Summary
Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.
Abstract
Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.
Introduction
Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler4kullanarak larva gerektirir. Ancak, hedef doku iterek veya embriyo haddeleme olmadan nüfuz daha zor olduğu gibi daha büyük gauge iğne kullanımı önemli teknik sorunlar, sunar. Bu koşullar altında işlem sırasında kurutma kaçınmak zor olsa embriyo stabilize etmek için gereken uygun su gerginlik ve embriyo elde etmek hedef doku içine enjeksiyon için ideal odaklı olabilir.
Mikroenjeksiyon, enjekte embriyo başarıyla enjekte seçin ve başlangıç zaman noktası görüntülerini yakalamak için ekran yararlıdır. Bu sorunları ele almak üzere, çeşitli yönleriyle mikroenjeksiyon5için hem hızlı görüntü tabanlı tarama sonrası enjeksiyon için 2 dpf embriyo dengelemeye yardımcı microstructured cihazları bir dizi geliştirdi.
Bu cihazlar içinde yeterli yapısal kararlılık elde etmek için photolithographic teknikleri kullanılmıştır. Mikroelektronik sanayi ve daha yakın zamanda yaygınlaştırılması mikrosıvısal imalat için yaygın olarak kullanılan, bu yaklaşımlardan 1-1000 µm, Zebra balığı embriyo ve larva manipülasyon için uygun bir ölçek uzanan dikey yapıları elde edebilirsiniz. Tüm aygıtlar kullanarak ucuz, fiziksel olarak sağlam, biyolojik olarak inert ve şeffaf olan polydimethylsiloxane (PDMS), fabrikasyon.
Microstructured yüzey diziler (MSAs) PDMS taşları desenli bir üst yüzeyi olarak biçimlendirilmiş, benzer şekilde özel bloklar halinde basit kanalları daha yaygın olarak kullanılan yumurta mikroenjeksiyon için. Sonrası enjeksiyon tarama için 6 görüntüleme aygıtları bir standart cam popolu 6-şey tabak içinde dizilmiş. Bu cihazlar embriyo kolay yükleme için tasarlanmış, kaldırma yordamı uygun görüntü tabanlı kurtarma kolaylaştırmak belirli embriyo izin verirken bu aygıtları daha daha kullanıcı dostu bir şekilde yaklaşımlar eleme daha önce tarafından geliştirilen Beebe laboratuvar6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Larva mikroenjeksiyon Protokolü 2011N000127 altında Massachusetts genel hastane alt Komisyonu araştırma hayvan bakım tarafından kabul edildi.
1. cihaz imalat
Not: Burada açıklanan fotolitografi maskeleri tasarlamak için kullanılan tüm bilgisayar destekli çizim (CAD) dosyaları (şekil 1) elde edilebilir için download. Malzemeler tablo bağlantıları için bkz.
- Bir sınıf 1.000 temiz oda standart photolithographic teknikleri7kullanarak ana kalıp gofret imal. Mikroyapı diziler ve kanallar için üreticinin yönergelerine göre sıralı olarak 3 ayrı maskeleri kullanarak 3 kat epoksi esaslı negatif fotorezist desen: 100 µm sığ özellikleri için orta özellikler için 200 µm ve 400 µm derin özellikleri. Görüntü aygıtı için sığ ve derin özellikleri için 600 µm 400 µm kullanarak desen iki katmanlı.
- Tamamlanan gofret 15 cm Petri kabına (Şekil 2) döküm için tabanına kaydet.
2. Microstructured yüzey diziler - PDMS hazırlanması
- Kullanılabilir aygıtlar açmak için ana gofret bir kalıp olarak kullanarak polydimethylsiloxane (PDMS), atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı 5 g ile birleştirin ve plastik bir çatalla yemek ağırlığında bir plastik iyice karıştırın.
- Karışımı dikkatle kalıp dökün.
- Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.
- PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.
- Dikkatle cihazın bir neşter bisturi ucu ve gofret yüzey arasındaki temas korumak emin olmak istedim, kullanarak ana gofret kesti. Forseps kullanarak, gofret ve temiz bir 10 cm Petri dish, (şekil 3) özelliği tarafa aktarmak uzak PDMS yineleme kabuğu.
- Cihazın 35 için bir plazma fırın kullanarak oksijen plazma ile tedavi hydrophobicity azaltmak için s.
- 168 mg/L etil 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5) içeren Zebra balığı embriyo ile orta (E3) kapsar. Herhangi bir kabarcıklar akan tarafından daha derin özelliklerinden bir transfer pipet kullanarak aygıt yüzey üzerinde su kaldır.
3. Microstructured yüzey diziler - özel hazırlanması
- Bir negatif PDMS kalıp yapmak, oksijen plazma PDMS cihazla tedavi.
-
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane buharı8inert bir yüzey oluşturmak için PDMS cihazla tedavi. Kısaca:
- Bir duman başlık içinde bir vakum odasında özelliği-yan-up tedavi olmak için PDMS yerleştirin.
- PDMS yanındaki küçük bir açık cam veya alüminyum çanak yerleştirin ve dikkatle PFDTS 200 µL pipet (%98 silane) çanak içine.
Dikkat: PFDTS silane son derece kırılgandır, şiddetle su ile reaksiyona girer, yanıcı ve kişinin üzerine şiddetli deri ve göz hasara neden olur. Okuma MSDS ayrıntılı kullanmadan önce. - Vakum odası kapatır ve vakum 15-30 dakika, ya da PFDTS silane tamamen buharlaşıp kadar uygular.
- Cihazın bir Petri ve 2.1 2.3 adımda anlatıldığı gibi hazırlanan taze PDMS için bir kalıp olarak kullanın.
- En az 3 h için 65 ° C'de pişirin sonra tedavi aygıttan taze PDMS tüm katmanın soyma ve taze kabında yerleştirin. Bu o zaman olumsuz bir kalıp olarak özel oyuncular için kullanılabilir.
- Özel hazırlamak için özel tamamen eriyene kadar düşük jelleşme sıcaklık özel E3 içinde mikrodalga bir de %2 çözümünün kaynatın.
- Sıcak özel PDMS negatif kalıp dökün ve aygıt üzerinde bir aktarma pipet ile özellikleri tarafından akan sıcak özel kapsayan özel herhangi bir kabarcıklar kaldırmak.
- Kabarcıklar kaldırılır sonra 4 ° C özel ayarlamak için buzdolabında bekletin.
- El ile üzerinden PDMS altında bozulmayı tarafından olumsuz PDMS kalıp özel blok kaldırmak için bir yeni Petri kabına ve MS-222 içeren ıslak E3 ile özel blok aktarmak.
4. görüntü aygıtları PDMS hazırlanması
- Kullanılabilir aygıtlar açmak için PDMS ana gofret bir kalıp olarak kullanarak, atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı (2.1 adımda kullanılan ile aynı) ve karışımı iyice bir plastik plastik Çatalla yemek ağırlığında 5 g ile birleştirir.
- Karışımı dikkatle kalıp dökün.
- Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.
- PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.
- Aygıtların Master gofret kesme ve 1.5 mm yumruk kullanarak bağlantı noktaları yumruk.
- Tedavi de aygıtlar ve bir 6-şey cam-alt plaka ile oksijen plazma için 35 s, 2.6. adımda açıklandığı gibi.
- Bir aygıt özelliği yan-aşağı her cam coverslip 6-şey plaka için 10 dk 85 ° C ocağın üzerine yerleştirerek bond.
Not: başarılı bağ onaylamak için gümrüklü aygıtı forseps kullanarak bir yana firma basınç uygulayın. Cihazın cam coverslip bağlı kalmalıdır.
5. Zebra balığı kültür
- Kültür Zebra balığı embriyolar için 2 dpf standart teknikleri3kullanarak.
- Dechorionate embriyo forseps veya 1 mg/mL proteaz kullanarak (bkz: malzemeler tablo)3 yükleme üzerine cihaz, onları düzeltmek izin vermek için önce en az 30-60 dakika karıştırın.
- E3 (168 mg/1 mL 25 X ekleyerek M) MS-222 (pH 7.5) hisse senedi çözüm kendi kabında kullanarak embriyo uyuşturan.
6. yönünü Microstructured yüzeyde - Divot diziler Zebra balığı
- Öyle ki bu embriyoların daha kolay manipülasyon sağlar E3 ince (1-2 mm) tabakası ile kaplıdır, Petri kabına 2.7 (şekil 3A) adımda PDMS bloğundan hazırlayın.
- Embriyo (genellikle koşul başına 10-20) gerekli sayıda transfer pipet kullanarak PDMS blok yüzey aktarın.
- Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyo microstructured efendim (şekil 3A) itin. Efendim kullanımı dorsal ve ventral yönler için özellikle uygundur.
Not: Efendim ile sıkı bir için (dorsal ve ventral) uygun, blok paralel olarak divot yüzeyinde embriyo konumlandırma ve sonra onları bir saç döngüsü kullanarak pozisyona haddeleme deneyin. Divot daha derin iterek onları istikrarlı tutmaya yardımcı olacaktır.
7. yönünü Microstructured yüzeyde - Zebra balığı Microstructured kanalları
- E3 E3 düzeyi sokağın kenarına düşüyor ama rezervuar ve kanalları ve PDMS üzerinde ince bir tabaka hala mevcuttur kadar transfer pipet kullanarak microstructured kanalları (şekil 3B) desenli PDMS bloktan çizin.
- 10 embriyo 5.3 adımından kenar taşması değil dikkatli olmak bir transfer pipet kullanarak rezervuar aktarın.
- Saç döngüsü kullanarak, uygun kanalının girişinde huni içine her embriyo işlemek ve embriyo başkanı doğru kanal ve kanal girerken embriyonun uygun yönlendirmeyi vardır öyle ki yönlendirmek.
- Her embriyo yerde tutmak için yardımcı kanal duvarlarında hikayedir microfeatures ulaşıncaya kadar bir saç döngüsü kullanarak kanal aşağı kaydırın. Microstructured kanalları kullanılması özellikle yanal yönlendirme için tavsiye edilir.
Not: mikroenjeksiyon sırasında kayma embriyo azaltmak için rezervuar E3 çizerek yüzey gerilimi miktarını ayarlamayı deneyin.
8. mikroenjeksiyon Zebra balığı
-
Mikroenjeksiyon iğne hazırlayın.
- Micropipette çektirme yukarıda açıklanan4kullanan borosilikat cam microcapillary iğne yapmak. Elde edilen iğneler yaklaşık 10 mm Konik uzunluğu ile bir ucunda bir noktaya konik.
- Bu durumda 100 nM chemoattractant enjekte edilir çözüm hazırlamak (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanin (fMLP) veya Leukotriene B4 (LTB4)) ve 100 70 kDa rodamine dextran izleyici PBS nM.
- Çözüm 5 µL ince konik bir pipet kullanarak iğne yük ipucu (malzeme tabloya bakın).
- İğne manyetik bir stand üzerine monte ve bir picopump microinjector bağlı bir micromanipulator içine monte.
- 45 ° açıyla iğne ucu konik ucunu Forseps ile pinching tarafından kır.
- Enjeksiyon bolus boyutu 1 ayarlaması nL picopump denetleyicisi enjeksiyon zamanında ayarlayarak.
- Mikroenjeksiyon iğne açısını ayarlayın. Bir iğne 45 °'in Embriyolardan denetleyicisinde genellikle embriyo uzunluğu paralel iğne ile iyi bir başlangıç noktası açısıdır. Bir dik açı embriyo yanal hareketi mikroenjeksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılabilir.
- İğneyi yakın Petri kabına sol el ile ve hakkı olan iğne micromanipulator kontrol, mikroenjeksiyon, bu durumda ve vezikül hedef siteye mümkün olduğunca getir.
Not: Ve vezikül dikdörtgen organ iki küçük ayrı karanlık dikdörtgen yapı (otoliths) içeren göz posterior olarak tespit edilebilir. - Embriyolardan denetleyicisi kullanarak, iğne ucu vezikül içinde öyle ki (Bu durumda ve vezikül) hedef doku nüfuz ve picopump ayak pedalı anahtarı kullanarak önceden oluşturulmuş hacim enjekte.
Not: doku penetrasyonu direnir, Embriyolardan denetleyicisi topuzu hafifçe dokunarak deneyin. - Embriyo serbest bırakmak için bir transfer pipet kullanarak yukarıdan aşağıya doğru veya öyle ki embriyo çevreleyen E3 yayımlanan çanak dönen yüzey üzerinde E3 akışı.
- Embriyo transferi pipet kullanarak MS-222 E3 kurtarma yemek için aktarın.
9. embriyo görüntüleme cihazı PDMS kullanarak tarama
- Adım 4.7, akan E3 (+ MS-222) aygıttan bağlantı noktası üzerinden Başbakan. Bu yapılabilir bir 1000 µL pipet ya da dar uçlu transfer pipet kullanarak.
- Cihazın kaplı kadar iyi E3 + MS-222 ile doldurun.
- 4 enjekte embriyo transferi pipet de her kullanarak adım 8.7 sunmak. Embriyo (Adım 5.3) yükleme öncesinde 1-2 min için E3 + MS-222 kuluçka tarafından istenirse önceden imzalat olabilir.
- Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyoların istenen yönde (kuyruk-ilk veya kafa ilk, kullanılan aygıt bağlı olarak) görüntüleme kanal girişlerinde yönlendirmek ve bunları kısmen cihazın (şekil 4A) içine itin. Bu cihazın içine eşit çizerken yardımcı olacaktır.
- E3 embriyo kanalları (şekil 4B) görüntüleme için doğru yönde içine çizilmiş kadar 1.000 µL pipet veya transfer pipet kullanarak bağlantı noktası aygıtı aracılığıyla çizmek.
Not: embriyo yakalama noktası geçmiş değil emmek için dikkatli olun, bu embriyolar zarar ve yönelimleri alter. - İyi-plaka (şekil 4 c) görüntüleme için mikroskop aktarın.
-
Ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.
- Büyütme uygun lens seçerek ayarlayın. 10 X genellikle Zebra balığı nötrofil geçiş görüntüleme için yararlı bir büyütme'dur.
- NET, ama değil doymuş her sinyal ışık kaynağı yoğunluğu ve pozlama süresi her kanal için ayarlanır.
- Esir alma imge her kanal için. Burada, biz yeşil flüoresan protein kullanılır (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas kırmızı (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) ve kanalları aktarılır. Çok kanallı görüntüler sonrası işleme sırasında kombine edilebilir (şekil 4B-ı).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yaklaşım geliştirme (şekil 1) ve photolithographic (Şekil 2) ve yumuşak tekniğinde (şekil 3) teknikleri kullanarak 2 dpf Zebra balığı ile kullanılacak cihazların üretim gösteriyor. Bu yöntem birçok tasarım yineleme ve değişiklikler hızlı test sağlar ve değişiklikler ve Mikroyapı boyutları diğer gelişim aşamasında Zebra balığı ile kullanılacak duruma getirilmesi onların uygulama uzatabilir.
Biz zorlu mikroenjeksiyon teknikleri ve rahat görüntüleme için bu cihazların kullanımı göstermektedir. Ve vezikül (şekil 4 d, beyaz çizgili anahat) yararlı, bağışıklık ayrıcalıklı ve izole bir site nötrofil işe alım Zebra balığı9' testleri için sağlar. Zebra balığı nötrofil standart chemoattractants, 100 tepki yeteneğini test etmek için fMLP ve LTB4 nM microinjected 2 dpf Zebra balığı embriyo (şekil 4F, J), ve veziküller microstructured kanal aygıtı ( kullanarak Şekil 1G) yanal yönde embriyolar dengelemek için. Enjeksiyonları yüksek molekül ağırlıklı rodamine dextran ile takip ve görselleştirme nötrofil alımı kolaylaştırmak için Tg(mpx:EGFP) embriyo gerçekleştirilen. Embriyo (şekil 4 d, H) ve tek başına (şekil 4E, ben) negatif denetimi olarak kullanılan rodamine enjekte embriyo uninjected. Mikroenjeksiyon, embriyo görüntü kanal aygıtı (şekil 1A, B) transfer edildi ve bir EVOS floresan mikroskop (şekil 4 c) kullanarak 30 dk ve 5 h mesaj enjeksiyon yansıma (şekil 4 d- G ve şekil 4 H-K, sırasıyla). Beklendiği gibi floresan nötrofil az sayıda sahte enjeksiyonlu ve vezikül, erken timepoint (şekil 4I), büyük olasılıkla zarar-aracılı işe alım nedeniyle işe. İlginçtir, rodamine dextran izleyici deneme sırasında otoliths içinde birikmesine gözlendi. Her iki chemoattractants (şekil 4F, J) için nötrofiller özellikle LTB4 karşılık olarak daha yüksek rakamlarla işe (şekil 4F).
Burada gösterilen temsilcisi sonuçlar başarılı kullanımı, bu yöntem için mikroenjeksiyon ve Zebra balığı görüntüleme gösterilmektedir. Zebra balığı nötrofil işe alım deneyleri bağlamında, uygulama bu araçların detaylı canlı görüntüleme teknikleri ve sofistike hücre göç analizi10 ile birlikte bu alanda gelecekteki deneyler için yararlı bir platform sağlar.
Şekil 1: bilgisayar destekli çizim (CAD) tasarım fotolitografi maskeler. (A-C) En düşük CAD tasarımı için lateral(a), (B) ventral ve dorsal (C) yönler konumlandırma için microstructured yüzey efendim. Farklı renkli çizgiler CAD maskesi çizmek yeşil 100 µm ile farklı özellikler için temsil, mavi 200 µm ve kırmızı 400 µm özelliği heights. Ölçek çubuğu = 500 µm. (D-F) CAD tasarım lateral (D), ventral (E) ve dorsal (F) yönler konumlandırma için microstructured kanallar için. Farklı renkli çizgiler yeşil 100 µm ile farklı özellikler için maske tasarımlar temsil, mavi 200 µm ve kırmızı 400 µm özelliği heights. Ölçek çubuğu: 500 µm. (G-Ben) için görüntüleme aygıtları yükleme kafa ilk (G) veya kuyruk-ilk (h) için tasarlanmış CAD tasarımı. Kırmızı çizgiler 600 µm özellikleri temsil ederken mavi çizgiler 400 µm özellikleri, temsil eder. Oklar larva yüklü olan yön gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm =. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Ana silikon gofret. (A)üst bölümünde ana gofret bireysel larva efendim yönlendirme özellikleri gösterir. (B) alt bölümünde ana gofret tasarım microstructured kanallar için gösterilen. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Microstructured PDMS aygıtları. (A) PDMS blok gelen ana gofret efendim bireysel larva yönlendirme için gösterilen döküm. (B) PDMS dökme gelen ana gofret microstructured kanalları gösterilen engelleyin. Bu rakam Ellett ve ark. değiştirildi 5 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi sonuçları: İşe Alım Zebra balığı nötrofil chemoattractants teslimini mikroenjeksiyon ve vezikül takip Imaging. (A-B) Yükleme ve görüntüleme için embriyo montaj. (A) kafa ilk aygıt ile embriyo ile bağlantı noktası belirtilen (siyah oku) yükleme için hazır. Sonra pozisyon (sarı ok) içine çektiği (B) Indirim embriyo. (C) 6-şey cam-alt plaka görüntüleme aygıtları üzerinde mikroskop ile. Bu biçim 4 / yanal Imaging yönelik standart bir ters mikroskop kullanarak embriyo iyi (24 embriyo toplam), başına sağlar. (D-G) Nötrofil (EGFP-yeşil) bir uninjected (D) embriyo ve aşağıdaki ve vezikül mikroenjeksiyon rodamine dextran (kırmızı, açık beyaz ok ucu) Yalnız, (E), 100 nM LTB4 (F) ve 100 nM fMLP (G) 30 dk sonrası enjeksiyon (MPI). (H-K) Nötrofil (EGFP-yeşil) bir uninjected (H) embriyo ve 5 h ve vezikül mikroenjeksiyon rodamine dextran (kırmızı, açık beyaz ok ucu) Yalnız, (ben), 100 takip nM LTB4 (J) ve 100 nM fMLP (K) 5 h mesaj enjeksiyon ( HPI). Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.
MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeksiyon iğne mantar conidia veya teslimi için daha büyük bir iğne kullanımını gerektiren insan kanser hücreleri gibi içinde bulduk. Embriyo sık sık iğne ile temas rulo olarak ve vezikül (şekil 4) içine enjeksiyon belirli bir meydan okuma sunuyor. Biz kullanan şark ve Zebra balığı bir lateral içinde stabilize microstructured kanal bulmak yönlendirme büyük ölçüde geliştirilmiş performans ve bizim ellerde bu tekniğin doğruluk.
Montaj tutarlılık embriyo ve azaltılmış sırasında hasar olasılığı arasında artan özel kaçınarak nötrofil işe alım veya xenograft metastaz, değerlendirilmesi gibi farklı zaman noktalarda yanal odaklı Zebra balığı, hızlı görüntüleme için Kurtarma sonrası görüntüleme. Bu aygıtlar aynı zamanda Genişletilmiş zaman atlamalı görüntüleme için umut verici ve başarıyla en az balık hareketi 12 h ile çok kanallı, multiplane görüntüler yakalamak için kullanılan. Onlar özel tarafından kısıtlı değil çünkü larva aktif uzama sırasında bu dönem (54-78 hpf dan ~ 300 µm)11 sınırlanmamıştır ve normal olarak devam edebilirsiniz.
Hazırlanması ve bu araçların kullanımı en kritik adımlarda en temel PDMS mikrosıvısal cihazların kullanımı yaygındır: aygıt-meli var olmak iyice ıslak ve baloncuklar önlenebilir. Bu tür sorunları önlemek için oksijen plazma tedavi ile doğan yüzey hydrophilicity hala mevcut iken hemen onlar cihazlarında sonra E3 aygıtlardan ıslak. Oksijen plazma ile yeniden tedavi geçici hydrophilicity yaşında PDMS cihazlara geri yüklemek için de kullanılabilir.
Burada kullanılan kesin geometrileri, ikinci gün sonrası döllenme sırasında photolithographic teknikleri, ama mevcut tasarımları limit kullanım yüksek çözünürlüklü Zebra balığı için yararlanın. Re-Tasarım geçerli platformda temel geometrileri 1 dpf ve mikroenjeksiyon için 3 dpf başarılı yönünü sağlayacak. Daha fazla batmaz 4 dpf larvaları ile şişirilmiş yüzmek sidiktorbası yönünü büyük olasılıkla daha zor olacağını ve yüksek su gerilim ile birlikte rahat geometrileri gerektirir. Karmaşık aygıtlar akışı veya vakum entegre alternatif bir yaklaşım çok çeşitli gelişim aşamalarında ilgili sağlayabilir ama aynı zamanda Pompalar ve kablo kanalları, maliyet ve aygıt hatası riski artan kullanımı gerektirir.
PDMS Biyouyumluluk, şeffaflık ve yeniden kullanılabilirliği sağlamak burada açıklananlar gibi cihazlar imalatı için maliyet-etkin ve yararlı bir malzeme var. Zebra balığı için PDMS aygıtları kullanmanın bir dezavantajı E3 sığ tabakalarının cihazın yüzeyi Tarih bakımından zorlu yapabilirsiniz hydrophobicity var. Her ne kadar bu yeniden kullanılabilirliği sınırlar ve cihazların kırılganlık artar mikroenjeksiyon cihazlar özel döküm tarafından bu sorun önlenebilir. Tercih edilen bir alternatif hydrophilicity PDMS12veya uygun bir plastik yüzey kullanımı artar Biyouyumlu yüzey işlem kimliği olur.
Ya su gerginlik4 2 dpf, Zebra balığı mikroenjeksiyon için geçerli yöntemleri kullanabilir ya da basit Kanallar hareketsiz ve larvalar konumlandırmak için ticari kalıpları kullanarak özel döküm. Bu yaklaşımlar yönlendirmesi sınırlı denetim sağlamak ve embriyoların hızlı kurutma tarafından karmaşık. Microstructures efendim entegre ve burada kullanılan kanalları yönlendirmek ve üzerinde böylece kurutma riskini azaltarak tamamen su gerilim bağlı olmadan larvaları hareketsiz için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu efendim derinliği onları mikroenjeksiyon için erişilmez duruma 3D yazdırılan kalıplar kullanılarak yapılan efendim daha önce için görüntüleme amacıyla13, embriyo yönünü için kullanılmıştır.
Zebra balığı görüntüleme için mikrosıvısal sistemlerinin kullanımı giderek yaygın14haline geliyor.
Birden çok akış sistemleri aracılığıyla zaman içinde Zebra balığı gelişiminin gözlem yeteneği isteğe bağlı15,16,17bileşikler tanıtmak için izin vermek için geliştirilmiştir. Daha karmaşık aygıtlar bu sistemleri18,19nispeten yüksek işlem hacmi ile kolayca manipüle edilebilir basit bir küresel geometri sağlayan hala onların koryon iken içinde dizi embriyolar için tasarlanmıştır. Çeşitli gruplar platformları için diziliyor ve larva sahne Zebra balığı en kullanıcı dostu pasif micropump Beebe lab6 tarafından geliştirilen "ZEBRA" sistemi tahrik olmak çeşitli yönleri6,20, görüntüleme geliştirdik . ZEBRA sistem aksine biz tanımlamak aygıt burada emme, oluşturulan standart transfer pipet kullanarak kullanır, larva yerine sıralı paralel yükleme sırasında kanalları içine larva çizmek için bireysel larva tarafından sonrası Imaging kurtarılması sağlar pozitif akışı aynı bağlantı noktası üzerinden uygulanıyor. Ayrıca, PDMS aygıtları geleneksel cam-alt 6-şey plakaları görüntüleme için bağlı bu yüzden daha küçük bir ayak izi, bizim yaklaşım gerektirir.
Geçerli deneysel tasarım mikroenjeksiyon ve böylece öncelikle onlar geleneksel mikroenjeksiyon ekipman ve standart ile kullanılabilir görüntüleme için ayrı bir aygıt kullanır Inverted Mikroskoplar. Zaten otomatik mikroenjeksiyon Zebra balığı yumurta için mikrosıvısal yaklaşımlar var21ve son derece hassas diziliyor ve larva20yönünü "balık-tuzak" türü yöntemleri ile birlikte, öngörülebilir entegre bu cihazlar Ayrıca otomatik larva enjeksiyon ve görüntüleme bir gün bir gerçeklik olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon'ın Laboratuarı'ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner'ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
