Summary
Bu iletişim kuralı, mitokondrial kaynaklı peptidler içeren hücreleri uyarmak ve sinyal cascade ve yerelleştirme fosfo-proteinlerin değerlendirmek açıklar.
Abstract
Mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) küçük açık okuma çerçevesi mitokondri genom kopyası bilinen diğer genler içinde tarafından kodlanmış peptidler yeni bir sınıf vardır. MDP'ler çok çeşitli nöronların apoptosis korumak, metabolik işaretçileri artırma ve kemoterapi hücrelerin korunması gibi biyolojik etkileri var. Humanin ilk MDP keşfedilmeyi ve en çok çalışılan peptid MDP aile arasında. Membran reseptörleri ve humanin aşağı akım sinyal yollar dikkatle karakterize. MOTS-c ve SHLP1-6 gibi ek MDP'ler daha Geçenlerde bulunduktan ve sinyal mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır zorunda. Burada Bu peptidler işlevini belirlemek için bir hücre kültür dayalı yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, hücre ayırma teknikleri, western Blot birlikte harekete geçirmek kantitatif tayin ve translocation önemli sinyal molekülünün için izin verir. Hücre ayırma başka yöntemler olmakla birlikte, burada açıklanan bir kolay ve basit yöntemdir. Bu yöntemler Bu peptidler ve diğer terapötik ajanlar etki mekanizması daha fazla aydınlatmak için kullanılabilir.
Introduction
Ortaya çıkan çalışmalar mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) cytoprotection ve metabolizma1,2,3' te önemli rol oynarlar göstermektedir. Sinyal iletim yolu MDP'ler huzurunda anlama bize hangi çeşitli işlevleri MDP'ler modüle mekanizması görmemizi sağlar. İlk tanımlanan MDP, humanin, hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz 1/2 (ERK1/2) artırmak için gösterilmiştir fosforilasyon, reseptör4,5bağlama aracılığıyla. Ancak, ERK1/2 aktivasyon aşağı akım etkisi hala underexplored.
ERK1/2 basamaklı hücresel süreçler yayılması, hücre göç, hücresel metabolizma, hayatta kalma ve Apoptozis6,7,8de dahil olmak üzere çeşitli önemli bir aracı olarak hizmet vermektedir. Tüm alacak için ayrı bu hücresel süreçler, aktivite ve ERK1/2 hücre altı yerelleştirme sıkıca fosfatazlar ve İskele proteinler9,10tarafından düzenlenmektedir. Translasyon modifikasyon ek olarak, dinamik ERK1/2 / mekik onun sinyal işlevi, aktivite ve özgüllük11,12düzenlemektedir. ERK1/2 öncelikle sitozol13' te lokalize edilmiştir. Ankraj ve İskele proteinler bir dizi yardımcı organelleri, yüzey veya dağınık sitoplazma13' te hücre iskeleti elemanları ERK1/2 korumak. Stimülasyon, üzerine ERK1/2 fosforile ve onun ankraj proteinler ERK1/2 translocation çekirdeği, mitokondri, Golgi ve organellerin14, de dahil olmak üzere diğer hücre altı bölmeleri için sağlayan ayrışmış olur 15 , 16.
Humanin ERK1/2 yolu sinyal etkinleştirmek için bilinen rağmen ERK1/2 aktivasyonu sadece toplam hücresini lysates görülmektedir. ERK1/2 hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkisi, hem hücre altı yerelleştirme analizi ve toplam düzeyde önemli bir rol oynar bu yana daha önce açıklandığı gibi fosforile ERK1/2 kapsamlı bir anlayış sağlamak için gerekli humanin kaynaklı ERK1/2 harekete geçirmek ve aşağı akım hedefleri aktivasyonu.
Aktif ERK1/2 hedef organelleri anlamak için hücre altı ayırma fosforile ERK1/2 için western Blot tarafından takip gerçekleştirildi. Standart laboratuar ekipmanları ve Kimyasalları kullanır gibi bu yöntem kolayca uygulanabilir. İzole hücre altı bölmeleri delikanlı yorumlanması için sonuçlar sağlayan yüksek saflık vardır. Immunostaining ERK1/2 benzer sonuçlara neden olabilir. Ancak, belirli hücre altı bölmeleri nispeten zor görselleştirmek ve özel fiksasyon ve permeabilization yöntemleri gerektirir. Hücre altı bölmeleri ERK1/2 düzeyleri farklılık ve bu değişim tüm cep telefonu lysates bakıldığında yanlış pozitif ve yanlış olumsuz sinyaller neden olabilir. Bu nedenle, bir immunoblot izole hücre altı bölmeleri kullanarak bize ERK1/2 yerelleştirme daha iyi bir anlayış verir.
Yöntem çok yönlülük değişiklikler diğer MDP'ler veya translocation ile STAT3 başka sinyal moleküllerin de dahil olmak üzere diğer uyarıcı etkilerini araştırmak için iletişim kuralı sağlar. Son zamanlarda keşfedilen küçük humanin benzeri peptidler (yelken) nerede humanin kodlanır ve onlar-si olmak benzer ancak farklı özellikleri HN17' ye göre 16S rRNA bölgesinden kodlanır. Örneğin, 5 dk. ERK1/2 İnceleme yanıt-e doğru farklı peptidler hücre altı yerelleştirme içinde ERK1/2 humanin etkinleştirir, ancak 8 h bize Bu peptidler Biyoloji daha iyi bir anlayış verir sonra SHLP2 ve SHLP3 ERK1/2 etkinleştirin. Kanıt ortaya çıkan sinyal molekülleri, hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkileri önemli bir rol oynar gösterdi. Örneğin, STAT3 geleneksel olarak öncelikle resting hücrelerdeki sitozol yerelleştirilecek bilinmektedir ve sonra gen ekspresyonu sitokinler18yanıt olarak etkinleştirmek için çekirdek içine translocates. STAT3 Ayrıca mitokondri için translocates ve TCA döngüsü ve ATP üretimi19düzenlemektedir. Autophagy Yönetmeliği ile ilgili çeşitli yolları20autophagy STAT3 farklı hücre altı yerelleştirme modüle. Örneğin, nükleer STAT3 transcriptionally autophagy ile ilgili genleri düzenler ve bir autophagy modülatör davranır. Sitoplazmik STAT3 moleküller sinyal autophagy ile etkileşerek autophagy yapısal engeller. Mitokondrial STAT3 engeller ve oksidatif stres indüklenen autophagy baskılayarak mitophagy engeller. Bu nedenle, bu hücre altı yuvası ayırma yöntemi diğer sinyal molekülleri yanı sıra ERK1/2 rolünün anlaşılması için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. peptid tedavi hücrelere
- iki milyon SH-SY5Y plaka veya HEK293 hücrelere 10 cm (2 x 10 6) yemek ve onlar için 2 gün
- (isteğe bağlı) ertesi gün, Dulbecco serum içermeyen hücrelerle yıkama ' s modifiye Orta (DMEM) medya bir kez kartal ve ücretsiz DMEM gecede serum boş ortam içinde yapılması gereken tedavi ihtiyacı varsa serum ile kuluçkaya.
- 3 günde S14G-humanin peptidler µm filtre, distile su ve 1 mM hisse senedi çözüm olarak sulandırmak 0,2 içinde erimesi.
Not: Peptidler peptid (örneğin, genel ücret) sıra özellikleri tarafından belirlenen ve peptidler ticari olarak kullanılabilir durumdaysa üreticisi tarafından sağlanan uygun çözücü içinde çözünmüş. Örneğin, S14G-humanin, SHLP2 ve SHLP6 ve MOTS-c suda çözülür. Aliquot peptidler döngüleri erime ve donma önlemek için bir uygun birimi (örneğin, 50 μL) içinde. Bir kez çözdürülen, bunları tekrar kullanmayın. - Aliquot Önceden ısıtılmış serum içeren veya bir 50 ml konik tüp ve bir çalışma konsantrasyonu (örneğin, 1 µM, 10 µM) yapmak için oda sıcaklığında 1 mM hisse senedi çözüm eklemek serum-Ücretsiz medya.
- Yerine medya ile 6 mL peptid eriyik--dan adım 1.4. ve hücreleri uygun süreyi için kuluçkaya.
Not: kuluçka süresi ERK etkinleştiren, koşula bağlı olarak seçin.
2. Sitozol ve çekirdeği için hücre altı ayırma
- buz gibi PBS 10 mL iki kez hücrelerle yıkama, hücreleri 5 mL buz gibi PBS de plaka kapalı kazımak ve hücre süspansiyon 15 mL konik tüp içine transfer.
- Hücreleri, 500 x g 5 min için saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- PBS Aspire edin ve Pelet buz gibi ayırma arabellek 200 µL içinde yeniden askıya alma (10 mM HEPES pH 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, %5 (v/v) gliserol, % 1 iyonik olmayan yüzey aktif (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) = n), proteaz/fosfataz inhibitörleri).
Not: protein fosforilasyon durumları tutmak için fosfataz inhibitörü olarak iyi proteaz inhibitörü taze eklenmelidir ve örnekleri buza hiç tutulmalıdır zaman. Donma ve erime yinelenen örnekleri döngüleri kaçınılmalıdır. Onları-80 buz gibi önce az miktarda (örneğin 50 μg) içine aliquot örnekleri ° C. - 15 dakika buzda yeniden askıya alınmış Pelet kuluçkaya ve 5 min için 250 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant sitoplazmik kesir olarak toplamak ve Pelet nükleer kesir için devam.
- Hücresel enkaz ve 18.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de diğer kirleri çıkarmak ve sonra süpernatant yeni bir microcentrifuge tüp içine aktarmak için süpernatant santrifüj kapasitesi. Sitozol kesir bu.
- Pelet 200 μL buz gibi yıkama arabellekte resuspend (10 mM HEPES pH 7,6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, %25 (v/v) gliserol, 0.2 mM EDTA, proteaz/fosfataz inhibitörleri =) ve 4 ° C'de 5 min için 250 x g, santrifüj
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet 100 μL buz gibi nükleer ayıklama arabellekte resuspend (20 mM HEPES pH 7,6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, %25 (v/v) gliserol, 0.2 mM EDTA, proteaz/fosfataz inhibitörleri =) ve 10 kez solüsyon içeren temizleyicide (5 üzerinde 10 s s Çekil, % 30 amp.) buz üzerinde
- Santrifüj 18.000 x g 4 ° C'de 10 dk de
- Yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarın. Nükleer kesir bu.
- Miktarını BCA tahlil kullanarak protein miktarı
3. ham mitokondrial kesir
- buz gibi PBS 10 mL ile her 10 cm çanak hücrelerde yıkama, 5 mL buz gibi PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak.
Not: Western Blot mitokondri, iyi bir verim almak için üç 10 cm yemekleri hücre kullanın. - Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak ve her üç 10 cm yemeklerini bir 15 ml konik tüp içine birleştirmek.
- Hücreleri, 10 min 600 x g 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- PBS Aspire edin ve Pelet 1 mL buz gibi mitokondri yalıtım arabellek yeniden askıya alma (10 mM Tris-BEZLERİ, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM Sükroz, ayarlamak için pH 7.4 =).
- Buz üzerinde politetrafloroetilen kaplamalı havaneli ile 25 vuruş 2 mL homogenizer hücrelerle homojenize
Not: Bu mitokondri bütünlüğünü korumak ve mitokondrial kesir verimi en üst düzeye çıkarmak için kritik bir adımdır. Vuruş sayısı her hücre türü için optimize edilmelidir. Yordamına başlamadan önce homogenizer precool. - Homogenate bir microcentrifuge tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C'de çekirdeği ve kesilen hücreleri kaldırmak için 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant toplamak, yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve 7000 x g 10 min için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
Not: Pelet gevşemiş, süpernatant özenle toplamak ve Pelet bozmamaya çalışın. - Süpernatant kaldırmak, pelet 200 μL buz gibi mitokondri yalıtım arabelleği ile yeniden askıya alma ve çözüm için yeni bir microcentrifuge tüp aktarın. 7000 x g 10 dk de tüp 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Pelet yıkamak için yineleme adım 3.8. Bu adımda yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarmak gerekli değildir.
- Süpernatant yıkanmış Pelet kaldır ve mitokondri ile 50 μL RIPA arabelleği içeren Pelet yeniden askıya alma.
- Incubate 10 dakika süreyle buzda süspansiyon
- Süspansiyon 16.000 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarın. Mitokondrial kesir bu.
- BCA tahlil kullanarak protein miktarı ölçmek.
4. Western Blot fosfo-spesifik proteinler için
- bir SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (8-%16 erken jel) gerçekleştirmek ve protein bir PVDF membran 4 ' e transfer.
- Kuluçkaya membran TBST %5 BSA ile (% 0,1 Polysorbate 20) arka plan belirsiz bağlayıcı siteleri engellemek için oda sıcaklığında 30 dk için.
Not: fosforile protein tespiti için membran BSA değil süt ile engelleyin. Süt içeren kazein, yüksek nonspesifik sinyal sonuçları bir bol miktarda Fosoprotein. - Membran 4 ° C'de birincil antikoru (anti-fosfo-ERK1/2) ile bir gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, membran TBST ile yıkayın (% 0,1 polysorbate 20) üç kere oda sıcaklığında 5 min için.
- Membran ile ikincil antikoru (Anti-tavşan HRP) oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Membran TBST ile yıkayın (% 0,1 polysorbate 20) üç kere oda sıcaklığında 5 min için.
- Membran ECL çözüm ile kuluçkaya ve Image analyzer membran görüntü.
- Şerit arabellek 15 dakika oda sıcaklığında ve yıkama membran ile TBST üç kez 5 dakika süreyle sıyırma ile membran
- 4.2-4.7 kullanarak anti-toplam ERK1/2 antikor arasındaki adımları yineleyin.
- Her kesir saflığı kontrol etmek için SDS-sayfa çalıştırmalarına ve işaretleri her bölmesi (örneğin, Okan B1 çekirdeği, sitozol için GAPDH ve TOM20 mitokondri için) için tanıma antikorları kullanarak immunoblots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan işlemi uygulayarak, biz 1 mikron ve 100 mikron HEK293 ve SH-SY5Y hücrelerle tedavi S14G-humanin, bir güçlü humanin analog21, sırasıyla, içinde tamamlamak medya belirtilen süreler için (Resim 1A ve şekil 1 B). sonra ERK1/2 Toplam ve fosforile şeklinde Thr202/Tyr204 toplam proteini özleri itibariyle incelenmiştir. S14G-humanin tedavi ERK1/2 fosforilasyon, onun yasal Thr202/Tyr204 Site artış gösterdi. ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu özellikle onun özgüllüğü almakla sinyal işlevi, önemli bir rol oynar. S14G-humanin-aracılı ERK1/2 harekete geçirmek hedef anlamak için toplam hücre altı lokalizasyonu analiz ve ERK1/2 S14G-humanin tedavi aşağıdaki fosforile. HEK293 hücrelerde fosforile ERK ikimiz de arttı sitoplazma ve çekirdek, ama (Şekil 2A) mitokondri içinde. İlginçtir, sitoplazma, çekirdek ve (Şekil 2B) SH-SY5Y hücrelerde mitokondri fosforile ERK azalmıştır. Bu sonuç S14G-humanin-aracılı ERK fosforilasyon farklı hücre türleri ve farklı koşullarda farklı bir rol oynayabilir öneririz. Fosforile ERK1/2 translocates gibi çekirdek, mitokondri, endosomes/organellerin, bu nedenle, daha fazla çalışmaları yerelleştirme ERK1/2 hücre altı diğer bölmeleri içinde S14G-humanin-aracılı fosforilasyon çözümlemek için gereklidir ve çeşitli membran.
Şekil 1: S14G-humanin ERK1/2 HEK293 ve SH-SY5Y hücrelerdeki fosforilasyon artırır. ERK etkinleştirme(a)HEK293 ve (B) SH-SY5Y hücreleri'Batı lekesi miktar ve temsilcisi. Toplam hücre lysates (A) 1 µM veya (B) 100 µM S14G-humanin DMEM % 10 ile desteklenmiş tedavisinde aşağıdaki FBS için belirtilen süreler anti-fosfo ve toplam ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) kullanarak immunoblotted vardı. Bu rakam Kim vd değiştirildi 4 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Fosforile ERK1/2 sitozol, çekirdek ve hücre altı diğer bölmeleri S14G humanin tedavi HEK293 ve SH-SY5Y hücreleri üzerine yerelleştirilmiş. ERK1/2 hücre altı yerelleştirme gösterilen temsilcisi Batı lekesi (n = 3). Hücreleri 1 µM ile tedavi(a)HEK293 S14G-humanin. Sitozolik (15 µg), nükleer (15 µg ve 50 µg), ve mitokondriyal (15 μg) lysates fosfo ve toplam ERK antikor kullanarak immunoblotted. (B) SH - SY5Y hücreleri 100 µM ile tedavi S14G-humanin. Mitokondrial kesirler 30 dk S14G humanin tedavi sonrasında elde edilmiştir. Sitozolik, nükleer ve mitokondriyal (15 µg) lysates fosfo ve toplam ERK antikor kullanarak immunoblotted vardı. Anti-GAPDH, B, Anti-Okan anti-Tom20 antikor sırasıyla sitozolik, nükleer, mitokondrial kesir işaretleri kullanılmıştır. Bu rakam Kim vd değiştirildi 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Sitozol, nükleer, arabelleklerini ve mitokondrial kesir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, biz iki farklı hücre tiplerinde humanin peptid-aracılı ERK1/2 Etkinleştirme oluşuyor ve aktif ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu (örneğin, peptid, zaman nokta ve hücre doz koşullara bağlı olarak farklı olabilir gösterdi yazın). O humanin göstermiştir-sinyal içinde iki hücre hatları gibi farklı dozda kullanımının humanin gereksinimini farklılıkları açıklayabilir iki farklı reseptörleri22,23, sinyalleri. Bu fizyolojik etkileri değil tam olarak incelenmiştir ama HN doku bağımlı yanıt için olası bir mekanizma önerebilir.
Fosforilasyon ERK1/2 ERK1/2 sinyal içinde önemli bir rol oynar ve ERK1/2 fosforilasyon durumunu dinamik değişiklikleri gösterir. ERK1/2 altında belirli bir koşul/uyarıcı fosforile bulmak için koşulları optimize etmek önemlidir. Bunu başarmak için farklı stimülasyon koşulları (örneğin, doz ve orta) deneyin ve ne zaman fosforilasyon en üst düzeyde elde bulmak için zaman içerisinde kuralları. Çalışmalar çoğunluğu sadece toplam hücresini lysates ERK1/2 fosforilasyon üzerinde duruldu. Ancak, ERK1/2 farklı hedefler ile etkileşim ve aşağı akım Cascade'lerde farklı belirli hücre altı bölmeleri modüle sonuçları sınırlı fonksiyonel bilgi sağlayabilir. Bu nedenle, fosforile ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu inceleyerek ERK1/2 aktivasyon rolünün daha iyi bir anlayış verir.
ERK1/2 aktivasyon sonra hücre altı ayırma daha fazla çalışma (örneğin, co-immunoprecipitation) kaynağı olarak hücre altı ayırma ERK1/2 aşağı akım hedefler için zenginleştirebilirsiniz çünkü roman aşağı akım hedefleri tanımlamak için kullanılabilir. Sonra en iyi duruma getirme koşulları üzerine bir çekim gücü farklı hücre altı bölmeleri içine translocated diğer sinyal molekülleri bu yöntem uygulanabilir.
Mitokondri izole etmek için çeşitli yöntemler son on yıl içinde önerilen olsa kısmi hücre altı diğer bölmeleri kirlenme. Burada önerilen ham mitokondrial yalıtım yöntemini de sınırlı miktarda sitoplazma kirletici maddeleri içerir. Kirlilik miktarını küçük olduğu için biz hala ERK1/2 yerelleştirme mitokondri etkinleştirme üzerine içine tespit için geçerli bir yöntem olduğunu düşünün. Peptidler mutlaka çözümde kararlı değil gibi bazen deneyler arasında tutarlılık sağlamak zordur. Peptid çözeltinin donma-çözülme etkilerinden korunmak ve peptid etkinlik tutarlılığını artırmak için küçük aliquots emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bir hissedar ve Yen CohBar, Inc. bir danışman olarak hizmet vermiştir CohBar, Inc Kelvin danışmanlığını Pinchas Cohen olduğunu
Acknowledgments
Bu eser bir Ellison/AFAR doktora sonrası bursu SJK için eskime araştırma programı tarafından desteklenen ve Glenn Vakfı Ödülü ve NIH verir PC için (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tüm yazarlar filmde görünür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
