Summary
Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.
Abstract
Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor verschillende ziekten bij de mens en een nuttig instrument voor een toenemend aantal experimentele studies die, verspreid over fundamentele ontwikkelingsbiologie via aan grootschalige genetische en chemische schermen. Echter, veel experimenten, met name die met betrekking tot infectie en xenograft modellen, rekenen op microinjection en beeldvorming van embryo's en larven, die moeizaam technieken die vaardigheid en expertise vereisen. Ter verbetering van de precisie en de doorvoer van huidige microinjection technieken, ontwikkelden we een reeks van microstructured apparaten te oriënteren en stabiliseren van de zebravis embryo's op 2 dagen post bevruchting (dpf) in ventrale, dorsal of laterale richting voorafgaand aan de procedure. Om te helpen bij de beeldvorming van embryo's, ontwierpen we ook een eenvoudig apparaat met kanalen die 4 zebrafish lateraal parallel tegen een glas cover slip oriënteren. Samen, tonen de instrumenten die wij hier presenteren de effectiviteit van photolithographic benaderingen voor het genereren van nuttige apparaten voor de optimalisatie van de zebravis technieken.
Introduction
Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor veel velden uit studies van de fundamentele ontwikkelingsbiologie aan grootschalige genetische en chemische schermen1,2. Routine genetische manipulaties, zoals overexpressie van het gen, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese en Transgenese afhankelijk van microinjection van genetisch materiaal in de zygote eencellige, die heeft geleid tot de ontwikkeling van eenvoudige, easy-to-use, commercieel beschikbare hulpmiddelen voor oriënteren en eieren voor injectie3te stabiliseren. Andere benaderingen, zoals transplantatie en infectie, vereisen vaak microinjection in later stadium embryo's en larven met grotere spoorbreedte capillaire naalden4. Gebruik van grotere spoorbreedte naalden kampt echter met grote technische uitdagingen, zoals het is moeilijker om te penetreren het doelweefsel is terechtgekomen zonder duwen of rollen van het embryo. Onder deze omstandigheden wellicht het verkrijgen van de juiste water spanning nodig om te stabiliseren van het embryo, terwijl het vermijden van drogen tijdens de procedure moeilijk is, en de embryo's niet ideaal georiënteerd voor injectie in het doelweefsel.
Naar aanleiding van microinjection is het vaak handig om het scherm van de geïnjecteerde embryo's te selecteren die met succes zijn ingespoten en opnames van de eerste tijdstip. Om deze uitdagingen, hebben we een waaier van microstructured apparaten die bijdragen aan het stabiliseren van 2 dpf-embryo's in verschillende richtingen microinjection5, zowel voor snelle beeld-gebaseerde screening na injectie.
Voor het verkrijgen van voldoende structurele resolutie in deze apparaten, we photolithographic technieken gebruikt. Gebruikte micro-elektronische industrieën en meer onlangs geëxtrapoleerd naar microfluidic fabricage, kunnen deze benaderingen verticale structuren, variërend van 1-1000 µm, een schaal geschikt voor manipulatie van zebravis embryo's en larven. Alle apparaten werden vervaardigd gebruikend Polydimethylsiloxaan (PDMS), die goedkoop, fysiek robuuste biologisch inert en transparant is.
Microstructured oppervlakte matrices (MSAs) werden opgemaakt als blokken voor PDMS met een patroon bovenvlak, analoog aan de eenvoudige kanalen in agarose blokken gebruikte voor ei microinjection. Voor na injectie voorstelling kan 6 imaging-apparatuur worden gekleed in een standaard glassbottom 6-well plaat. Deze apparaten zijn ontworpen voor het eenvoudig laden van embryo's, terwijl de lossen procedure kan gunstig redding van specifieke embryo's, vergemakkelijken van beeld-gebaseerde benaderingen in een meer gebruikersvriendelijke manier dan die apparaten screening eerder ontwikkeld door de Beebe laboratorium6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microinjection van larven werd goedgekeurd door het Massachusetts algemene ziekenhuis Subcommissie onderzoek Animal Care onder Protocol 2011N000127.
1. apparaat Fabrication
Opmerking: Alle computer assisted tekening (CAD) bestanden gebruikt om te ontwerpen fotolithografie maskers hier beschreven (Figuur 1) zijn beschikbaar voor download. Zie tabel van materialen voor links.
- Het zegel van de master mold in een klasse 1.000 cleanroom met standaardtechnieken photolithographic7fabriceren. Patroon voor de microstructuur matrices en kanalen, de epoxy gebaseerde negatieve fotoresist opeenvolgend in 3 lagen met behulp van 3 afzonderlijke maskers, volgens de instructies van de fabrikant: 100 µm voor de ondiepe functies, 200 µm voor de middellange functies en 400 µm voor de diepe functies. Voor het beeldapparaat lagen patroon twee met behulp van 400 µm voor de ondiepe functies en 600 µm voor de diepe functies.
- Tape de voltooide wafer aan de basis van een 15 cm petrischaal voor het gieten (Figuur 2).
2. voorbereiding van de Microstructured oppervlakte Arrays - PDMS
- Gegoten om bruikbare apparaten, Polydimethylsiloxaan (PDMS), met behulp van de master wafer als een mal. 50 g PDMS monomeer combineren met 5 g van initiatiefnemer en meng in een plastic wegen schotel met een plastic vork.
- Giet mengsel zorgvuldig de mal.
- Ontgas in een vacuüm exsiccator op 16-25 inHg (54-85 kPa) gedurende 1 uur.
- Om te genezen het PDMS, bak bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur. De PDMS moeten genezen aan een sterke maar flexibele solid.
- Zorgvuldig gesneden rond het apparaat op de master wafer met behulp van een scalpel, ervoor zorgend om het onderhouden van contact tussen het uiteinde van de scalpel en het oppervlak van de wafer. Met behulp van Tang, schil de PDMS replica uit de buurt van de wafer en overdracht aan een schone 10 cm petrischaal, functie kant naar boven (Figuur 3).
- Behandel het apparaat met zuurstof plasma met behulp van een plasma-oven voor 35 s tot het verminderen van hydrophobicity.
- Bedek met de zebravis embryo medium (E3) met 168 mg/L ethyl 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Verwijder alle bubbels uit diepere functies door het stromende water over het oppervlak van het apparaat met behulp van een precisiepipet overdracht.
3. bereiding van Microstructured oppervlakte Arrays - Agarose
- Om een negatieve PDMS schimmel, eerst een PDMS apparaat met zuurstof plasma te behandelen.
-
Behandel het PDMS apparaat met 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane damp te creëren een inert oppervlakte8. Kort:
- Plaats de PDMS als functie-side-up van de behandelde in een vacuuemcel in een zuurkast.
- Naast het PDMS, plaats een kleine open glazen of aluminium schaal en zorgvuldig Pipetteer 200 µL van PFDTS (98% silane) in de schotel.
Let op: PFDTS silane is zeer vluchtige, reageert heftig met water, is brandbaar en veroorzaakt schade voor huid en ogen op contact. Lees MSDS in detail vóór gebruik. - Sluit de Vacuuemcel en toepassen van vacuüm gedurende 15-30 min of totdat de PFDTS silane volledig is verdampt.
- Plaats het apparaat in een petrischaal en gebruiken als een mal voor verse PDMS, voorbereid zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
- Bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur, bak dan schil de hele laag van verse PDMS van het behandelde apparaat en plaats in een verse petrischaal. Dit kan vervolgens worden gebruikt als een negatieve mal te gieten agarose.
- Ter voorbereiding van agarose, kook een 2%-oplossing van lage gelerend temperatuur agarose in E3 in een magnetron totdat de agarose is volledig opgelost.
- Giet de hete agarose over de PDMS negatieve schimmel en verwijder alle bubbels in de agarose die betrekking hebben op het apparaat door stromend warm agarose over de kenmerken met een pipet overdracht.
- Zodra bubbels zijn verwijderd, koelkast bij 4 ° C tot het instellen van het agarose.
- Het agarose blok uit de negatieve PDMS schimmel verwijderen door het vervormen van het PDMS van onder met de hand, het blok agarose overbrengen in een nieuwe petrischaal en nat met E3 met MS-222.
4. voorbereiding van PDMS Imaging-apparatuur
- Gegoten om bruikbare apparaten, PDMS, met behulp van de master wafer als een mal. 50 g PDMS monomeer combineren met 5 g initiatiefnemer (hetzelfde als gebruikt in stap 2.1) en meng grondig in een plastic wegen schotel met een plastic vork.
- Giet mengsel zorgvuldig de mal.
- Ontgas in een vacuüm exsiccator op 16-25 inHg (54-85 kPa) gedurende 1 uur.
- Om te genezen het PDMS, bak bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur. De PDMS moeten genezen aan een sterke maar flexibele solid.
- Gesneden van de apparaten uit de Master Wafer en punch out poorten met behulp van een punch van 1,5 mm.
- Behandelen de apparaten en een 6-well glas-bodem goed met zuurstof plasma voor 35 plaat s, zoals beschreven in stap 2.6.
- Obligatie apparaat functie-side-down van de één naar elk glas dekglaasje aan van de 6-well plaat door deze te plaatsen op een kookplaat 85 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Om te bevestigen succesvolle hechting, stevige druk uitoefenen op één zijde van het gekleefde apparaat met behulp van de verlostang. Het apparaat moet blijven verbonden met de glazen dekglaasje aan.
5. Zebrafish cultuur
- Cultuur zebrafish de embryo's naar 2 dpf met standaardtechnieken3.
- Dechorionate embryo's gebruik van pincet of 1 mg/mL protease Meng (Zie materialen tabel)3 ten minste 30-60 minuten vóór het laden op apparaat, te laten rechtzetten.
- Anaesthetize embryo's (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) door toevoeging van 25 X 1 mL stockoplossing aan de E3 met hun petrischaal.
6. oriëntatie van zebravis op Microstructured oppervlak - Divot Arrays
- Bereid het PDMS blok uit stap 2.7 (figuur 3A) in haar petrischaal zodanig zijn dat het is bedekt met een laag van dunne (1-2 mm) van E3, waardoor gemakkelijker manipulatie van de embryo's.
- Vereiste aantal embryo's (over het algemeen 10-20 per voorwaarde) overbrengen op het oppervlak van het PDMS blok met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Met behulp van een micromanipulation-tool (haar lus of gelijkaardig), duw de embryo's in de microstructured divots (figuur 3A). Gebruik van divots is bijzonder geschikt voor dorsale en ventrale oriëntaties.
Opmerking: Voor de divots met een strakkere passen (dorsale en ventrale), probeer positionering van de embryo's op het oppervlak van het blok in parallel aan de divot, en dan rollen ze in positie met behulp van een lus van de haren. Het duwen van hen dieper in de divot zal helpen hen om stabiel te houden.
7. richting van de zebravis op Microstructured oppervlak - Microstructured kanalen
- E3 trekken uit het PDMS blok patroon met microstructured kanalen (figuur 3B) met behulp van een precisiepipet van de overdracht tot het niveau van de E3 zakt tot onder de rand van het blok, maar nog steeds aanwezig in het reservoir en de kanalen en in een dunne laag op de PDMS is.
- Pipetteer 10 embryo's uit stap 5.3 in het reservoir met behulp van een precisiepipet overdracht, dat evenwel niet tot overloop van de randen.
- Met behulp van een haar lus, manipuleren van elk embryo in de trechter bij de ingang van het juiste kanaal en oriënteren zodanig dat het hoofd van het embryo is de richting van het kanaal en het embryo de juiste afdrukstand heeft als het binnenkomt het kanaal.
- Schuif elk embryo neer het kanaal met behulp van een lus haar, totdat zij de oriënterende microfeatures in de muren van het kanaal die helpen tot te houden in plaats. Gebruik van microstructured kanalen wordt met name aanbevolen voor de laterale richting.
Opmerking: Verklein embryo glijden tijdens microinjection en proberen de hoeveelheid oppervlaktespanning aanpassen door E3 te trekken uit het reservoir.
8. microinjection van zebravis
-
Bereiden van microinjection naald.
- Maken van borosilicaatglas microcapillary naalden met behulp van een micropipet-trekker als eerder beschreven4. De resulterende naalden moeten worden kegelvormige tot een punt aan de ene kant, met een conus lengte van ongeveer 10 mm.
- Oplossing voor injectie, in dit geval 100 nM chemoattractant bereiden (N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanine (fMLP) of leukotriënen B4 (LTB4)) en 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran tracer in PBS.
- 5 µL van de oplossing in de naald met behulp van een precisiepipet fijn taps toelopende laden tip (Zie materialen tabel).
- Monteer de naald in een micromanipulator op een magnetische standaard gemonteerd en aangesloten op een picopump microinjector.
- Breek het puntje van de naald onder een hoek van 45 ° door knijpen de taps toelopende tip met een tang.
- Aanpassen van de grootte van de bolus van de injectie tot 1 nL door de injectie tijd op de picopump-controller aan te passen.
- Pas de hoek van de microinjection naald. Een naald hoek van 45 ° op de micromanipulation controller is over het algemeen een goed uitgangspunt, met de naald parallel aan de lengte van het embryo. Een steilere invalshoek kan worden gebruikt om te minimaliseren van de zijdelingse beweging van het embryo tijdens microinjection.
- Beheersing van de petrischaal met de linkerhand en de micromanipulator van de naald met de juiste, breng de naald zo dicht mogelijk aan de gewenste site van microinjection, in dit geval de otic blaasje.
Opmerking: De otic blaasje kan worden geïdentificeerd als de langwerpige orgel posterieure voor het oog met twee kleinere afzonderlijke donkere langwerpige structuren (Otolieten). - Met behulp van de micromanipulation-controller, penetreren het doelweefsel (in dit geval de otic vesikel) zodanig dat het uiteinde van de naald binnen het blaasje is en injecteren van de vooraf ingestelde volume met behulp van de picopump-voetschakelaar.
Opmerking: Als het weefsel penetratie weerstaat, probeer zachtjes te tikken op de knop van de controller micromanipulation. - Als u wilt vrijgeven van de embryo's, stromen E3 over het oppervlak van boven naar beneden met behulp van een precisiepipet overdracht, of door de schotel wervelende zodanig zijn dat de embryo's worden vrijgelaten in de omliggende E3.
- De embryo's overbrengen in een herstel schotel van E3 zonder MS-222 met behulp van een precisiepipet overdracht.
9. screening van embryo's met behulp van het Imaging apparaat PDMS
- Prime het apparaat uit stap 4.7 met vloeiende E3 (+ MS-222) via de poort. Dit kan gedaan worden met behulp van een pipet 1.000 µL of een smalle-tip overdracht pipet.
- Vul de put met E3 + MS-222 totdat het apparaat is gedekt.
- 4 ingespoten embryo's van stap 8,7 in elke goed met behulp van een pipet overdracht leveren. Embryo's kunnen vooraf narcose indien gewenst door broeden in E3 + MS-222 voor 1-2 min vóór het laden (stap 5.3).
- Met behulp van een micromanipulation-tool (haar lus of gelijkaardig) oriënteren de embryo's bij de ingangen van de beeldvorming kanalen in de gewenste richting (staart-eerste of hoofd-eerste, afhankelijk van het apparaat gebruikt) en duw ze gedeeltelijk in het apparaat (figuur 4A). Dit zal helpen trekken ze gelijkmatig in het apparaat.
- Trekken E3 door het apparaat uit de poort met een 1.000 µL pipet of overdracht Pipetteer totdat de embryo's zijn getrokken in de kanalen in de juiste stand voor imaging (figuur 4B).
Opmerking: Wees voorzichtig niet te zuigen van de embryo's voorbij de punt van de overlapping, dit zal schade toebrengen aan de embryo's en veranderen hun geaardheid. - Well-plate overbrengen Microscoop voor imaging (figuur 4C).
-
Beeld met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop.
- Vergroting aanpassen door te selecteren van de juiste lens. 10 X is meestal een nuttige vergroting voor imaging zebrafish neutrofiele migratie.
- Intensiteit van de lichtbron en belichtingstijd voor elk kanaal zodanig aanpassen dat elk signaal duidelijk, maar niet verzadigd is.
- Opnamen voor elk kanaal. Hier, we gebruikten groen fluorescente proteïne (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) en uitgezonden kanalen. Meerkanaals afbeeldingen kunnen worden gecombineerd tijdens post-processing (figuur 4B-Ik).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven aanpak toont het ontwerp (Figuur 1) en de vervaardiging van apparaten voor gebruik met 2 dpf zebravissen, met behulp van photolithographic (Figuur 2) en soft-lithografische (Figuur 3) technieken. Deze methode maakt het mogelijk snel testen van vele ontwerp iteraties en wijzigingen en aanpassingen en optimalisatie van de microstructuur afmetingen voor gebruik met zebravissen in andere stadia van ontwikkeling kunnen hun toepassing te breiden.
We voorbeelden van gebruik van deze apparaten voor uitdagende microinjection technieken en gemakkelijke beeldbewerking. De otic Vesikel (Figuur 4 d, witte streepjeslijn) biedt een nuttige, immuun-bevoorrechte en geïsoleerde site voor het testen van neutrofiele werving in zebrafish9. Voor het testen van het vermogen van de zebravis neutrofielen inspelen op standaard chemoattractants, 100 nM van fMLP en LTB4 werden microinjected in het otic blaasjes van 2 dpf zebrafish embryo's (figuur 4F, J), met behulp van het microstructured kanaal apparaat ( Figuur 1G) te stabiliseren van embryo's in de laterale richting. Injecties waren getraceerd met ultrahoog moleculair gewicht Rhodamine dextran, en uitgevoerd in Tg(mpx:EGFP) embryo's om visualisatie van neutrofiele werving. Uninjected embryo's (Figuur 4 d, H) en embryo's geïnjecteerd met Rhodamine alleen (figuur 4E, ik) werden gebruikt als negatieve controles. Naar aanleiding van microinjection, embryo's werden overgebracht naar het kanaal beeldapparaat (figuur 1A, B) en beeld met behulp van een EVOS van fluorescente microscoop (figuur 4C) in 30 min en 5 h post-injectie (Figuur 4 d- G en Figuur 4 H-K, respectievelijk). Zoals verwacht, werden een klein aantal fluorescerende neutrofielen gerekruteerd om de mock-geïnjecteerd otic blaasje in de vroege timepoint (figuur 4I), waarschijnlijk als gevolg van schade-gemedieerde werving. Interessant, werd de Rhodamine dextran tracer waargenomen ophopen in de Otolieten tijdens het experiment. Voor beide chemoattractants (figuur 4F, J), neutrofielen werden aangeworven in hogere aantallen, met name in reactie op LTB4 (figuur 4F).
De representatieve resultaten hieronder tonen het succesvolle gebruik van deze methode voor de microinjection en beeldvorming van zebravis. In het kader van zebravis neutrofiele werving tests, kan toepassing van deze instrumenten in combinatie met gedetailleerde levende beeldvormingstechnieken en geavanceerde cel migratie analyse10 een nuttig platform bieden voor toekomstige experimenten op dit gebied.
Figuur 1: Computer assisted tekening (CAD) ontwerp van fotolithografie maskers. (A-C) CAD-ontwerpen voor microstructured oppervlakte divots voor positionering in laterale (A), ventrale (B) en dorsale (C) oriëntaties. Verschillende gekleurde lijnen vertegenwoordigen CAD-masker ontwerpen voor verschillende functies, met de groene 100 µm, blauw 200 µm, en rood 400 µm functie hoogten. Schaal bar = 500 µm. (D-F) CAD-ontwerpen voor microstructured kanalen voor positionering in laterale (D), ventrale (E) en dorsale (F) oriëntaties. Verschillende gekleurde lijnen vertegenwoordigen masker ontwerpen voor verschillende functies, met de groene 100 µm, blauw 200 µm, en rood 400 µm functie hoogten. Schaal bar: 500 µm. (G-ik) CAD-ontwerpen voor imaging-apparatuur ontworpen voor laden hoofd-eerste (G) of staart-eerste (H en I). Blauwe lijnen vertegenwoordigen 400 µm functies, terwijl de rode lijnen vertegenwoordigen 600 µm functies. Pijlen geven de richting waarin larven geladen worden. Schaal bar = 200 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Ellett et al. 5 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Silicone master wafer. (A) weer.\n\nIn het bovengedeelte van meester wafer toont functies kunt u individuele larven in divots. (B) onderste gedeelte van meester wafer design voor microstructured kanalen tonen. Dit cijfer is gewijzigd van Ellett et al. 5 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Microstructured PDMS apparaten. (A) PDMS blok van meester wafer tonen divots kunt u individuele larven gegoten. (B) PDMS blokkeren cast van meester wafer met microstructured kanalen. Dit cijfer is gewijzigd van Ellett et al. 5 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve resultaten: Imaging aanwerving van zebravis neutrofielen na microinjection levering van chemoattractants in de otic blaasje. (A-B) Laden en montage van embryo's voor imaging. (A) de hoofd-eerste apparaat met embryo's klaar voor het laden, met de poort aangegeven (zwarte pijl). (B) de geladen embryo's nadat ze naar de gewenste positie (gele pijl) zijn opgesteld. (C) 6-well glas-bodemplaat met imaging-apparatuur op Microscoop. Deze notatie kunt imaging voor 4 lateraal georiënteerde embryo's per putje (24 embryo's in totaal), met behulp van een standaard omgekeerde Microscoop. (D-G) Neutrofiele granulocyten (EGFP-groen) in een uninjected (D) embryo en de volgende otic vesikel microinjection van Rhodamine dextran (rood, open witte pijlpunt) alleen (E), 100 nM LTB4 (F), en 100 nM fMLP (G) 30 min post injectie (mpi). (H-K) Neutrofiele granulocyten (EGFP-groen) in een uninjected (H) embryo en 5 nonies na otic vesikel microinjection van Rhodamine dextran (rood, open witte pijlpunt) alleen (ik), 100 nM LTB4 (J), en 100 nM fMLP (K) 5 h post injectie () HPI). Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we het gebruik van apparaten we onlangs ontwikkeld om 2 dpf zebrafish microinjection5te vergemakkelijken, en de invoering van een eenvoudige agarose-gratis montage apparaat voor handige beeldvorming van embryo's. Deze hulpprogramma's markeren het nut van photolithographic technieken voor de fabricage van apparaten die nuttig zijn voor de zebravis technieken.
Wij hebben gevonden MSA apparaten vooral handig voor injectie van cellen of deeltjes vatbaar voor aggregatie binnen de naald van microinjection, zoals schimmel conidiën of menselijke kankercellen, waarvoor het gebruik van een grotere boring naald voor levering. Injectie in de otic Vesikel (Figuur 4) vormt een bijzondere uitdaging, zoals embryo's vaak bij contact met de naald rollen. Wij vinden dat het gebruik van microstructured kanalen die oriënteren en stabiliseren de zebravis in een laterale oriëntatie verbeterd zowel de gegevensdoorvoer en de nauwkeurigheid van deze techniek in onze handen.
Voor snelle beeldvorming van lateraal georiënteerde zebravis op verschillende tijdstippen, zoals beoordeling van neutrofiele aanwerving of xenograft metastase, vermijden van agarose verhoogd montage consistentie tussen de embryo's en verminderde kans op schade tijdens post imaging redding. Deze apparaten ook tonen belofte voor langere tijd vervallen beeldvorming, en met succes via meerdere kanalen, multiplane om beelden te vangen met minimale vis beweging meer dan 12u zijn gebruikt. Omdat ze niet door agarose beperkt worden, actieve rek van de larven tijdens deze periode (~ 300 µm van 54-78 hpf)11 is onbeperkt en kan normaal verloopt.
De belangrijkste stappen in de voorbereiding en het gebruik van deze hulpprogramma's gelden voor het gebruik van de meeste PDMS gebaseerd microfluidic apparaten: apparaten moet grondig wordt bevochtigd en bubbels vermeden. Om te voorkomen dat dergelijke kwesties, natte de apparaten in E3 onmiddellijk nadat zij zijn vervaardigd, terwijl de oppervlakte hydrophilicity zuurstof plasma behandeling toekent nog steeds aanwezig is. Hernieuwde behandeling met zuurstof plasma kan ook Transient om te herstellen hydrophilicity leeftijd PDMS apparaten worden gebruikt.
De precieze geometrieën gebruikt hier profiteren van de hoge resolutie van photolithographic technieken, maar de huidige ontwerpen limiet gebruik zebrafish tijdens de tweede dag na bevruchting. Re-design van geometrieën op basis van het huidige platform zou succesvolle oriëntatie van 1 dpf en 3 dpf voor microinjection. Richting van meer veerkrachtige 4 dpf larven met opgeblazen zwemmen blazen zou waarschijnlijk worden meer uitdagend, en vereisen knus geometrieën in combinatie met hogere spanning van water. Complexe apparaten die stroom of vacuüm te integreren misschien een alternatieve benadering die van toepassing zijn voor een breder publiek of ontwikkelingsstadia, maar zou ook gebruik van pompen en buizen, verhoging van de kosten en risico's van apparaatfout nodig.
PDMS is een kosteneffectieve, nuttig materiaal voor het fabriceren van apparaten zoals die hier beschreven, biocompatibiliteit, transparantie en herbruikbaarheid. Een nadeel van het PDMS apparaten gebruik voor zebrafish is hydrophobicity, waardoor onderhoud van ondiepe lagen van E3 op het oppervlak van het apparaat uitdagende. Dit probleem kan worden voorkomen door het gieten van de apparatuur van microinjection in agarose, hoewel dit de herbruikbaarheid beperkt en de kwetsbaarheid van apparaten verhoogt. Een voorkeur alternatief zou een identificatie van een biocompatibele oppervlaktebehandeling die een toename van de hydrophilicity van PDMS12, of het gebruik van een passende plastic substraat.
Huidige methoden microinjection van zebravis op 2 dpf gebruiken ofwel water spanning4 of eenvoudige kanalen in agarose met behulp van commerciële mallen te immobiliseren en de positie van de larven gegoten. Deze benaderingen bieden beperkte controle van oriëntatie en kunnen worden bemoeilijkt door de snelle droging van embryo's. De microstructuren geïntegreerd in het divots en kanalen die hier gebruikt zijn ontworpen om te oriënteren en de larven immobiliseren zonder volledig afhankelijk van water spanning, waardoor het risico voor het drogen. Divots gemaakt met behulp van 3D gedrukte mallen zijn eerder gebruikt voor oriëntatie van embryo's voor imaging doeleinden13, hoewel de diepte van deze divots hen ontoegankelijk voor microinjection maakte.
Gebruik van microfluidic systemen voor beeldvorming van de zebravis wordt steeds gewoner14.
Meerdere doorstroomtest systemen zijn ontwikkeld zodat de waarneming van de zebravis ontwikkeling na verloop van tijd met de mogelijkheid om verbindingen op vraag15,16,17. Meer complexe apparaten zijn ontworpen om matrix embryo's terwijl nog binnen hun chorion, waarin een eenvoudige sferische meetkunde die gemakkelijk kan worden behandeld met relatief hoge doorvoersnelheid in deze systemen18,19. Verschillende groepen hebben ontwikkeld platforms voor arraying en imaging larvale stadium zebrafish in verschillende oriëntaties6,20, de meest gebruiksvriendelijke wordt de passieve micropump gedreven "ZEBRA" systeem ontwikkeld door de Beebe lab6 . In tegenstelling tot de ZEBRA-systeem, gebruikt het apparaat die wij beschrijven hier zuig, gegenereerd met behulp van een precisiepipet standaard overdracht, om te tekenen van de larven in de kanalen, terwijl parallel in plaats van sequentiële laden van larven kunnen redding van individuele larven na imaging door het toepassen van positieve flow via dezelfde poort. Bovendien is onze aanpak vereist een kleinere voetafdruk, dus PDMS apparaten kunnen worden verbonden met conventionele glazen-bodem 6-Wells-platen voor imaging.
De huidige experimentele design maakt gebruik van afzonderlijke apparaten voor microinjection en imaging voornamelijk zodat ze kunnen worden gebruikt met conventionele microinjection apparatuur en standaard omgekeerde microscopen. Microfluidic benaderingen voor geautomatiseerde microinjection van zebravis eieren al bestaan21, en in combinatie met "vis-trap" type methoden voor zeer nauwkeurige arraying en oriëntatie van larven20, het is te verwachten dat apparaten integratie geautomatiseerde larvale injectie en beeldvorming kunnen ook een dag een realiteit geworden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs bedank David Langenau royaal voorzien van aquarium ruimte; Eric Stone, John C. Moore en Qin Tang voor helpen met onderhoud van de zebravis en reagentia, en Anne Robertson en Elliott Hagedorn van Leonard Zon van lab voor de aanschaf van de stam van de zebravis hier gebruikt. Ze wil ook bedanken Octavio Hurtado voor advies over photolithographic technieken. FE werd gefinancierd door beurzen uit de Shriner ziekenhuis voor kinderen en de American Australian Association. Dit werk werd gefinancierd door de NIH GM92804 verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
