Summary
Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.
Abstract
דג זברה הופיעו כמודל עוצמה של מחלות אנושיות שונות, כלי שימושי עבור טווח גדל והולך של מחקרים ניסיוניים, פורש יסוד ביולוגיה התפתחותית דרך מסכי גנטי וכימיים בקנה מידה גדול. עם זאת, ניסויים רבים, במיוחד אלה הקשורים לזיהום, מודלים xenograft, לסמוך על microinjection הדמיה של עוברי וזחלים, אשר מפרך טכניקות הדורשות מיומנות ומומחיות. כדי לשפר את הדיוק ואת התפוקה של טכניקות microinjection הנוכחי, פיתחנו סדרה של התקנים microstructured אוריינט ולייצב את העוברים דג זברה-2 ימים שלאחר ההפריה (dpf) בכיוון הגחון, הגבי או לרוחב לפני נוהל. כדי לסייע ההדמיה של העוברים, עיצבנו גם מכשיר פשוט עם ערוצים אוריינט דג זברה 4 רוחבית במקביל נגד החלקה כיסוי זכוכית. יחד, בכלים אותם אנו מציגים כאן להדגים את היעילות של גישות photolithographic כדי ליצור התקנים שימושי עבור אופטימיזציה של טכניקות דג זברה.
Introduction
דג זברה הופיעו כמודל עוצמה עבור שדות רבים, מחקרים של יסוד ביולוגיה התפתחותית כדי בקנה מידה גדול גנטי, כימית מסכי1,2. שינויים גנטיים שגרתיות, כגון ביטוי גנים, נוקאאוט, מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9 transgenesis לסמוך על microinjection של חומר גנטי לתוך הזיגוטה מתא בודד, אשר הובילה להתפתחות של פשוט, קל לשימוש, מסחרית כלים זמינים עבור המכוונת וייצוב ביצים הזרקת3. גישות אחרות, כגון השתלת זיהום, דורשים לעיתים קרובות microinjection לתוך העוברים בשלב מאוחר יותר, הזחלים באמצעות מד גדול מחטים נימי4. עם זאת, השימוש מחטים מד גדול מציג אתגרים טכניים משמעותיים, כמו זה יותר קשה לחדור את רקמת המטרה בלי לדחוף או מגלגלים את העובר. בתנאים אלה, קבלת מתח מים המתאים הנדרש כדי לייצב את העובר תוך הימנעות ייבוש במהלך ההליך קשה, העוברים לא יכול להיות אידיאלי אוריינטציה להזרקה לתוך רקמת המטרה.
בעקבות microinjection, הוא לעיתים קרובות שימושי למסך עוברי מוזרק סמן הוזרק בהצלחה, וכדי ללכוד תמונות של נקודת הזמן הראשוני. לטפל באתגרים אלה, פיתחנו מגוון של מכשירים microstructured המסייעים לייצב את העוברים dpf 2 הכיוונים השונים הן עבור microinjection5, והן עבור מיון המבוסס על תמונות מהיר שלאחר ההזרקה.
כדי להשיג רזולוציה מבנית מספיק במכשירים האלה, אנחנו מנוצל טכניקות photolithographic. נפוץ תעשיות מיקרו-אלקטרוניים ועוד אקסטרפולציה לאחרונה microfluidic פבריקציה נוספת, גישות אלה ניתן להשיג מבנים אנכיים הנע בין 1-1, 000 מיקרומטר, בקנה מידה המתאימה מניפולציה של דג זברה עוברי וזחלים. כל ההתקנים הללו זוייפו באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS), שהינו זול חזקים פיזית, אינרטי מבחינה ביולוגית, שקוף.
מערכים משטח microstructured (שימי) שעוצבו כבלוקים של PDMS עם משטח עליון בדוגמת, מקביל הערוצים פשוט בבלוקים agarose הנפוץ עבור הביצה microinjection. להקרנה שלאחר ההזרקה, 6 התקני הדמיה יכול להיות ערוכים תת 6-ובכן צלחת רגילה. התקנים אלה מיועדים לטעינה קלה של העוברים, בעוד ההליך לפריקת בנוחות מאפשר חילוץ העובר ספציפיים, הקלת מבוססת תמונה הקרנת גישות בצורה יותר ידידותית למשתמש מאשר התקנים אלה שפותחו בעבר על ידי ביב מעבדה6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microinjection של הזחלים אושרה על ידי הוועדה חולים כללי מסצ'וסטס-אכפת לי חיה מחקר תחת פרוטוקול 2011N000127.
1. התקן פבריקציה נוספת
הערה: כל בסיוע מחשב (CAD) קבצי ציור המשמש עיצוב מסכות פוטוליתוגרפיה המתוארים כאן (איור 1) זמינים להורדה. ראה טבלה של חומרים עבור קישורים.
- לפברק כשהפחד מאסטר עובש בחדר נקי Class 1,000 באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי7. עבור מערכים מיקרו ו ערוצים, דפוס את photoresist על בסיס אפוקסי שלילי ברצף ב 3 שכבות באמצעות 3 מסכות נפרדים, בהתאם להוראות היצרן: 100 מיקרומטר עבור התכונות רדוד, מיקרומטר 200 עבור התכונות בינונית ו- 400 מיקרומטר עבור התכונות עמוק. עבור התקן הדמיה, דוגמת שתי שכבות באמצעות מיקרומטר 400 עבור התכונות רדוד מיקרומטר 600 עבור התכונות עמוק.
- קלטת כשהפחד שהושלמו לבסיס של 15 ס מ פטרי ליציקת (איור 2).
2. הכנת מערכי משטח Microstructured - PDMS
- כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק polydimethylsiloxane (PDMS), באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של היוזם, מערבבים ביסודיות פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.
- שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.
- דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.
- . כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.
- חותכים בזהירות מסביב למכשיר על כשהפחד הראשי באמצעות אזמל, מקפיד לשמור על קשר בין קצה האזמל השטח וופל. באמצעות מלקחיים, לקלף את העותק המשוכפל של PDMS מחוץ ופלה העברת נקי 10 ס מ פטרי, תכונה בצד (איור 3).
- לטפל המכשיר עם פלזמה חמצן באמצעות תנור פלזמה עבור 35 s כדי להפחית את hydrophobicity.
- מכסים עם דג זברה העובר בינוני (E3) המכיל 168 מ ג/ליטר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). הסרה של בועות מתכונות עמוק יותר על-ידי זרימת מים על פני השטח של המכשיר באמצעות פיפטה של העברה.
3. הכנת מערכי משטח Microstructured - Agarose
- כדי להפוך את תבנית PDMS שלילי, קודם לטפל מכשיר PDMS עם חמצן פלזמה.
-
פנקו את המכשיר PDMS עם 1H, 1H, 2H, 2Hכדי ליצור משטח אינרטי8אדי silane - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS). בקצרה:
- מניחים את PDMS להיות מטופלים תכונה-צד-up בתוך תא ואקום בתוך ברדס fume.
- ליד PDMS, מקום קטן פתוח זכוכית או אלומיניום תבשיל, בזהירות פיפטה 200 µL של PFDTS (98% silane) לתוך קערה.
התראה: PFDTS silane הוא הפכפך מאוד, מגיב באלימות עם מים, דליק, גורמת נזקים חמורים העור והעין על קשר. MSDS לקריאה בהרחבה לפני השימוש. - לסגור את תא ואקום ולהחיל ואקום למשך 15-30 דקות, או עד silane PFDTS הוא התאדו לגמרי.
- הכנס את ההתקן צלחת פטרי, להשתמש כתבנית עבור PDMS טריים, המוכנים כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.
- אופים ב- 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות, ולאחר מכן לקלף את כל השכבה של טרי PDMS מהמכשיר שטופלו ומניחים בצלחת פטרי טריים. זה יכול לשמש לאחר מכן כתבנית שלילי להטיל agarose.
- כדי להכין agarose, מרתיחים פתרון 2% של נמוך ג'לי טמפרטורה agarose ב E3 במיקרוגל עד התפרקה לחלוטין agarose.
- שופכים את agarose חם כייר שלילי PDMS, להסיר את כל הבועות ב agarose המכסה את המכשיר על-ידי agarose חם זורם מעל תכונות בעלות פיפטה העברה.
- ברגע בועות יוסרו, להכניס למקרר ב 4 ° C כדי להגדיר את agarose.
- להסיר את הבלוק agarose כייר PDMS שליליים על ידי עיוות את PDMS מ מתחת בעבודת יד, להעביר את גוש agarose חדש צלחת פטרי, ו רטוב עם E3 המכיל MS-222.
4. הכנת PDMS התקני הדמיה
- כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק PDMS, באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של יוזם (כמו בשימוש בשלב 2.1), לערבב ביסודיות ב פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.
- שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.
- דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.
- . כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.
- לחתוך את ההתקנים מ כשהפחד מאסטר, אגרוף יציאות באמצעות אגרוף 1.5 מ מ.
- פינוק המכשירים ו 6-ובכן זכוכית-תחתון טוב צלחת עם חמצן פלזמה עבור 35 s, כפי שמתואר בשלב 2.6.
- בונד אחד התקן תכונה לצד השני על כל coverslip זכוכית של צלחת 6-טוב על-ידי הצבתו על פלטה 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: כדי לאשר התקשרות מוצלחת, החל בלחץ חזק לצד אחד של המכשיר בונדד באמצעות מלקחיים. המכשיר צריכים להישאר קשור coverslip זכוכית.
5. דג זברה תרבות
- תרבות עוברי דג זברה כדי dpf 2 באמצעות טכניקות רגיל3.
- Dechorionate עוברי באמצעות מלקחיים או 1 מ"ג/מ"ל, פרוטאז מערבבים (ראה טבלת חומרים)3 לפחות 30-60 דקות לפני טעינה להתקן, כדי לאפשר להם ליישר.
- להרדים עוברי באמצעות פתרון מניות (168 מ ג/ליטר) MS-222 (pH 7.5) על-ידי הוספת 1 מ"ל של 25 X E3 ב שלהם צלחת פטרי.
6. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - מערכים דיבוט
- להכין את הרחוב PDMS צעד 2.7 (איור 3A) של צלחת פטרי כזה כי הוא מכוסה על ידי שכבה (1-2 מ מ עובי) של E3, שמאפשר מניפולציה קל של העוברים.
- להעביר את המספר הנדרש של עוברי (בדרך כלל 10-20 לכל תנאי) על פני הרחוב PDMS באמצעות פיפטה של העברה.
- בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), לדחוף את העוברים החורים microstructured (איור 3 א). השימוש וגושים מתאימה בעיקר אוריינטציות הגבי ו הגחון.
הערה: לקבלת החורים עם הדוק יותר מתאים (הגבי ו הגחון), נסה מיצוב העוברים על פני הרחוב במקביל דיבוט ולאחר מכן לגלגל אותם בעזרת לולאה שיער. דוחף אותם עמוק יותר לתוך דיבוט יסייע לשמור אותם יציבים.
7. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - ערוצי Microstructured
- צייר E3 לא ברחוב PDMS בדוגמת לערוצי microstructured (איור 3B) באמצעות פיפטה העברה של עד הרמה של E3 יורד מתחת לקצה הרחוב, אך היא עדיין נוכחים המאגר ואת ערוצי בשכבה דקה על PDMS.
- העברת העוברים 10 מהשלב 5.3 לתוך המאגר באמצעות פיפטה העברה, נזהר שלא תציף את הקצוות.
- באמצעות לולאה שיער, לתמרן כל העובר לאבדון בכניסה של הערוץ המתאים, אוריינט כזה כי ראשו של העובר לכיוון התעלה, העובר יש את הכיוון המתאים המתאוששת הערוץ.
- החלק כל העובר למטה הערוץ באמצעות לולאה שיער עד שהוא מגיע את microfeatures orienting בקירות הערוץ המסייעים לשמור אותו במקום. השימוש ערוצי microstructured מומלצת במיוחד בכיוון לרוחב.
הערה: כדי לצמצם את העובר הזזה במהלך microinjection, נסה לכוונן את הכמות של מתח על ידי ציור E3 מן המאגר.
8. microinjection של דג זברה
-
להכין את המחט microinjection.
- להפוך מחטים microcapillary זכוכית בורוסיליקט באמצעות של פולר micropipette כמו שתואר לעיל4. . המחטים וכתוצאה מכך צריך צמצום עד לנקודה בקצה אחד, באורך להתחדד של 10 מ מ.
- להכין פתרון כדי להיות מוזרק, ב- chemoattractant ננומטר זה מקרה 100 (N-Formylmethionine-leucyl-פנילאלנין (fMLP) או Leukotriene B4 (LTB4)) ו- 100 ננומטר של 70 kDa Rhodamine לתוספי מעקב ב- PBS.
- לטעון µL 5 של פתרון לתוך המחט בעזרת פיפטה דק מחודדות עצה (ראה טבלת חומרים).
- לטעון את המחט לתוך micromanipulator רכוב על דוכן מגנטי ומחובר microinjector picopump.
- לשבור את קצה המחט בזווית של 45 מעלות על-ידי צובט את הטיפ מחודדות עם מלקחיים.
- התאם גודל בולוס הזרקת 1 nL על-ידי התאמת זמן הזרקת בבקר picopump.
- להתאים את הזווית של המחט microinjection. זווית המחט של 45 מעלות על הבקר המיקרומניפולציה בדרך כלל נקודת התחלה טובה, עם מחט מקבילים באורך של העובר. זווית תלולה עשוי לשמש כדי למזער את התנועה לרוחב של העובר במהלך microinjection.
- שליטה על צלחת פטרי עם יד שמאל ועל את המחט micromanipulator בימין, להביא את המחט קרוב ככל האפשר לאתר המיועד של microinjection, במקרה זה שלפוחית otic.
הערה: ניתן לזהות את שלפוחית otic כמו האיבר מלבני האחורי לעין המכיל שני קטן יותר ברורים כהה מלבני מבנים (otoliths). - באמצעות הבקר חוץ-גופית, לחדור את רקמת המטרה (במקרה זה שלפוחית otic) כך קצה המחט נמצא שלפוחית, ולהזריק האחסון מראש באמצעות המתג הרגל picopump.
הערה: אם הרקמה יתנגד חדירה, לנסות בעדינות הקשה על הידית בקר המיקרומניפולציה. - כדי לשחרר את העוברים, זורמים E3 מעל פני השטח מלמעלה למטה באמצעות פיפטה העברה, או על ידי מתערבל המנה כך העוברים משוחררים לתוך E3 שמסביב.
- העברת העוברים תבשיל שחזור של E3 ללא באמצעות פיפטה העברה של MS-222.
9. הקרנת עוברי באמצעות PDMS את התקן הדמיה
- פריים המכשיר משלב 4.7 מאת זורם E3 (+ MS-222) דרך היציאה. ניתן לבצע זאת באמצעות פיפטה 1,000 µL או פיפטה של צרות-קצה העברה.
- למלא את הבאר E3 + MS-222 עד המכשיר מכוסה.
- לספק 4 העוברים מוזרק משלב 8.7 לתוך כל טוב באמצעות פיפטה של העברה. עוברי ניתן מראש anesthetized במידת הצורך על-ידי המקננת ב E3 + MS-222 למשך 1-2 דקות לפני טעינת (שלב 5.3).
- בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), אוריינט העוברים בכניסות של ערוצי הדמיה בכיוון הרצוי (זנב-הראשון או ראש-הראשון, בהתאם למכשיר בשימוש), לדחוף אותם באופן חלקי המכשיר (איור 4A). זה יעזור למשוך אותם לתוך המכשיר באופן שווה.
- צייר E3 דרך המכשיר מן הנמל באמצעות פיפטה µL 1,000 או פיפטה העברה עד העוברים נמשכים לתוך תעלות לכיוון הנכון הדמיה (איור 4B).
הערה: תיזהר שלא לשאוב את העוברים מעבר לנקודה השמנה, זה נזק העוברים ולשנות את חוש ההתמצאות שלהם. - להעביר היטב-לוחית מיקרוסקופ הדמיה (איור 4C).
-
התמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה.
- התאם הגדלה על-ידי בחירת העדשה המתאימה. 10 X הוא בדרך כלל ההגדלה שימושי הדמיה ההעברה נויטרופילים דג זברה.
- התאם עוצמה מקור האור וזמן חשיפה לכל ערוץ כך כל אות היא ברורה, אבל לא רוויות.
- לכידת תמונות לכל ערוץ. כאן, השתמשנו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP, לשעבר: 470/22, Em: 525/50), טקסס אדום (TxRed, לשעבר: 585/29, Em: 628/32) ולהעביר ערוצי. ניתן לשלב תמונות רב-ערוצי במהלך עיבוד שלאחר (איור 4B-אני).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה המתוארת כאן מדגים את העיצוב (איור 1) ועל פבריקציה נוספת של התקנים לשימוש עם דג זברה 2 dpf, באמצעות photolithographic (איור 2) וטכניקות רך-ליטוגרפיה (איור 3). שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של איטראציות עיצוב ושינויים רבים, שינויים ואופטימיזציה של מיקרו מידות לשימוש עם דג זברה אחרים שלבי ההתפתחות רשאי להאריך את היישום שלהם.
נדגים שימוש של התקנים אלה נוחים הדמיה וטכניקות microinjection מאתגר. שלפוחית otic (חלוקה לרמות מקווקוויםבאיור 4D, לבן) מספק אתר שימושי, החיסון-חסוי, מבודד לבדיקת גיוס נויטרופילים דג זברה9. כדי לבדוק את היכולת של דג זברה נויטרופילים להגיב chemoattractants סטנדרטי, 100 ננומטר של fMLP, LTB4 היו microinjected לתוך השלפוחיות המוגלתיות otic dpf 2 דג זברה העובר (איור 4F, J), באמצעות המכשיר ערוץ microstructured ( איור 1 ג'י) כדי לייצב את העוברים בכיוון לרוחב. זריקות היו במעקב עם משקל מולקולרי גבוה לתוספי Rhodamine, הופיעה Tg(mpx:EGFP) עוברי כדי להקל על ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים. Uninjected עוברי (איור 4D, H), העוברים הזריק Rhodamine לבד (איור 4E, אני) שימשו פקדים שלילי. בעקבות microinjection, העוברים הועברו לתוך המכשיר ערוץ הדמיה (איור 1 א', ב'), עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS (איור 4C)-30 min ו- 5 שעות שלאחר ההזרקה (איור 4D- G , איור 4 H-K, בהתאמה). כצפוי, מספר קטן של נויטרופילים פלורסנט גויסו שלפוחית otic המוזרק מוק-timepoint מוקדמת (איור 4I), ככל הנראה עקב גיוס בתיווך נזק. מעניין, רכיב המעקב לתוספי Rhodamine נצפתה לצבור otoliths במהלך הניסוי. עבור שני chemoattractants (איור 4F, J), גויסו נויטרופילים במספרים גבוהים, במיוחד בתגובה LTB4 (איור 4F).
התוצאות נציג המוצגת כאן מדגימים את השימוש בשיטה זו עבור microinjection מוצלחת והדימות של דג זברה. בהקשר של מבחני הגיוס נויטרופילים דג זברה, יישום של כלים אלה בשילוב עם טכניקות הדמיה חיים מפורט תא מתוחכמים ההעברה ניתוח10 עשוי לספק פלטפורמה שימושי לניסויים עתידיים בתחום זה.
איור 1: ממוחשבים עיצוב (CAD) ציור של מסיכות פוטוליתוגרפיה. (A-C) עיצוב CAD עבור microstructured וגושים השטח לצורך מיקום צדדי (A), הגחוני / (B) ו הגבי אוריינטציות (C). קווים צבעוניים שונים מייצגים CAD מסכת עיצובים עבור תכונות שונות, עם 100 מיקרומטר ירוק, כחול 200 מיקרומטר, ובגובה אדום מיקרומטר 400 תכונה. סרגל קנה מידה = 500 CAD עיצוב מיקרומטר. (D-F) עבור ערוצי microstructured לצורך מיקום צדדי (D), הגחוני / (E) ו הגבי אוריינטציות (F). קווים צבעוניים שונים מייצגים מסכת עיצובים עבור תכונות שונות, עם 100 מיקרומטר ירוק, כחול 200 מיקרומטר, ובגובה אדום מיקרומטר 400 תכונה. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (G-אני) עיצוב CAD הדמיה התקנים שנועדו עבור טעינת הראש-ראשון (G) או זנב-הראשון (ו H). קווים כחולים מייצגים תכונות 400 מיקרומטר, ואילו הקווים האדומים מייצגים תכונות מיקרומטר 600. חיצים מראים את הכיוון שבו הזחלים הם טעונים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: וופל בסיס סיליקון- (א) בחלק העליון של תכונות מראה וופל מאסטר המכוונת הזחלים בודדים לתוך וגושים. (B) בתחתית מקטע של מאסטר וופל מציג עיצוב עבור ערוצי microstructured. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: התקנים Microstructured PDMS. (א) PDMS בלוק יצוק וופל הראשי מציג וגושים עבור המכוונת הזחלים בודדים. PDMS (B) לחסום יצוק וופל הראשי מציג ערוצי microstructured. דמות זו שונתה מ. Ellett et al. 5 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תוצאות נציג: הדמיה גיוס של נויטרופילים דג זברה בעקבות מסירת microinjection chemoattractants לתוך שלפוחית otic. (A-B) טעינת והרכבה עוברי עבור הדמיה. (א) הראש-הראשון המכשיר עם עוברי מוכן להעלאה, עם יציאת שצוין (שחור החץ). (B) טעון העוברים לאחר הם נמשכו סמיכה (חץ צהוב). (C) צלחת זכוכית 6-ובכן-התחתון עם התקני על מיקרוסקופ הדמיה. תבנית זו מאפשרת הדמיה של 4 רוחבית מונחה העוברים לכל טוב (סה כ 24 עוברי), באמצעות מיקרוסקופ הפוך רגיל. (D-G) נויטרופילים (ירוק-EGFP) uninjected (ד) העובר, הבאים otic שלפוחית microinjection של Rhodamine לתוספי (אדום, פתח ראש חץ לבן) לבד (E), 100 ננומטר LTB4 (F), ו- 100 ננומטר fMLP (G) 30 דקות פוסט הזרקה (mpi). (H-K) נויטרופילים (EGFP-ירוק) של העובר (H) uninjected ו- h 5 בעקבות otic שלפוחית microinjection של Rhodamine לתוספי (אדום, פתח ראש חץ לבן) לבד (אני), 100 ננומטר LTB4 (J), ו- 100 ננומטר fMLP (K) 5 שעות פוסט (הזרקה מדד מחירי הבתים של). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים את השימוש של ההתקנים שפיתחנו לאחרונה להקל על 2 dpf דג זברה microinjection5, ולהציג את התקן הרכבה פשוטה ללא agarose עבור הדמיה נוח של העוברים. כלים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות photolithographic להרכבת התקנים שימושי עבור דג זברה טכניקות.
מצאנו למתקן התקנים שימושי במיוחד עבור הזרקה של תאים או חלקיקים נוטה צבירת בתוך המחט microinjection, כגון conidia פטרייתי או תאים סרטניים אנושיים, אשר דורשים את השימוש מחט שיעמום גדול יותר עבור משלוח. הזרקה לתוך שלפוחית otic (איור 4) מהווה אתגר מסוים, כפי העוברים לעיתים קרובות לגלגל לאחר יצירת קשר עם המחט. מצאנו כי השימוש ערוצים microstructured אוריינט ולייצב את דג זברה ב תנועה צדית התמצאות השתפרה מאוד הן את התפוקה והדיוק של טכניקה זו בידיים שלנו.
עבור הדמיה מהירה של דג זברה רוחבית אוריינטציה בנקודות זמן שונות, כגון הערכה של גיוס נויטרופילים או גרורות xenograft, הימנעות agarose גדל הרכבה עקביות בין עוברי סיכון מופחת של נזק במהלך פוסט-הדמיה הצלה. התקנים אלה גם מבטיחים לדימות לשגות זמן ממושך, שימשו בהצלחה ללכוד תמונות רב-ערוצי, multiplane עם דגים מינימלי תנועה מעל 12 שעות. כי הם אינם מרוסנים על-ידי agarose, התארכות פעיל של הזחלים במהלך זה תקופה (מיקרומטר ~ 300 מ 54-78 hpf)11 היא בלתי מוגבלת, ניתן להמשיך כרגיל.
השלבים הקריטיים ביותר הכנה, שימוש בכלים אלה נפוצים לשימוש של רוב המכשירים microfluidic PDMS מבוסס: התקנים חייב להיות wetted ביסודיות, להימנע בועות. כדי להימנע מבעיות כאלה, רטוב ההתקנים E3 מיד לאחר שהם מיוצרים, ואילו hydrophilicity משטח שהוענקו על ידי טיפול פלזמה החמצן עדיין קיימת. טיפול מחדש עם פלזמה חמצן יכול לשמש גם לשחזור transiently hydrophilicity למכשירים PDMS בגיל העמידה.
גיאומטריות מדויקות המשמש כאן לנצל הרזולוציה הגבוהה של טכניקות photolithographic, אך השימוש הנוכחי של מגבלת עיצובים כדי דג זברה בזמן ההפריה שלאחר יום השני. עיצוב מחדש של גיאומטריות מבוססת על פלטפורמת הנוכחי יאפשר כיוון מוצלחת של 1 dpf ו- 3 dpf עבור microinjection. הכיוון של יותר קליל 4 dpf הזחלים עם שלפוחיות שחייה המנופח סביר להיות מאתגרת יותר, וזקוקים סנוג גיאומטריות בשילוב עם מתח מים גבוהה יותר. המכשירים מורכבים שילוב זרימה או אבק עשוי לספק גישה חלופית החלים על מגוון רחב יותר של שלבים התפתחותיים, אך גם דורשת שימוש של משאבות, צינורות, הגדלת עלות וסיכון של כשל בהתקן.
PDMS הוא חומר חסכונית, שימושי עבור בדיית מכשירים כמו אלה שתוארו כאן, מתן הביו, שקיפות, שימושית. חסרון אחד של שימוש PDMS התקנים עבור דג זברה הוא hydrophobicity, אשר יכול לגרום תחזוקה של שכבות רדוד של E3 על פני השטח של המכשיר מאתגר. בעיה זו יכולה להימנע על ידי יציקת המכשירים microinjection ב agarose, למרות זה מגביל את שימושית ומגביר את השבריריות של התקנים. אלטרנטיבה יהיה זיהוי של טיפול פני שטח מסתיימים זה מגביר את hydrophilicity של PDMS12, או השימוש המצע פלסטיק המתאים.
השיטות הקיימות עבור microinjection של דג זברה-2 dpf להשתמש גם מתח מים4 או ערוצי פשוטה יצוקים agarose באמצעות תבניות מסחריות כדי לשתק ומקם את הזחלים. גישות אלה מספקים שליטה מוגבלת על התמצאות, יכול להיות מסובך ייבוש מהיר של העוברים. מזערים משולבים קדימה רבותיי, ערוצי המשמש כאן נועדו אוריינט, לשתק את הזחלים ללא תלוי לחלוטין המתח המים, ובכך להקטין את הסיכון של ייבוש. בעבר היו בשימוש וגושים עשה שימוש בתבניות מודפס 3D לאוריינטציה של העוברים על מטרות הדמיה13למרות העומק של גושים אלה גרם להם נגיש עבור microinjection.
השימוש במערכות microfluidic עבור דג זברה הדמיה הופך להיות נפוץ יותר ויותר14.
פותחו מספר מערכות זרימה דרך כדי לאפשר התבוננות דג זברה פיתוח לאורך זמן עם היכולת להציג חומרים הביקושים15,16,17. המכשירים מורכבים יותר עוצבו כדי מערך עוברי בעוד עדיין בתוך chorion שלהם, אשר מספק של גאומטריה ספירית פשוטה, כי ניתן לטפל בקלות עם תפוקה גבוהה יחסית של מערכות אלה,18,19. מספר קבוצות פיתחו פלטפורמות עבור סידור במערך והדמיה דג זברה הפרפרים והעשים שונים אוריינטציות6,20, היצור הכי ידידותי micropump פסיבי מונע "זברה" מערכת שפותחה על ידי המעבדה ביב6 . בניגוד למערכת זברה, המכשיר זה נתאר כאן משתמש היניקה, שנוצר באמצעות פיפטה של העברה סטנדרטי, למשוך הרימות אל הערוצים, בזמן טעינת מקבילים ולא רציפים של הזחלים מאפשר חילוץ של הזחלים בודדים פוסט-הדמיה מאת החלת תזרים חיובי דרך אותה היציאה. יתר על כן, הגישה שלנו דורש טביעת רגל קטנה יותר, אז יכול להיות מודבקת PDMS התקנים קונבנציונאלי זכוכית-6-ובכן לוחות עבור הדמיה.
הנבחנים הנוכחי מנצל התקנים נפרדים עבור microinjection והדמיה בעיקר כך הם יכולים לשמש עם ציוד הרגיל microinjection תקן הפוך מיקרוסקופים. גישות Microfluidic עבור microinjection אוטומטית של ביצי דג זברה כבר קיים21, בשילוב עם שיטות סוג "מלכודת דגים" סידור במערך ומדויקים והכיוון של הזחלים20, זה הנראה לעין את התקנים שילוב הזרקת זחל אוטומטית הדמיה עלולות גם יום אחד להפוך למציאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות לאנגנאו דוד למתן בנדיבות שטח האקווריום; אריק אבן, ג'ון ג. מור, צ'ין טאנג בשביל לעזור עם דג זברה תחזוקה, ריאגנטים, ו אן רוברטסון, אליוט Hagedorn מהמעבדה של לאונרד Zon עבור ברכישת המתח דג זברה המשמש כאן. הם גם רוצה להודות אוקטביו הורטדו לקבלת ייעוץ על טכניקות photolithographic. FE מומן על ידי מלגות מבית החולים של שריינר לילדים, האגודה האמריקאית אוסטרלי. עבודה זו מומן על ידי NIH הענק GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
