Summary
Mikroinjektion af zebrafisk embryoner og larver er en afgørende men udfordrende teknik, der anvendes i mange zebrafisk modeller. Her præsenterer vi et udvalg af individuel værktøjer til at støtte i stabiliseringen og orientering af zebrafisk for både mikroinjektion og billedbehandling.
Abstract
Zebrafisk er dukket op som en kraftfuld model af forskellige menneskelige sygdomme og et nyttigt redskab for en voksende række eksperimentelle undersøgelser, der spænder over grundlæggende udviklingsmæssige biologi gennem til store genetiske og kemiske skærme. Men, mange eksperimenter, især dem med tilknytning til infektion og xenograft modeller, stole på mikroinjektion og billeddannelse af embryoner og larver, som er besværlige teknikker, der kræver dygtighed og ekspertise. For at forbedre præcision og gennemløb af nuværende mikroinjektion teknikker, vi udviklet en serie af microstructured enheder til at orientere og stabilisere zebrafisk embryoner på 2 dage post befrugtning (dpf) i ventrale, dorsale eller laterale orientering forud for den procedure. For at støtte i billeddannelse af embryoner, designet vi også en simpel enhed med kanaler, orient 4 zebrafisk sideværts parallelt mod et glas dækning slip. Sammen, demonstrere de værktøjer, vi præsenterer her effektiviteten af photolithographic metoder til at generere nyttige enheder for optimering af zebrafisk teknikker.
Introduction
Zebrafisk er dukket op som en kraftfuld model for mange felter, fra studier af grundlæggende udviklingsmæssige biologi til store genetiske og kemiske skærme1,2. Rutinemæssig genetiske manipulationer, som genet overekspression, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese og transgenese stole på mikroinjektion af genetisk materiale i én celle zygote, som har ført til udviklingen af enkle, let at bruge, kommercielt tilgængelige værktøjer til at orientere og stabilisere æg til injektion3. Andre tiltag, såsom transplantation og infektion, kræver ofte mikroinjektion i senere fase embryoner og larver ved hjælp af større sporvidde kapillær nåle4. Men brugen af større sporvidde nåle præsenterer store tekniske udfordringer, som det er mere vanskeligt at trænge målvæv uden at skubbe eller rullende embryonet. Under disse betingelser, kan at opnå passende vand spændinger skal stabilisere embryonet, mens undgå tørring under proceduren, der er vanskelige og embryoner ikke være ideelt orienteret til injektion i målvæv.
Efter mikroinjektion er det ofte nyttigt at screene injiceres embryoner til at vælge dem, der har været succesfuldt injiceres, og til at fange billeder af det oprindelige tidspunkt. For at imødegå disse udfordringer, har vi udviklet en række microstructured enheder, der bidrager til at stabilisere 2 dpf embryoner i forskellige retningslinjer for mikroinjektion5, såvel for hurtig image-baseret screening efter injektion.
For at opnå tilstrækkelig strukturelle opløsning i disse enheder, udnyttede vi photolithographic teknikker. Almindeligt anvendt i mikroelektroniske industrier og mere for nylig ekstrapoleret til mikrofluid fabrikation, kan disse tilgange opnå vertikale strukturer spænder fra 1-1.000 µm, en skala, der er velegnet til manipulering af zebrafisk embryoner og larver. Alle enheder var opdigtet benytter Polydimethylsiloxan (PDMS), som er billige, fysisk robust, biologisk inaktivt og gennemsigtig.
Microstructured overflade arrays (MSAs) var formateret som blokke af PDMS med en mønstret top overflade, svarer til de enkle kanaler i Agarosen blokke bruges normalt til æg mikroinjektion. For efter injektion screening, kan 6 billedenheder være klædt i en standard glas-bund 6-godt plade. Disse enheder er designet til nem pålæsning af embryoner, mens den losning procedure bekvemt tillader redning af specifikke embryoner, lette image-baseret screening tilgange i en mere brugervenlig måde end disse enheder tidligere udviklet af de Beebe laboratorium6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroinjektion af larver var godkendt af Massachusetts General Hospital Underudvalget om forskning Animal Care under protokol 2011N000127.
1. enhed fabrikation
Bemærk: Alle computer bistået tegning (CAD) filer, der bruges til at designe fotolitografi masker beskrevet her (figur 1) er tilgængelig for download. Se tabel af materialer til links.
- Fremstil master mold wafer i en klasse 1.000 rene rum ved hjælp af standardteknikker photolithographic7. For mikrostruktur arrays og kanaler, mønster den epoxy-baserede negative photoresist sekventielt i 3 lag ved hjælp af 3 separate masker, ifølge producentens anvisninger: 100 µm for de lavvandede funktioner, 200 µm for de mellemstore funktioner og 400 µm for de dybe funktioner. For billedenhed lag mønster, to ved hjælp af 400 µm for de lavvandede funktioner og 600 µm for de dybe funktioner.
- Tape den færdige plade til bunden af en 15 cm petriskål til støbning (figur 2).
2. forberedelse af Microstructured overflade Arrays - PDMS
- For at gøre brugbare enheder, støbt Polydimethylsiloxan (PDMS), ved hjælp af den master wafer som en skimmel. Kombinere 50 g af PDMS monomer med 5 g af initiativtager og blandes grundigt i en plastik vejer parabol med en plastik gaffel.
- Hæld blandingen forsigtigt over formen.
- Degas i et vakuum ekssikkator på 16-25 inHg (54-85 kPa) i 1 time.
- For at helbrede PDMS, Bages ved 65 ° C i mindst 3 timer. PDMS skal helbrede til en fast, men fleksibel solid.
- Skær forsigtigt omkring enheden på den master wafer ved hjælp af en skalpel, og sørg for at holde kontakt mellem spidsen af en skalpel og wafer overflade. Brug af pincet, skræl PDMS replika wafer og overførsel til en ren 10 cm petriskål, funktion side op (figur 3).
- Behandle enheden med ilt plasma ved hjælp af en plasma ovn til 35 s for at reducere hydrophobicity.
- Dække med zebrafisk embryo medium (E3) indeholdende 168 mg/L af ethyl 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Fjern eventuelle bobler fra dybere funktioner af strømmende vand over overfladen af enheden ved hjælp af en overførsel pipette.
3. forberedelse af Microstructured overflade Arrays - Agarosen
- For at gøre en negativ PDMS skimmel, først behandle en PDMS enhed med ilt plasma.
-
Behandle PDMS enhed med 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silan damp til at skabe en inert overflade8. Kort:
- Sted PDMS at være behandlet funktion-side-up i et vakuumkammer i et stinkskab.
- Ved siden af PDMS, placere en lille åben glas eller aluminium parabol, og omhyggeligt afpipetteres 200 µL af PFDTS (98% silan) i skålen.
Forsigtig: PFDTS silan er meget flygtigt, reagerer voldsomt med vand, er brandfarligt og forårsager alvorlige hud- og skader på kontakt. Læs MSDS nøje før brug. - Lukke det vakuum kammer og anvende vakuum i 15-30 min, eller indtil PFDTS silan er helt fordampet.
- Placer enheden i en petriskål og bruge som en form for friske PDMS, forberedt som beskrevet i trin 2.1-2.3.
- Bages ved 65 ° C i mindst 3 timer, så skræl det hele lag af frisk PDMS fra behandlede enheden og placere i en frisk petriskål. Dette kan derefter bruges som en negativ skimmel for at kaste agarosegelelektroforese.
- For at forberede agarosegelelektroforese, koge en 2% opløsning af lav geldannende temperatur Agarosen i E3 i en mikrobølgeovn indtil Agarosen er fuldstændigt opløst.
- Hæld den varme Agarosen over PDMS negative mug og fjerne eventuelle bobler i Agarosen dækker enheden ved strømmende varmt agarosegelelektroforese over funktioner med en overførsel pipette.
- Når boblerne er fjernet, opbevares i køleskab ved 4 ° C til at angive agarosegelelektroforese.
- Fjern Agarosen blok fra den negative PDMS skimmel ved deformering PDMS fra nedenunder i hånden, overføre Agarosen blok til en ny petriskål og våd med E3 indeholdende MS-222.
4. forberedelse af PDMS billedenheder
- For at gøre brugbare enheder, støbt PDMS, ved hjælp af den master wafer som en skimmel. Kombinere 50 g af PDMS monomer med 5 g initiativtager, (samme som bruges i trin 2.1) og blandes grundigt i en plastik vejer parabol med en plastik gaffel.
- Hæld blandingen forsigtigt over formen.
- Degas i et vakuum ekssikkator på 16-25 inHg (54-85 kPa) i 1 time.
- For at helbrede PDMS, Bages ved 65 ° C i mindst 3 timer. PDMS skal helbrede til en fast, men fleksibel solid.
- Skær enhederne fra Master Wafer og punch ud porte ved hjælp af en 1,5 mm punch.
- Behandle enhederne og en 6-godt glas-bund godt plade med ilt plasma for 35 s, som beskrevet i trin 2.6.
- Bond én enhed funktion-side-down til hvert glas coverslip af 6-godt pladen ved at placere det på en 85 ° C kogeplade i 10 min.
Bemærk: For at bekræfte vellykket limning, anvendes fast tryk på én side af agglomererede enheden ved hjælp af pincet. Enheden bør forblive knyttet til glas coverslip.
5. zebrafisk kultur
- Kultur zebrafisk embryoner til 2 dpf ved hjælp af standardteknikker3.
- Dechorionate embryoner med pincet eller 1 mg/mL protease mix (Se materialer tabel)3 mindst 30-60 minutter før pålæsningen på anordning, at tillade dem at rette.
- Anaesthetize embryoner ved hjælp af (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) ved tilsætning af 1 mL 25 X stamopløsning til E3 i deres petriskål.
6. orientering af zebrafisk på Microstructured overflade - Divot Arrays
- Forberede PDMS blok fra trin 2.7 (figur 3A) i sin petriskål, således at det er dækket af en tynd (1-2 mm) lag af E3, som giver mulighed for lettere manipulation af embryoner.
- Overføre krævede antal embryoner (normalt 10-20 pr. betingelse) på overfladen af PDMS blok ved hjælp af en overførsel pipette.
- Ved hjælp af en micromanipulation værktøj (hår løkke eller lignende), skubbe embryoner i de microstructured divots (figur 3A). Brug af divots er særlig velegnet til dorsal og ventral retningslinjer.
Bemærk: For divots med en strammere pasform (dorsal og ventral), prøve positionering embryoner på overfladen af blok parallelt med divot, og derefter rulle dem ind i position ved hjælp af en hår løkke. Skubbe dem dybere ind i divot vil bidrage til at holde dem stabile.
7. orientering af zebrafisk på Microstructured overflade - Microstructured kanaler
- Tegne E3 off PDMS blok mønstrede med microstructured kanaler (figur 3B) ved hjælp af en overførsel pipette, indtil niveauet af E3 falder til under kanten af blokken, men er stadig til stede i reservoiret og kanaler og i et tyndt lag på PDMS.
- Overfør 10 embryoner fra trin 5.3 i reservoiret ved hjælp af en overførsel pipette, være omhyggelig med ikke at overflow kanterne.
- Ved hjælp af en hår løkke, manipulere hvert embryon ind i tragten ved indgangen til den rigtige kanal og orientere sådan at lederen af embryonet er mod kanalen og fosteret har den passende orientering da den går ind i kanalen.
- Slide hver embryo ned kanalen ved hjælp af en hår løkke, indtil den når at orientere microfeatures i kanalen væggene, der hjælper til at holde det på plads. Brug af microstructured kanaler er særligt anbefales til den laterale orientering.
Bemærk: For at reducere embryo glidende under mikroinjektion, prøve at justere mængden af overfladespænding ved at trække E3 fra reservoiret.
8. mikroinjektion af zebrafisk
-
Forberede mikroinjektion nål.
- Gøre borsilikatglas microcapillary nåle med en mikropipette puller som tidligere beskrevet4. De resulterende nåle bør være tilspidset til et punkt i den ene ende, med koniske længde ca 10 mm.
- Forberede løsning skal injiceres, i dette tilfælde 100 nM chemoattractant (N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanin (fMLP) eller leukotrien B4 (LTB4)) og 100 nM af 70 kDa rodamin dextran sporstof i PBS.
- Indlæse 5 µL af løsning i nålen ved hjælp af en fint tilspidsede pipette tip (Se materialer tabel).
- Montere nålen ind i en micromanipulator monteret på en magnetisk stå og forbundet til en picopump microinjector.
- Bryde spidsen af kanylen i en 45 ° vinkel ved at klemme den koniske spids med pincet.
- Justere injektion bolus størrelse til 1 nL ved at justere injektion tid på picopump controller.
- Justere vinklen på mikroinjektion nålen. En nål vinkel på 45 ° på micromanipulation controller er generelt et godt udgangspunkt med nålen parallelt med længden af embryoet. En stejlere vinkel kan bruges til at minimere lateral bevægelse af embryo under mikroinjektion.
- Kontrollere petriskål med venstre hånd og nål micromanipulator med ret, bringe nålen så tæt som muligt til det påtænkte sted mikroinjektion, i dette tilfælde den eksotiske vesikel.
Bemærk: Den eksotiske vesikel kan identificeres som det aflange organ posteriort for øjet der indeholder to mindre adskilte mørke aflange strukturer (otolit). - Bruger micromanipulation controller, trænge målvæv (i dette tilfælde den eksotiske vesikel), således at spidsen af nålen er inden for vesikel, og sprøjt den forudindstillede lydstyrke ved hjælp af fodkontakten picopump.
Bemærk: Hvis væv modstår penetration, prøv forsigtigt trykke micromanipulation controller knop. - For at frigive embryonerne, flow E3 over overfladen fra top til bund, ved hjælp af en overførsel pipette, eller af hvirvlende skålen, således at embryonerne er frigivet til de omkringliggende E3.
- Overføre embryoner til et opsving parabol af E3 uden MS-222 ved hjælp af en overførsel pipette.
9. screening af embryoner ved hjælp af PDMS Imaging enhed
- Prime enhed fra trin 4.7 af strømmende E3 (+ MS-222) gennem havnen. Dette kan gøres ved hjælp af enten en 1.000 µL pipette eller en smal-tip overførsel pipette.
- Fyld godt med E3 + MS-222, indtil enheden er dækket.
- Levere 4 injiceres embryoner fra trin 8,7 til hver brønd med en overførsel pipette. Embryoner kan være pre bedøvede, hvis det ønskes af inkubere i E3 + MS-222 for 1-2 min før indlæsning (trin 5.3).
- Ved hjælp af en micromanipulation værktøj (hår løkke eller lignende), orient embryoner ved indgangene til de billeddiagnostiske kanaler i den ønskede orientering (hale-første eller hoved-første, afhængigt af den enhed, der bruges), og skub dem delvis ind enhed (figur 4A). Dette vil hjælpe med at trække dem ind i enheden jævnt.
- Trække E3 gennem enheden fra havnen ved hjælp af enten en 1.000 µL pipette eller overførsel pipette indtil embryonerne er trukket ind i kanalerne i den rigtige retning for imaging (figur 4B).
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at sutte embryoner tidligere fældefangst punkt, dette vil ødelægge embryoner og ændre deres orientering. - Overføre godt-plade til mikroskop for imaging (figur 4 c).
-
Billede ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop.
- Justere forstørrelse ved at vælge den passende linse. 10 X er normalt en nyttig forstørrelse til imaging zebrafisk neutrofile migration.
- Justere lyskilde intensitet og udsættelsestiden for hver kanal, så hvert signal er klart, men ikke mættet.
- Capture billeder for hver kanal. Her, vi brugte grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) og overføres kanaler. Multikanals billeder kan kombineres under post-processing (figur 4B-jeg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet her viser design (figur 1) og fabrikation af enheder til brug med 2 dpf zebrafisk, ved hjælp af photolithographic (figur 2) og soft-litografi (fig. 3) teknikker. Denne metode giver mulighed for hurtig test af mange design iterationer og ændringer, og ombygninger og optimering af mikrostrukturen dimensioner til brug med zebrafisk i andre faser af udvikling kan udvide deres ansøgning.
Vi demonstrere brugen af disse enheder for udfordrende mikroinjektion teknikker og praktisk billeddannelse. Den eksotiske vesikel (figur 4D, hvid stiplet kontur) indeholder en nyttig, immun-privilegeret og isolerede site til afprøvning neutrofile rekruttering i zebrafisk9. For at teste zebrafisk neutrofiler evne til at reagere på standard chemoattractants, 100 nM af fMLP og LTB4 var microinjected i de eksotiske vesikler 2 dpf zebrafisk embryoner (figur 4F, J), ved hjælp af enhedens microstructured kanal ( Figur 1 g) at stabilisere embryoner i den tværgående retning. Injektioner var spores med høj molekylvægt rodamin dextran og udført i Tg(mpx:EGFP) embryoner til lette visualisering af neutrofile rekruttering. Uninjected embryoner (figur 4D, H) og embryoner injiceres med rodamin alene (figur 4E, jeg) blev brugt som negative kontroller. Efter mikroinjektion, embryoner blev overført til billedenheden kanal (figur 1A, B) og afbildet ved hjælp af en EVOS fluorescerende mikroskop (figur 4 c) på 30 min og 5 h post injektion (figur 4D- G og figur 4 H-K, henholdsvis). Som forventet, rekrutteret et lille antal fluorescerende neutrofiler til den mock-indsprøjtning eksotiske vesikel på det tidlige tidspunkt (figur 4I), sandsynligvis på grund af skader-medieret rekruttering. Interessant, blev rodamin dextran tracer observeret at ophobe sig i ørestenene under eksperimentet. For begge chemoattractants (figur 4F, J), neutrofiler blev rekrutteret i højere numre, især som reaktion på LTB4 (figur 4F).
De repræsentative resultater vist her demonstrere vellykket brug af denne metode for mikroinjektion og billeddannelse af zebrafisk. I forbindelse med zebrafisk neutrofile rekruttering assays, kan anvendelse af disse værktøjer i kombination med detaljerede live imaging teknikker og avancerede celle migration analyse10 give en nyttig platform for fremtidige eksperimenter i dette felt.
Figur 1: Computer bistået tegning (CAD) design af fotolitografi masker. (A-C) CAD design til microstructured overflade divots for positionering i lateral (A), ventrale (B) og dorsale (C) retningslinjer. Forskellige farvede linjer repræsenterer CAD maske designs til forskellige funktioner, med grønne 100 µm, blå 200 µm, og rød 400 µm funktion højder. Skalalinjen = 500 µm. (D-F) CAD design for microstructured kanaler for positionering i lateral (D), ventrale (E) og dorsale (F) retningslinjer. Forskellige farvede linjer repræsenterer maske designs til forskellige funktioner, med grønne 100 µm, blå 200 µm, og rød 400 µm funktion højder. Skalalinjen: 500 µm. (G-jeg) CAD design for billedenheder designet til lastning hoved-først (G) eller hale-først (H og I). Blå linjer repræsenterer 400 µm funktioner, mens røde linjer repræsenterer 600 µm funktioner. Pilene viser den retning, hvori larverne er indlæst. Skalalinjen = 200 µm. Dette tal er blevet ændret fra Ellett et al. 5 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: silikone master wafer. (A) øverste del af master wafer viser funktioner for orientere enkelte larver i divots. (B) nederste sektion af master wafer viser design for microstructured kanaler. Dette tal er blevet ændret fra Ellett et al. 5 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Microstructured PDMS enheder. (A) PDMS blok stemmer fra master wafer viser divots for orientere enkelte larver. (B) PDMS blokere cast fra master wafer viser microstructured kanaler. Dette tal er blevet ændret fra Ellett et al. 5 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater: Imaging rekruttering af zebrafisk neutrofiler efter mikroinjektion levering af chemoattractants til det eksotiske vesikel. (A-B) Lastning og montering embryoner til billedbehandling. (A) hoved-først enhed med embryoner klar til læsning, med den port angivet (sort pil). (B) den indlæste embryoner efter de er blevet trukket ind i position (gul pil). (C) 6-godt glas-bund plade med billedenheder på mikroskopet. Dette format giver imaging af 4 sideværts orienterede embryoner pr. brønd (24 embryoner i alt), ved hjælp af en standard inverteret mikroskop. (D-G) Neutrofiler (EGFP-grøn) i en uninjected (D) embryo og følgende eksotiske vesikel mikroinjektion af rhodaminfilteret dextran (rød, åben hvid pilespids) alene (E), 100 nM LTB4 (F), og 100 nM fMLP (G) 30 min post injektion (mpi). (Hansen) Neutrofiler (EGFP-grøn) i embryonet uninjected (H) og 5 h efter eksotiske vesikel mikroinjektion af rhodaminfilteret dextran (rød, åben hvid pilespids) alene (jeg), 100 nM LTB4 (J), og 100 nM fMLP (K) 5 h post injektion ( HPI). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, vi beskriver brugen af hjælpemidler vi for nylig udviklet for at lette 2 dpf zebrafisk mikroinjektion5, og indføre en simpel Agarosen-fri monteringsudstyret til praktisk billeddannelse af embryoner. Disse værktøjer fremhæve nytten af photolithographic teknikker til fabrikation af enheder, der er nyttige for zebrafisk teknikker.
Vi har fundet MSA enheder særlig nyttig for indsprøjtning af celler eller partikler tilbøjelige til sammenlægning inden for mikroinjektion nålen, såsom svampe konidier eller menneskelige kræftceller, som kræver brug af en større bore nål til levering. Injektion i den eksotiske vesikel (figur 4) præsenterer en særlig udfordring, som embryoner ofte ruller ved kontakt med nålen. Vi finder at brugen af microstructured kanaler, at orientere og stabilisere zebrafisk i en tværgående orientering i høj grad forbedret både overførselshastighed og nøjagtigheden af denne teknik i vores hænder.
For hurtig billeddannelse af sideværts orienteret zebrafisk på forskellige tidspunkter, såsom vurdering af neutrofile ansættelse eller xenograft metastase, undgå Agarosen øget montering sammenhængen mellem embryoner og reducerede risikoen for beskadigelse under post imaging redning. Disse enheder også viser lovende for længere tid bortfalder billedbehandling, og har været anvendt med succes tage multikanal, Multiplansafbalanceringsmaskiner billeder med minimal fisk bevægelse over 12 h. Fordi de ikke er hæmmet ved agarosegelelektroforese, aktive strækning af larverne i løbet af denne periode (~ 300 µm fra 54-78 hpf)11 er ubegrænset og kan fortsætte normalt.
De mest kritiske trin i forberedelsen og brugen af disse værktøjer er fælles for brugen af de fleste PDMS baseret mikrofluid enheder: enheder skal være grundigt fugtet og bobler undgås. For at undgå sådanne problemer, våd enheder i E3 umiddelbart efter de er opdigtet, mens den overflade hydrofiliciteten tillægges af ilt plasma behandling er stadig til stede. Fornyet behandling med ilt plasma kan også bruges til at gendanne forbigående hydrofiliciteten alderen PDMS enheder.
De præcise geometri anvendes her drage fordel af den høj opløsning af photolithographic teknikker, men den nuværende design grænse brug til zebrafisk under den anden dag efter befrugtning. Re-design af geometrier baseret på den aktuelle platform vil tillade vellykkede orientering 1 dpf og 3 dpf for mikroinjektion. Orientering af mere livlig 4 dpf larver med oppustede svømme blærer ville sandsynligvis være mere udfordrende og kræver LUN geometrier i kombination med højere vand spænding. Komplekse enheder integrere flow eller vakuum kan give en alternativ tilgang gælder for en bredere vifte af udviklingsstadier, men ville også kræve brug af pumper og slanger, stigende omkostninger og risiko for enheden.
PDMS er en omkostningseffektiv, nyttigt materiale til opdigte enheder som beskrevet her, biokompatibilitet, gennemsigtighed og genanvendelighed. En ulempe ved at bruge PDMS enheder for zebrafisk er hydrophobicity, som kan gøre vedligeholdelse af lavvandede lag af E3 på overfladen af enheden udfordrende. Dette problem kan undgås ved støbning mikroinjektion enheder i agarosegelelektroforese, selvom dette begrænser genbrugelighed og øger skrøbelighed af enheder. En foretrukne alternativ ville være identifikation af et biokompatibelt overfladebehandling, der øger hydrofiliciteten af PDMS12, eller brug af en passende plastunderlag.
Nuværende metoder til mikroinjektion af zebrafisk på 2 dpf bruge enten vand spænding4 eller enkle kanaler støbt i Agarosen bruger kommercielle forme til at immobilisere og placere larverne. Disse tilgange giver begrænset kontrol af orientering og kan blive kompliceret af hurtige tørring af embryoner. Mikrostrukturer integreret i divots og kanaler, der anvendes her er designet til at orientere og immobilisere larverne uden helt afhængig af vand spænding, hvilket reducerer risikoen for tørring. Divots lavet ved hjælp af 3D trykte forme har tidligere været brugt til orientering af embryoner til billedbehandling formål13, men dybden af disse divots gjort dem utilgængelige for mikroinjektion.
Brugen af mikrofluid systemer for zebrafisk imaging bliver stadig mere almindeligt14.
Flere gennemstrømnings-systemer er udviklet for at give observation af zebrafisk udvikling over tid med muligheden for at indføre forbindelser på efterspørgslen15,16,17. Mere komplekse enheder er designet til array embryoner mens stadig inden for deres chorion, som giver en enkel sfærisk geometri, der nemt kan manipuleres med relativt høj overførselshastighed i disse systemer18,19. Flere grupper har udviklet platforme for opstilling og imaging larve stadie zebrafisk i forskellige retningslinjer6,20, den mest brugervenlige er den passive micropump drevet "ZEBRA" system udviklet af Beebe lab6 . I modsætning til ZEBRA-systemet, den enhed, som vi beskriver bruger her suge, der genereres ved hjælp af en standard overførsel pipette, for at tegne larverne i kanaler, mens parallelt snarere end sekventielt lastning af larver giver mulighed for redning af enkelte larver post imaging af anvender positiv flow gennem den samme port. Desuden, vores tilgang kræver en mindre footprint, så PDMS enheder kan være bundet til konventionelle glas-bund 6-godt plader til billedbehandling.
Den nuværende eksperimentelle design udnytter separate enheder for mikroinjektion og billeddannelse primært så at de kan bruges med konventionelle mikroinjektion udstyr og standard omvendte mikroskoper. Mikrofluid tilgange til automatiseret mikroinjektion af zebrafisk æg allerede findes21, og i kombination med "fisk-fælden" type metoder til meget præcise opstilling og orientering af larver20, er det forudses at integrere enheder automatiseret larve injektion og imaging kan også en dag bliver en realitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke David Langenau for generøst giver akvarium rum; Eric Stone, John C. Moore og Qin Tang for hjælpe med zebrafisk vedligeholdelse og reagenser, og Anne Robertson og Elliott Hagedorn fra Leonard Zon lab for fremskaffelse af zebrafisk stamme bruges her. De vil også gerne takke Octavio Hurtado for rådgivning om photolithographic teknikker. FE blev finansieret af stipendier fra Shriner's Hospital for børn og den amerikanske australske sammenslutning. Dette arbejde blev finansieret af NIH give GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
