Summary
Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.
Abstract
Peptidi mitocondriale-derivati (MDPs) sono una nuova classe di peptidi che sono codificati da piccolo open reading frame all'interno di altri noti geni del genoma mitocondriale. MDPs hanno un'ampia varietà di effetti biologici quali proteggere i neuroni dall'apoptosi, migliorare gli indicatori metabolici e proteggere le cellule da chemioterapia. Humanin era la MDP prima di essere scoperto ed è il peptide più studiato tra la famiglia MDP. I recettori di membrana e vie di segnalazione a valle di humanin sono state caratterizzate con attenzione. MDPs aggiuntive quali MOTS-c e SHLP1-6 sono stati scoperti più di recente e i meccanismi di segnalazione devono ancora essere delucidato. Qui descriviamo un metodo di coltura basata di cella per determinare la funzione di questi peptidi. In particolare, tecniche di frazionamento cellulare in combinazione con macchiarsi occidentale consentono la determinazione quantitativa dell'attivazione e spostamento della molecola di segnalazione importante. Mentre ci sono altri metodi di frazionamento cellulare, quello qui descritto è un metodo facile e semplice. Questi metodi possono essere utilizzati più ulteriormente per delucidare il meccanismo di azione di questi peptidi e altri agenti terapeutici.
Introduction
Gli studi emergenti indicano che peptidi mitocondriali-derivati (MDPs) svolgono i ruoli importanti nel metabolismo e nella citoprotezione1,2,3. Capire la via di trasduzione del segnale in presenza di MDPs ci dà comprensione nel meccanismo da cui MDPs modulano varie funzioni. Il primo MDP identificati, humanin, ha dimostrato di aumentare la chinasi segnale-regolata extracellulare 1/2 (ERK1/2) fosforilazione attraverso suo recettore vincolante4,5. Tuttavia, l'effetto a valle dell'attivazione di ERK1/2 è ancora aggiunto.
La cascata di ERK1/2 serve come un mediatore essenziale in una varietà di processi cellulari compreso proliferazione, migrazione cellulare, il metabolismo cellulare, sopravvivenza ed apoptosi6,7,8. Ad per orchestrare tutti questi processi cellulari distinti, l'attività e la localizzazione subcellulare di ERK1/2 sono strettamente regolate da fosfatasi e impalcatura proteine9,10. Oltre a modificazione post-traduzionale, la dinamica di marcia di ERK1/2 inoltre regola la sua segnalazione funzione, attività e specificità11,12. ERK1/2 è localizzato principalmente nel citosol13. Un insieme delle proteine di ancoraggio e impalcatura aiutano a trattenere ERK1/2 in elementi del citoscheletro, sulla superficie degli organelli, o diffusa nel citoplasma13. Stimolazione, ERK1/2 è fosforilato e viene dissociato dalle sue proteine di ancoraggio, che permette la traslocazione di ERK1/2 ad altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo, mitocondri, Golgi e lisosomi14, 15 , 16.
Anche se humanin è noto per attivare la via di segnalazione di ERK1/2, l'attivazione di ERK1/2 è osservata solo nei lisati cellulari totali. Come descritto in precedenza, poiché la localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nel suo effetto a valle, l'analisi della localizzazione subcellulare e i livelli totali di fosforilata ERK1/2 è necessario fornire una comprensione globale di attivazione di ERK1/2 indotta da humanin e l'attivazione di obiettivi a valle.
Per comprendere gli organelli bersaglio di attivazione di ERK1/2, è stato effettuato il frazionamento subcellulare seguito mediante western blotting per fosforilata ERK1/2. Questo metodo può essere facilmente implementato come sfrutta i reagenti e la normale attrezzatura da laboratorio. I compartimenti subcellulari isolati sono di elevata purezza, permettendo i risultati semplicemente essere interpretati. Immunostaining di ERK1/2 può produrre risultati simili. Tuttavia, alcuni compartimenti subcellulari sono relativamente difficili da visualizzare e richiedono metodi di fissazione e permeabilizzazione speciali. ERK1/2 livelli variano in compartimenti subcellulari, e questa variazione potrebbe causare falsi positivi e falsi negativi segnali quando guardando lisati di cellule intere. Pertanto, un immunoblot utilizzando compartimenti subcellulari isolati ci dà una migliore comprensione della localizzazione di ERK1/2.
La versatilità del metodo consente modifiche del protocollo per studiare gli effetti di altri stimolanti tra cui altri MDPs o la traslocazione di altre molecole di segnalazione come STAT3. Recentemente scoperti piccoli peptidi simil-humanin (SHLPs) sono codificati dalla regione di rRNA 16S dove humanin viene codificato, e hanno proprietà simili ma distinti rispetto a HN17. Ad esempio, SHLP2 e SHLP3 attiva ERK1/2 dopo 8 h sebbene humanin attiva ERK1/2 entro 5 min Examining localizzazione subcellulare di ERK1/2 in risposta a diversi peptidi ci darà una migliore comprensione della biologia di questi peptidi. La prova emergente ha mostrato che la localizzazione subcellulare delle molecole di segnalazione svolge un ruolo cruciale nei loro effetti a valle. Per esempio, STAT3, tradizionalmente, è noto per essere localizzato principalmente nel citosol nelle cellule a riposo, e quindi trasloca nel nucleo per attivare l'espressione genica in risposta a citochine18. STAT3 inoltre trasloca ai mitocondri e regola il ciclo del TCA e ATP produzione19. Per quanto riguarda il regolamento di autofagia, diversa localizzazione subcellulare di STAT3 modula l'autofagia in vari modi20. Ad esempio, STAT3 nucleare trascrizionalmente regola geni autophagy-relative e agisce come un modulatore di autofagia. STAT3 citoplasmatica inibisce costitutivamente l'autofagia interagendo con l'autofagia molecole di segnalazione. STAT3 mitocondriale inibisce e impedisce mitophagy sopprimendo l'autofagia indotto da stress ossidativo. Pertanto, questo metodo di isolamento compartimento subcellulare è cruciale per comprendere il ruolo di altre molecole di segnalazione, nonché il ERK1/2.
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Protocol
1. peptide trattamento alle cellule
- piastra 2 milioni di SH-SY5Y o cellule HEK293 (2 x 10 6) in 10 cm piatto e coltivano per 2 giorni
- (opzionale) il prossimo giorno, lavare le cellule con Dulbecco privo di siero ' s Modified Eagle media Medium (DMEM) una volta e incubare con siero DMEM gratuito durante la notte se il trattamento deve essere fatto in media liberi del siero.
- Il giorno 3, sciogliere S14G-humanin peptidi in 0,2 µm filtrata, acqua distillata e rinvenire come soluzione di riserva di 1mM.
Nota: I peptidi devono essere disciolto in solvente appropriato, che può essere determinato dalle caratteristiche di sequenza del peptide (ad es., carica complessiva) e può essere fornito dal produttore se i peptidi sono disponibili in commercio. Ad esempio, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c si dissolvono in acqua. Aliquotare i peptidi in un volume adeguato (ad es., 50 µ l) per evitare di congelare e scongelare i cicli. Una volta scongelato, non utilizzarli ancora. - Aliquota il siero pre-riscaldato-contenente o media del siero-liberi in un conico da 50 mL tubo e aggiungere la soluzione di riserva 1 mM temperatura ambiente per trasformarlo in una concentrazione di lavoro (ad esempio, 1 µM, 10 µM).
- Sostituire il supporto con 6 mL di soluzione del peptide da passo 1.4. Incubare le cellule per la giusta quantità di tempo.
Nota: Scegliere il tempo di incubazione a seconda della condizione che attiva ERK.
2. Frazionamento subcellulare di citoplasma e nucleo
- lavare le cellule due volte con 10 mL di PBS ghiacciata, raschiare le cellule fuori la piastra in 5 mL di PBS ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 200 µ l di tampone di frazionamento ghiacciata, (pH di 10 mM HEPES = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10mm KCl, 5% (v/v) glicerolo, 1% tensioattivi non ionici (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), inibitori delle proteasi/fosfatasi).
Nota: Per mantenere le proteine nel loro stato di fosforilazione, l'inibitore della fosfatasi come bene come proteasi inibitore deve essere appena aggiunto e campioni devono essere tenuti sul ghiaccio a tutti i tempi. Ripetendo il blocco e thaw cicli di campioni devono essere evitati. Aliquotare campioni in piccola quantità (ad es. 50 μg) prima del loro congelamento a -80 ° C. - Incubare risospeso in ghiaccio per 15 minuti e poi Centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante come la frazione citoplasmatica e tenere il pellet per frazione nucleare.
- Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C e poi trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione di citosol.
- Risospendere il pellet in tampone ghiacciata di 200 μL (10 mM a pH HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in tampone di estrazione ghiacciata, nucleare 100 μL (pH di 20 mM HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e Sonicare 10 volte (5 s, 10 s sconto 30% amp.) il ghiaccio
- Centrifugare a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Si tratta di frazione nucleare.
- Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA
3. frazione mitocondriale grezza
- lavare le cellule in ogni piatto di 10 cm con 10 mL di PBS freddo, aggiungere 5 mL di PBS ghiacciata e staccare le celle utilizzando un raschietto cell.
Nota: Utilizzare tre piatti di 10cm di cellule per ottenere una buona resa dei mitocondri per Western Blotting. - Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e combinare tutto da tre piatti di 10cm in una provetta conica da 15 ml.
- Centrifugare le cellule a 600 x g per 10 min a 4 ° C.
- Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di isolamento mitocondri ghiacciata (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM di saccarosio, regolare a pH = 7,4).
- Omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore 2 mL con il pestello rivestito politetrafluoroetilene su Ice.
Nota: Questo passaggio è fondamentale per mantenere l'integrità mitocondriale e massimizzare la resa della frazione mitocondriale. Il numero dei tratti deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Preraffreddare l'omogeneizzatore prima di iniziare la procedura. - Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge ed e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i nuclei ed ininterrotte cellule.
- Raccogliere il surnatante, trasferirlo in un nuovo tubo del microcentrifuge e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.
Nota: Il pellet è allentato, raccogliere il surnatante con cura e cercare di non disturbare il pellet. - Rimuovere il supernatante, risospendere il pellet con 200 μL di tampone di isolamento mitocondri ghiacciata e trasferire la soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge. Centrifugare la provetta a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Ripetere il punto 3.8 a lavare la pallina. Non è necessario trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge in questo passaggio.
- Rimuovere il supernatante dal pellet lavato e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 50 μL di tampone RIPA.
- Incubare la sospensione in ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare la sospensione a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione mitocondriale.
- Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA.
4. Western Blotting per fosfo-specifici proteine
- eseguire un'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (8-16% preconfezionati gel) e la proteina di trasferimento di una membrana PVDF 4.
- Incubare la membrana con 5% BSA in TBST (0,1% polisorbato 20) per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico background.
Nota: Per il rilevamento di proteina fosforilata, bloccare la membrana con BSA non latte. Il latte contiene caseina, una fosfoproteina abbondante, che si traduce in alto segnale aspecifico. - Incubare la membrana con l'anticorpo primario (anti-fosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.
- Incubare la membrana con anticorpo secondario (anti-coniglio HRP) per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.
- Incubare la membrana con soluzione di ECL e la membrana nell'analizzatore dell'immagine di immagine.
- Striscia la membrana con stripping buffer per 15 min a temperatura ambiente e lavare la membrana con TBST tre volte per 5 min.
- Ripetere i punti da 4.2 a 4.7 usando l'anticorpo di anti-totale ERK1/2.
- Per verificare la purezza di ogni frazione, eseguire SDS-PAGE ed eseguire immunoblots utilizzando anticorpi che riconoscono i marcatori per ogni vano (ad es., Liuzzi B1 per nucleo, GAPDH per cytosol e TOM20 per i mitocondri).
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Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo trattato le cellule HEK293 e SH-SY5Y con 1 μM e 100 μM S14G-humanin, un potente humanin analogico21, rispettivamente, a completare la media per i periodi di tempo indicato (Figura 1A e Figura 1 B). abbiamo poi esaminato la forma totale e fosforilata di ERK1/2 al Thr202/Tyr204 da estratti di proteina totale. S14G-humanin trattamento hanno mostrato aumento della fosforilazione di ERK1/2 in sua regolamentazione Thr202/Tyr204 sito. La localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo importante nella sua funzione di segnalazione, in particolare nell'ottenere la sua specificità. Per comprendere l'obiettivo dell'attivazione di ERK1/2 S14G-humanin-mediata, abbiamo analizzato la localizzazione subcellulare del totale e fosforilata ERK1/2 S14G-humanin trattamento seguente. In cellule HEK293, il ERK fosforilato aumentata in entrambi citoplasma e nucleo, ma non nei mitocondri (Figura 2A). È interessante notare che, ERK fosforilato è diminuito nel citoplasma, nucleo e mitocondri in cellule SH-SY5Y (Figura 2B). Questi risultati indicano che tale fosforilazione di ERK S14G-humanin-mediata può svolgere un ruolo diverso in diversi tipi cellulari e diverse condizioni. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per analizzare la localizzazione di S14G-humanin-fosforilazione di ERK1/2 in altri compartimenti subcellulari, come fosforilata ERK1/2 trasloca nel nucleo, mitocondri, gli endosomi/lisosomi, e varie membrane.
Figura 1: S14G-humanin aumenta la fosforilazione di ERK1/2 in cellule HEK293 e SH-SY5Y. Quantificazione e rappresentante western blot dell'attivazione di ERK nelle cellule HEK293 (A) e (B) SH-SY5Y. Totale lisati cellulari a seguito (A) 1 µM o trattamento di S14G-humanin 100 µM (B) in DMEM supplementato con 10% FBS per l'indicato periodi di tempo sono stati immunoblotted utilizzando anti-fosfo - e totale-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204). Questa figura è stata modificata da Kim et al. 4 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fosforilata ERK1/2 è localizzato al cytosol, nucleo e altri compartimenti subcellulari previo trattamento di S14G-humanin in cellule HEK293 e SH-SY5Y. Le macchie occidentali rappresentante mostrando la localizzazione subcellulare di ERK1/2 (n = 3). HEK293 (A) le cellule sono state trattate con 1 µM S14G-humanin. Citosolica (15 µ g), nucleare (15 µ g e 50 µ g), e mitocondriale (15 μg) lisati sono stati immunoblotted utilizzando anticorpi fosfo - e totale-ERK. (B) SH - SY5Y cellule sono state trattate con 100 µM S14G-humanin. Frazioni mitocondriali sono state ottenute 30 min dopo il trattamento S14G-humanin. Citosolici, nucleare e mitocondriale (15 µ g) lisati sono stati immunoblotted utilizzando anticorpi fosfo - e totale-ERK. Anticorpo anti-Tom20 anti-GAPDH, Anti-lamina B, venivano utilizzati i marcatori di frazione citosolica, nucleare, mitocondriale, rispettivamente. Questa figura è stata modificata da Kim et al. 4. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Buffer del citosol, nucleare e la frazione mitocondriale.
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Discussion
Qui, abbiamo dimostrato che humanin peptide-ha mediato l'attivazione di ERK1/2 si verifica a due diversi tipi di cellule, e la localizzazione subcellulare di attivazione di ERK1/2 può essere diversa a seconda delle condizioni (ad es., dose di peptide, punto del tempo e delle cellule tipo). È stato dimostrato che humanin segnali attraverso due diversi recettori22,23, che possono spiegare le differenze nella segnalazione tra le due linee cellulari come pure l'esigenza di diverse dosi di humanin. Le implicazioni fisiologiche di questo non sono state studiate completamente, ma può suggerire un meccanismo possibile per il risposte dipendenti tessuto a HN.
La fosforilazione di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nella segnalazione ERK1/2 e lo stato di fosforilazione di ERK1/2 Mostra cambiamenti dinamici. È importante ottimizzare le condizioni per trovare quando è fosforilata ERK1/2 sotto un condizione/stimolo specifico. Per raggiungere questo obiettivo, cercare condizioni di stimolazione differenti (per esempio, la dose e mezzo) di condurre corsi di tempo da trovare quando si è raggiunto il massimo livello di fosforilazione. Una maggioranza degli studi si sono concentrati solo sulla fosforilazione di ERK1/2 in lisati cellulari totali. Tuttavia, i risultati possono fornire informazioni funzionali limitate come ERK1/2 può interagire con diversi obiettivi e modulare a valle diverse cascate in specifici compartimenti subcellulari. Pertanto, esaminando la localizzazione subcellulare di fosforilata ERK1/2 dà una migliore comprensione del ruolo dell'attivazione di ERK1/2.
Frazionamento subcellulare dopo l'attivazione di ERK1/2 può essere utilizzato come fonte di ulteriore studio (ad es., co-immunoprecipitazione) per identificare nuovi bersagli a valle perché il frazionamento subcellulare può arricchire per obiettivi a valle di ERK1/2. Questo metodo può essere applicato ad altre molecole di segnalazione che sono traslocate in diversi compartimenti subcellulari su stimoli dopo l'ottimizzazione delle condizioni.
Anche se negli ultimi decenni sono stati proposti vari metodi per isolare i mitocondri, non c'è contaminazione parziale da altri compartimenti subcellulari. Il metodo di isolamento mitocondriale grezza proposto qui contiene anche quantità limitata di contaminanti di citoplasma. Come la quantità di contaminazione è piccola, consideriamo che è ancora un valido metodo per individuare la localizzazione di ERK1/2 in mitocondri al momento dell'attivazione. Come peptidi non sono necessariamente stabile in soluzione, a volte è difficile mantenere la coerenza tra gli esperimenti. Essere sicuri di fare piccole aliquote della soluzione peptide per evitare effetti di gelo-disgelo e migliorare la coerenza delle attività del peptide.
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Disclosures
Pinchas Cohen è un azionista e consulente per Kelvin CohBar, Inc., lo Yen ha servito come un consulente per CohBar, Inc.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship nel programma di ricerca di invecchiamento di SJK, e un premio della Fondazione Glenn e NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tutti gli autori compaiono nel film.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
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