזרם. למשל, STAT3 באופן מסורתי ידוע להיות מותאם בעיקר ציטוזול בתאים resting ולאחר מכן זה translocates לתוך הגרעין להפעלת גנים בתגובה ציטוקינים18. STAT3 גם translocates את המיטוכונדריה, מסדיר את המחזור TCA ו- ATP ייצור19. מנשר autophagy, לוקליזציה subcellular שונים של STAT3 ממיקרו autophagy דרכים שונות20. לדוגמה, STAT3 גרעיני transcriptionally מסדיר גנים הקשורים autophagy, משמש אפנן autophagy. Cytoplasmic STAT3 מעכב צורונים autophagy על ידי אינטראקציה עם autophagy מולקולות איתות. STAT3 מיטוכונדריאלי מעכב ומונע mitophagy על-ידי דיכוי autophagy סטרס חמצוני המושרה. לכן, בשיטה זו בידוד תא subcellular חיוני להבנת תפקידם של אחרים איתות מולקולות כמו גם ERK1/2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיפול פפטיד לתאים

  1. צלחת שני מיליון SH-SY5Y או HEK293 תאים (2 x 10 6) לתוך 10 ס מ לחלק ואגדל אותם במשך יומיים
  2. (אופציונלי) למחרת היום, לשטוף את התאים עם סרום ללא Dulbecco ' s השתנה . נשר מדיה בינוני (DMEM) פעם אחת, דגירה עם סרום DMEM חינם למשך הלילה, אם הטיפול צריך להיעשות בתקשורת חינם סרום.
  3. ביום 3, להמיס פפטידים S14G-humanin 0.2 µm מסונן, מים מזוקקים, להשרות אותן כפתרון מניות 1 מ מ.
    הערה: פפטידים צריך להיות מומס הממיס המתאים, אשר יכול להיקבע על ידי מאפייני רצף פפטיד (למשל, תשלום הכולל), ייתכן יינתן על ידי היצרן אם פפטידים זמינים מסחרית. לדוגמה, S14G-humanin, SHLP2, SHLP6, ו MOTS-c מתמוססים במים. Aliquot פפטידים אמצעי אחסון המתאים (למשל, 50 μL) כדי למנוע להקפיא הפשרת מחזורים. ברגע הקרת, אל תשתמש בהם שוב.
  4. Aliquot הנסיוב-המכיל ומחוממת מראש או ללא סרום המדיה 50-mL חרוט צינור ולהוסיף פתרון מניות של 1 מ"מ בטמפרטורת החדר להגיע אל ריכוז העבודה (למשל, 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר).
  5. להחליף את התקשורת עם פתרון פפטיד 6 מ ל מ שלב 1.4. דגירה התאים עבור משך הזמן המתאים.
    הערה: בחר את זמן הדגירה בהתאם למצבך המפעילה טיפשה.

2. Fractionation subcellular ציטוזול, גרעין

  1. לרחוץ את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, לגרד את התאים מהצלחת ב 5 מ של PBS קר כקרח, ולהעביר את המתלים תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  3. וארוקן את PBS ו מחדש להשעות בגדר ב 200 µL קר כקרח, מאגר fractionation (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 3 מ"מ MgCl 2, 10 מ מ אשלגן כלורי, 5% (v/v) גליצרול, 1% ללא יונית חומרים פעילי שטח (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), מעכבי פרוטאז/פוספטאז).
    הערה: כדי לשמור את החלבונים את מעמדם זרחון, החומר המדכא פוספטאז כמו גם פרוטאז מעכב טרי להוסיף דוגמאות יש לשמור על הקרח בכלל פעמים. חוזרים פריזר ואת הפשרה מחזורים של דגימות להימנע. דוגמאות aliquot לתוך כמות קטנה (למשל 50 μg) לפני הקפאת אותם ב-80 מעלות צלזיוס
  4. דגירה בגדר תנאי מחדש על קרח למשך 15 דקות, ואז צנטריפוגה ב 250 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  5. לאסוף את תגובת שיקוע כמו השבר cytoplasmic ולשמור את גלולה עבור השבר הגרעין.
  6. Centrifuge את תגובת שיקוע כדי להסיר את הלכלוך הסלולר מזהמים אחרים ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge. זהו השבר ציטוזול-
  7. Resuspend בגדר במאגר שטיפת קר כקרח 200 μL (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl 2, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז), צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C
  8. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר החילוץ קר כקרח, גרעיני μL 100 (20 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl 2, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז) ו sonicate פי 10 (5 s ב, 10 s 30% כח.). על קרח
  9. צנטריפוגה ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 º C.
  10. להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר הגרעין.
  11. Quantify כמות החלבון שימוש assay BCA

3. שבר מיטוכונדריאלי גולמי

  1. לרחוץ את התאים בכל צלחת 10 ס מ עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, הוסף 5 מ ל PBS קר כקרח, לנתק את התאים באמצעות המגרד של תא.
    הערה: השתמש שלוש מנות 10 ס מ של תאים כדי להשיג תשואה טובה של המיטוכונדריה המערבי סופג.
  2. להעביר התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, ולשלב מתוך שלוש מנות 10 ס מ לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל.
  3. Centrifuge התאים ב 600 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  4. מחוק לגמרי מגניב והשהה מחדש בגדר ב 1 מ"ל של המיטוכונדריה כקרח בידוד מאגר (10 מ מ טריס-סחבות, 1 מ"מ EGTA/טריס, 200 מ"מ סוכרוז, להתאים את ה-pH = 7.4).
  5. Homogenize התאים במשיחות 25 של מהמגן 2 מ עם שהעקב מצופה טפלון על קרח
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריאלי ולמקסם את התשואה של השבר מיטוכונדריאלי. צריך להיות מוטבת מספר קווים עבור כל סוג התא. Precool את מהמגן לפני תחילת ההליך.
  6. להעביר את homogenate צינור microcentrifuge ו- centrifuge זה ב 600 x g 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה.
  7. לאסוף את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור microcentrifuge ו centrifuge זה ב g 7,000 x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    הערה: בגדר משוחרר, לאסוף את תגובת שיקוע בזהירות ולנסות שלא להפריע בגדר.
  8. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות את גלולה עם 200 μL מאגר בידוד המיטוכונדריה קר כקרח, להעביר את הפתרון צינור microcentrifuge. Centrifuge את הצינור ב 7,000 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    9. חזור על שלב 3.8 לשטוף בגדר
  9. . אין צורך להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge בשלב זה.
  10. להסיר את תגובת שיקוע בגדר שטף והשהה מחדש את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 50 μL מאגר ריפה.
  11. Incubate התליה על קרח במשך 10 דקות
  12. Centrifuge התליה על 16,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  13. להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר מיטוכונדריאלי.
  14. לכמת את כמות חלבון באמצעות וזמינותו של BCA-

4. המערבי סופג חלבונים ספציפיים פוספו

  1. לבצע על אלקטרופורזה בג'ל מרחביות-לזיהוי (8-16% premade ג'ל) ולהעביר את החלבון ממברנה PVDF 4.
  2. דגירה הקרום עם 5% BSA ב- TBST (0.1% Polysorbate 20) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים רקע.
    הערה: לצורך זיהוי החלבון phosphorylated, לחסום את הקרום עם BSA. חלב. החלב מכיל קזאין, phosphoprotein שופע, כשהתוצאה היא אות לא ספציפית גבוה.
  3. דגירה הקרום עם נוגדן ראשוני (anti-פוספו-ERK1/2) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. למחרת, לשטוף את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. דגירה הקרום עם נוגדנים משניים (אנטי-ארנב HRP) לשעה בטמפרטורת החדר.
  6. לרחוץ את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. דגירה הקרום עם פתרון ECL ואת התמונה הקרום במנתח התמונה.
  8. רצועת הקרום עם בנוכחות אחר מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 5 דק.
  9. חזור על השלבים 4.2 ל 4.7 באמצעות הנוגדן ERK1/2 סה כ אנטי-
  10. לבדיקת הטוהר של כל שבר, לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ולבצע immunoblots באמצעות נוגדנים זיהוי סמנים עבור כל תא (למשל, מיטל B1 עבור גרעין, GAPDH עבור ציטוזול ולאחר TOM20 עבור המיטוכונדריה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך המובאת כאן, התייחסנו תאים HEK293 ו- SH-SY5Y עם 1 μM, 100 μM S14G-humanin, עוצמה humanin אנלוגית21, בהתאמה, ב להשלים מדיה עבור פרקי זמן המצוין (איור 1א' ו איור 1 B). אז בדקנו הכולל, phosphorylated בצורת ERK1/2-חמישי202/Tyr204 מ תמציות חלבונים הכולל. הטיפול S14G-humanin הראו עלייה זירחון של ERK1/2 ב שלה תקינה חמישי202/Tyr204 באתר. לוקליזציה subcellular של ERK1/2 ממלא תפקיד חשוב בתפקוד שלה איתות, במיוחד בהשגת ירידה לפרטים שלה. כדי להבין את המטרה של הפעלת S14G humanin-בתיווך ERK1/2, אנו ניתח לוקליזציה subcellular של סה כ, phosphorylated ERK1/2 לאחר הטיפול S14G-humanin. בתאים HEK293, טיפשה phosphorylated גדל בשני הציטופלסמה, גרעין, אך לא בתוך המיטוכונדריה (איור 2א). מעניין, טיפשה phosphorylated ירד בחודש ציטופלזמה גרעין, מיטוכונדריה בתאי SH-SY5Y (איור 2B). תוצאות אלו מראים שאת זרחון S14G humanin-בתיווך טיפשה עשוי לשחק תפקיד שונה לסוגי תאים שונים ותנאים שונים. לכן, נדרשים מחקרים נוספים כדי לנתח הלוקליזציה של S14G humanin-בתיווך זירחון של ERK1/2 בתאים subcellular אחרים, כפי phosphorylated ERK1/2 translocates לתוך גרעין, מיטוכונדריה, endosomes/lysosomes, ו ממברנות שונות.

Figure 1
איור 1: S14G-humanin מגביר זירחון של ERK1/2 תאים HEK293 ו- SH-SY5Y. כימות ונציג שהכלים המערבי של הפעלת טיפשה ב תאים HEK293 (א) ו- (B) SH-SY5Y. סה תא lysates בעקבות מיקרומטר (א) 1 או טיפול S14G-humanin 100 מיקרומטר (B) ב- DMEM בתוספת 10% FBS הצביעו עבור תקופות זמן היו immunoblotted באמצעות אנטי-פוספו - וסה כטיפשה 1/2 (Thr202/Tyr204). דמות זו שונתה מ קים. et al. 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Phosphorylated ERK1/2 הוא מקומי ציטוזול, גרעין של תאים subcellular אחרים על הטיפול S14G-humanin בתאים HEK293 ו- SH-SY5Y. נציג שהכלים המערבי מציג לוקליזציה subcellular ERK1/2 (n = 3). HEK293 (א) תאים שטופלו מיקרומטר 1 S14G-humanin. Cytosolic (15 µg), גרעיני (15 µg ו- 50 µg), lysates (15 μg) מיטוכונדריאלי היו immunoblotted באמצעות נוגדן פוספו - וסה כטיפשה. תאים שטופלו 100 מיקרומטר (B) SH - SY5Y S14G-humanin. שברים מיטוכונדריאלי התקבלו 30 דקות לאחר הטיפול S14G-humanin. Lysates (15 µg) cytosolic, גרעינית ו מיטוכונדריאלי היו immunoblotted באמצעות נוגדן פוספו - וסה כטיפשה. נוגדן anti-Tom20 אנטי-GAPDH, חיים דרוקר Anti B, שימשו את סמני שבר cytosolic, הגרעיני מיטוכונדריאלי, בהתאמה. דמות זו שונתה מ קים. et al. 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: מאגרים עבור ציטוזול, גרעיני, ושבר מיטוכונדריאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

. הנה, הפגנו כי humanin בתיווך פפטיד ERK1/2 הפעלת מתרחשת בשני סוגי תאים שונים, לוקליזציה subcellular של מופעל ERK1/2 יכולה להיות שונה בהתאם לתנאים (למשל, מנה של פפטיד, נקודת זמן תא סוג). הוכח כי humanin אותות דרך שני קולטנים שונים22,23, אשר עשוי להסביר את ההבדלים איתות בין הקווים שני תאים, כמו גם הדרישה מינונים שונים של humanin. ההשלכות הפיזיולוגיות של זה לא מלא נחקרו אך זה יכול להציע מנגנון אפשרי אחד עבור התגובות HN תלויות רקמות.

זרחון של ERK1/2 ממלאת תפקיד מכריע ERK1/2 מערכת אזעקה ומציג המצב זירחון של ERK1/2 שינויים דינמיים. חשוב למטב את התנאים מתי ERK1/2 הוא phosphorylated תחת תנאי/גירוי ספציפי. כדי להשיג זאת, התנאים גירוי שונים (למשל, מנה, בינוני) ולנסות קורסים זמן למצוא כאשר הרמה הגבוהה ביותר של זרחון מושגת. רוב המחקרים התמקדו רק זרחון ERK1/2 ב- cell סך הכל lysates. עם זאת, התוצאות עשוי לספק מידע מוגבל תפקודית ככל ERK1/2 יכול לקיים אינטראקציה עם מטרות שונות לווסת את מפלי במורד הזרם שונות בתאים subcellular ספציפיים. לפיכך, בחינת ההתאמה subcellular של phosphorylated ERK1/2 נותן הבנה טובה יותר של התפקיד של הפעלת ERK1/2.

Fractionation subcellular לאחר הפעלת ERK1/2 יכול לשמש כמקור לימוד נוסף (למשל, co-immunoprecipitation) כדי לזהות מטרות במורד הזרם הרומן כי fractionation subcellular יכול להעשיר עבור מטרות במורד הזרם של ERK1/2. בשיטה זו ניתן ליישם אחרים מולקולות איתות כי הם translocated לתוך תאים subcellular שונים על גירויים לאחר אופטימיזציה של התנאים.

למרות שיטות שונות כדי לבודד את המיטוכונדריה הוצעו בעשורים האחרונים, יש זיהום חלקית של תאים subcellular אחרים. שיטת בידוד מיטוכונדריאלי גולמי המוצע כאן מכיל גם כמות מוגבלת של הציטופלסמה מזהמים. כמו כמות הזיהום הוא קטן, אנו רואים כי היא עדיין שיטה חוקית לגילוי הלוקליזציה של ERK1/2 לתוך המיטוכונדריה בעת ההפעלה. כמו פפטידים אינן בהכרח יציב בתמיסה, זה לפעמים קשה לשמור על עקביות בין ניסויים. הקפד לבצע aliquots קטן של פפטיד פתרון כדי להימנע אפקטים הפשרת ההקפאה וכדי לשפר את העקביות של פפטיד פעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

פנחס כהן הוא בעל מניות, יועץ CohBar, inc. קלווין ין שימש כיועץ של CohBar, inc.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הבתר אליסון/עפר בתוכנית לחקר הזדקנות כדי SJK, פרס גלן וחדר NIH מעניקה למחשב (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). כל המחברים מופיע בסרט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell signaling 9102 Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) Cell signaling 4370 Dilution 1:1,000
Lamin B1 Cell signaling 12586 Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH Cell signaling 5174 Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20 Santa cruz SC-17764 Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated Cell signaling 7074 Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 89900
100 mm Culture Dish ThermoFisher SCIENTIFIC 12556002
HNG peptide Genescript
25mm sylinge filter ThermoFisher SCIENTIFIC 09-719A
HEPES Sigma H3375
MgCl2 Sigma M8266
KCl Sigma P9333
Glycerol Sigma G9012
Triton X-100 ThermoFisher SCIENTIFIC BP151-100
EDTA Sigma 3609
MOPS Sigma M1254
EGTA Sigma E3889
Sucrose Sigma S7903
Tris-base ThermoFisher SCIENTIFIC BP152-1
HCL Sigma H1758
PBS Lonza 17-512F
Cell Scraper FALCON 353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) ThermoFisher SCIENTIFIC 78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles Thomas Scientific 3432S90
Tween-20 ThermoFisher SCIENTIFIC BP337-500
BSA ThermoFisher SCIENTIFIC BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BIO RAD 4561104
Mini Trans-Blot Module BIO RAD 1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System BIO RAD 1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit BIO RAD 1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates BIO RAD 1705060
Restore Western blot stripping buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11965-092
Sonicator, Medel: FB120 ThermoFisher SCIENTIFIC 695320-07-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 127 Mitochondrial נגזר פפטידים (MDPs) טיפשה המיטוכונדריה fractionation פפטיד טיפול ציטוזול ואת גרעין fractionation זירחון
Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S. J., Xiao, J., Cohen, P.,… More

Kim, S. J., Xiao, J., Cohen, P., Yen, K. Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment. J. Vis. Exp. (127), e56496, doi:10.3791/56496 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter