Summary
Микроинъекции zebrafish эмбриона и личинки является важным, но сложным техника, используемая во многих моделях данио рерио. Здесь мы представляем широкий спектр микромасштабной инструментов для оказания помощи в стабилизации и ориентации данио рерио микроинъекции и изображений.
Abstract
Данио рерио превратились в мощную модель различных заболеваний человека и полезным инструментом для увеличения диапазона экспериментальных исследований, охватывающих основные биологии развития через крупномасштабных генетических и химических экраны. Однако многие эксперименты, особенно тех, которые касаются инфекции и гранулы ксенотрансплантата модели, полагаются на микроинъекции и изображения эмбрионов и личинки, которые кропотливой методы, которые требуют навыка и опыта. Чтобы повысить точность и производительность современных методов микроинъекции, мы разработали ряд microstructured устройств для ориентации и стабилизации zebrafish эмбриона на 2 дня пост оплодотворение (dpf) в брюшной, спинной или поперечной ориентации до процедура. Для оказания помощи в визуализации эмбрионов, мы также разработали простое устройство с каналами, которые Ориент 4 данио рерио боково параллельно против скольжения обложки стекла. Вместе инструменты, которые мы представляем здесь продемонстрировать эффективность фотолитографический подходов для создания полезных устройств для оптимизации данио рерио методов.
Introduction
Данио рерио превратились в мощную модель для многих областях, начиная от исследования фундаментальных биологии развития для крупномасштабных генетических и химических экранов1,2. Рутинной генетических манипуляций, например гиперэкспрессия генов, сногсшибательно, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза и трансгенез полагаются на микроинъекции генетического материала в одной ячейки зиготы, которая привела к разработке простых, легко в использовании, коммерчески доступные инструменты для ориентации и стабилизации яйца для инъекций3. Другие подходы, например трансплантации и инфекции, часто требуют микроинъекции в поздней стадии эмбриона и личинки, с использованием больших датчика капиллярного иглы4. Однако использование больших датчик иглы представляет значительные технические проблемы, как это более трудно проникнуть в ткани-мишени без нажатия или прокатки эмбриона. В этих условиях получения напряженности соответствующие воды, необходимых для стабилизации эмбриона, хотя трудно избежать высыхания во время процедуры и эмбрионы не может быть идеально ориентированы для инъекций в ткани-мишени.
После микроинъекции полезно часто вводят эмбрионов, выбрать те, которые были успешно введены и для захвата изображений в начальный момент времени точки на экране. Для решения этих проблем, мы разработали широкий спектр microstructured устройств, которые помогают стабилизировать 2 dpf эмбрионов в различных ориентациях микроинъекции5и для быстрого скрининга на основе образа впрыск.
Чтобы получить достаточных структурных резолюции в этих устройств, мы использовали фотолитографический методы. Широко используется в микроэлектронной промышленности и более недавно экстраполированы microfluidic изготовление, эти подходы можно добиться вертикальной структуры, начиная от 1-1000 мкм, масштаба, хорошо подходит для манипуляции zebrafish эмбриона и личинки. Все устройства были изготовлены с использованием полидиметилсилоксан (PDMS), который дешево, физически надежные, биологически инертным и прозрачным.
Microstructured поверхности массивы (СУУ) были отформатированы как блоки PDMS с узорными верхней поверхности, аналогичен простой каналы в блоках агарозы широко используется для микроинъекции яйцо. Для скрининга впрыск, 6 изображений устройства можно одеть в стандартной пластине 6-ну прозрачным дном. Эти устройства предназначены для легкой загрузки эмбрионов, в то время как процедуре выгрузки удобно позволяет спасения конкретных эмбрионов, содействия на основе образа скрининг подходов в более удобной для пользователя форме, чем те устройства, разработанной ранее Биб Лаборатория6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Микроинъекции личинок был одобрен Подкомитетом общие больницы Массачусетс на исследования животных уход под протокол 2011N000127.
1. устройство изготовление
Примечание: Все компьютерные рисования (CAD) файлы используются для разработки фотолитографии маски описано здесь (рис. 1) доступны для скачивания. Смотрите таблицу материалов.
- Изготовить мастер формы пластин в чистую комнату класса 1000 с использованием стандартных методов фотолитографический7. Для массивов микроструктуры и каналы, модель на основе эпоксидных негативного фоторезиста последовательно в 3 слоя, используя 3 отдельные маски, согласно инструкции производителя: 100 мкм для мелких функций, 200 мкм для средних функций и 400 мкм глубокие возможности. Для изображений устройства шаблон, два слои с помощью 400 мкм для мелких функций и 600 мкм для глубоких функций.
- Лента завершенных пластин на базе 15 см Петри для литья (рис. 2).
2. Подготовка Microstructured поверхности массивов - PDMS
- Чтобы использовать устройства, литые полидиметилсилоксан (PDMS), используя мастер пластины как плесень. Объединить 50 g PDMS мономера с 5 g инициатора и тщательно перемешать в пластиковом весом блюдо с пластиковой вилкой.
- Залейте смесь тщательно плесень.
- Дега в вакуумный сушильный шкаф в 16-25 дюйм рт.ст (54-85 кПа) за 1 ч.
- Чтобы вылечить PDMS, выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h. PDMS следует лечить в солидной фирмы, но гибкие.
- Аккуратно вырежьте вокруг устройства на главной пластины с помощью скальпеля, убедившись в том поддерживать контакты между кончиком скальпель и поверхности пластин. С помощью щипцов, пил PDMS реплики от пластин и передачи чистых 10 см Петри, функция стороной вверх (рис. 3).
- Лечить устройство с кислородной плазмы с помощью плазменной печи для 35 s сократить гидрофобность.
- Крышка с zebrafish эмбриона среднего (E3) содержащих 168 мг/Л этиловый метансульфонат 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). Удалите любые пузыри от более глубокие возможности проточной воды на поверхности устройства с помощью пипетки передачи.
3. Подготовка поверхности Microstructured массивов - агарозы
- Чтобы отрицательные PDMS плесень, сначала лечить PDMS устройство с кислородной плазмы.
-
Лечить PDMS устройство с 1H, 1H, 2Ч, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) силана пара для создания инертной поверхности8. Кратко:
- Место PDMS быть очищенной особенность стороной вверх в вакуумной камере внутри зонта.
- Рядом с PDMS, место небольшое блюдо открытые стекла или алюминия, и тщательно Пипетка 200 мкл PFDTS (98% силана) в блюдо.
Предупреждение: PFDTS силана является крайне неустойчивым, бурно реагирует с водой, легковоспламеняющиеся и вызывает серьезные повреждения кожи и глаз на контакт. ИКБМ читать подробно перед использованием. - Закройте вакуумной камеры и применить вакуум для 15-30 мин, или до тех пор, пока PFDTS силана полностью испарилась.
- Поместите устройство в чашку Петри и использовать в качестве формы для свежих PDMS, подготовленный, как описано в шаге 2.1-2.3.
- Выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h, затем очистить весь слой свежего PDMS из обработанных устройства и место в свежие чашку Петри. Это может затем использоваться как отрицательные формы бросить агарозы.
- Подготовить агарозы, кипятите 2% раствор низкой гелеобразующего температуры агарозы в E3 в микроволновой, пока полностью не растворится агарозы.
- Залить горячей агарозы PDMS негативные формы и удалите любые пузыри в агарозы, охватывающих устройство проточной горячей агарозы над функции с передачей пипетки.
- После удаления пузырьков, поставить в холодильник на 4 ° C для задания агарозы.
- Удалите блок агарозы от негативных PDMS плесени, деформируя PDMS из под рукой, агарозы блок передачи новой Петри блюдо, и мокрый с E3 содержащих MS-222.
4. Подготовка PDMS изображений устройства
- Чтобы использовать устройства, литые PDMS, используя мастер пластины как плесень. Объединить 50 g PDMS мономера с 5 g инициатор (так же, как на шаге 2.1) и перемешать тщательно в пластиковом весом блюдо с пластиковой вилкой.
- Залейте смесь тщательно плесень.
- Дега в вакуумный сушильный шкаф в 16-25 дюйм рт.ст (54-85 кПа) за 1 ч.
- Чтобы вылечить PDMS, выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h. PDMS следует лечить в солидной фирмы, но гибкие.
- Вырезать устройства от мастер пластин и выбивать портов с использованием удар 1,5 мм.
- Лечить, устройства и 6-ну стекло дно хорошо пластины с кислородной плазмы для 35 s, как описано в пункте 2.6.
- Бонд устройства функция сторона вниз для каждого стекла coverslip 6-ну пластины, поместив его на 85 ° C плитой для 10 мин.
Примечание: Для подтверждения успешного связывания, давление фирмы к одной стороне кабального устройства, с помощью щипцов. Устройство должно оставаться прикрепленной к coverslip стекла.
5. данио рерио культура
- Культура данио рерио эмбрионов до 2 dpf с использованием стандартных методов3.
- Dechorionate эмбрионов, с помощью щипцов или 1 мг/мл протеазы смесь (см. таблицу материалов)3 по крайней мере 30-60 минут до загрузки на устройство, чтобы позволить им выпрямить.
- Обезболивают эмбрионов, с помощью (168 мг/Л) MS-222 (рН 7,5), добавив 1 мл 25 X Стоковый раствор для E3 в их Петри.
6. ориентация данио рерио на Microstructured поверхности - Дивот массивы
- Подготовьте PDMS блок из шага 2.7 (Рисунок 3А) в его чашку Петри, таким образом, что она покрыта тонкой (1-2 мм) слоем E3, которая позволяет легче манипуляции эмбрионов.
- Перевести необходимое количество эмбрионов (обычно 10-20 за состояние) на поверхности PDMS блока с помощью пипетки передачи.
- С помощью инструмента микроманипуляции (цикл волос или аналогичные), вставьте эмбрионы в microstructured дерна (рис. 3A). Использование дерна особенно подходит для дорсальной и вентральной ориентации.
Примечание: Для дерна с ужесточение подходят (спинной и брюшной), попробуйте позиционирования эмбрионы на поверхности блока параллельно Дивот и затем подвижного их в положение, с помощью цикла волос. Толкая их глубже в Дивот поможет держать их стабильными.
7. ориентация данио рерио на Microstructured поверхности - Microstructured каналы
- Снимать E3 PDMS блок с microstructured каналов (рис. 3B) с помощью пипетки передачи до тех пор, пока уровень E3 падает ниже края блока, но по-прежнему присутствует в водохранилища и каналы и тонким слоем на PDMS узором.
- Передача 10 эмбрионов от шага 5.3 в водохранилище, с помощью передачи пипетки, стараясь не переполнение края.
- С помощью цикла волос, манипулировать каждого эмбриона в воронку на входе соответствующего канала и ориентировать таким образом, чтобы голова эмбриона сторону канала и эмбрион имеет соответствующую ориентацию вводе канала.
- Переместите каждый эмбрион вниз канал, с помощью цикла волос, пока достигнет ориентации microfeatures в стенках канала, которые помогают держать его на месте. Особенно рекомендуется использовать microstructured каналов для поперечной ориентации.
Примечание: Для уменьшения зародыша, скольжения во время микроинъекции, попробуйте отрегулировать количество поверхностного натяжения, нарисовав E3 из водохранилища.
8. микроинъекции данио рерио
-
Подготовьте микроинъекции иглы.
- Сделайте боросиликатного стекла микрокапиллярной иглы с помощью съемника микропипеткой как описано4. Результате иглы должны конической до точки на одном конце, с коническим длиной примерно 10 мм.
- Приготовляют раствор для инъекций, в данном случае 100 Нм хемотаксического (N-формилметионин лейцил фенилаланин (fMLP) или B4 лейкотриенов (LTB4)) и 100 Нм 70 кДа родамин декстрана трассировщика в PBS.
- Загрузить 5 мкл раствора в иглу с помощью мелко конические пипетки Совет (см. таблицу материалов).
- Установите иглу в микроманипулятор монтируется на магнитную подставку и подключен к picopump microinjector.
- Разорвать кончик иглы под углом в 45 °, щипать конический наконечник с щипцами.
- Отрегулируйте размер болюс инъекций 1 nL, регулируя время впрыска на контроллере picopump.
- Отрегулируйте угол микроинъекции иглы. Иглу под углом 45 ° на контроллере микроманипуляции обычно является хорошей отправной точкой, с иглой, параллельно длине эмбриона. Чем круче угол может использоваться для сведения к минимуму боковое движение эмбриона во время микроинъекции.
- Управление Петри с левой рукой и микроманипулятор иглы с правом, Принесите иглы ближе как можно с нужным сайтом микроинъекции, в данном случае слуховой пузырек.
Примечание: Слуховой пузырек можно определить как продолговатые органа кзади глаз, содержащий две небольших отдельных темные продолговатые структуры (отолиты). - С помощью контроллера микроманипуляции, проникают в ткани-мишени (в данном случае слуховой пузырек) таким образом, чтобы кончик иглы находится внутри везикул и придать заданного тома с помощью ножной переключатель picopump.
Примечание: Если ткань сопротивляется проникновения, попробуйте осторожно нажав ручку микроманипуляции контроллера. - Чтобы освободить эмбрионы, поток E3 над поверхностью сверху вниз с помощью пипетки передачи, или закрученной блюдо, таким образом, что зародыши попадают в окружающих E3.
- Трансфер эмбрионов восстановления блюдо E3 без MS-222 с помощью пипетки передачи.
9. Отбор эмбрионов с использованием PDMS изображений устройства
- Простое устройство от шага 4.7 течет E3 (+ MS-222) через порт. Это может быть сделано с помощью пипетки 1000 мкл или передачи УЗК наконечник пипетки.
- Заполните колодец с E3 + MS-222, пока устройство покрыто.
- Доставить 4 эмбрионы вводят от шага 8.7 в каждый хорошо с помощью пипетки передачи. Эмбрионы могут быть предварительно наркотизированных желанию инкубации в E3 + MS-222 для 1-2 мин до загрузки (шаг 5.3).
- С помощью инструмента микроманипуляции (цикл волос или аналогичные), Ориент эмбрионов на въездах визуализации каналов в желаемой ориентации (хвост первой или головой, в зависимости от используемого устройства) и частично подтолкнуть их в устройстве (рис. 4A). Это поможет привлечь их в устройство равномерно.
- Нарисуйте E3 через устройство от порта, используя 1000 мкл пипетки или передачи пипеткой до тех пор, пока эмбрионы вовлекаются в каналы в правильную ориентацию для изображений (рис. 4B).
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не сосать эмбрионов мимо точки треппинга, это будет ущерб эмбрионы и изменить их направленность. - Трансфер хорошо плита микроскоп для изображений (рис. 4 c).
-
Изображение с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные.
- Отрегулируйте масштаб, выбрав соответствующие объектива. 10 X обычно является полезным увеличение для визуализации данио рерио нейтрофилов миграции.
- Таким образом, чтобы каждый сигнал ясно, но не насыщенных Отрегулируйте интенсивность источника света и времени экспозиции для каждого канала.
- Захват изображения для каждого канала. Здесь, мы использовали Зеленый флуоресцентный белок (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Техас красный (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) и передаваемых каналов. Многоканальные изображения могут быть объединены во время пост-обработки (рис. 4В-я).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь подход демонстрирует дизайн (рис. 1) и изготовление приборов для использования с 2 dpf данио рерио, используя фотолитографический (рис. 2) и мягкие литографические техники (рис. 3). Этот метод позволяет быстрое тестирование многих итераций дизайна и модификаций и изменений и оптимизации микроструктуры размеры для использования с данио рерио на других этапах развития могут расширить их применения.
Мы демонстрируют использование этих устройств для сложных методов микроинъекции и удобный изображений. Слуховой пузырек (рис. 4 d, белый пунктирный контур) обеспечивает полезные, иммунной привилегированный и изолированных сайт для тестирования нейтрофилов вербовки в zebrafish9. Чтобы проверить способность нейтрофилов данио рерио реагировать на стандартных chemoattractants, 100 Нм fMLP и LTB4 были microinjected в otic везикулы 2 dpf zebrafish эмбриона (Рисунок 4F, J), с помощью устройства microstructured канала ( Рисунок 1 g) для стабилизации эмбрионов в поперечной ориентации. Инъекции были прослежены с высоким молекулярным весом родамин декстрана и в Tg(mpx:EGFP) эмбрионов для облегчения визуализации нейтрофилов вербовки. Uninjected эмбрионов (Рисунок 4 d, H) и эмбрионы вводят с родамин только (Рисунок 4E, я) использовались как негативный контроль. После микроинъекции, эмбрионы были переведены в устройство обработки изображений канала (рис. 1A, B) и образы с помощью микроскопа EVOS флуоресцентные (рис. 4 c) на 30 минут и 5 h пост впрыска (рис. 4 d- G и Рисунок 4 H-K, соответственно). Как и ожидалось, небольшое количество флуоресцентные нейтрофилов были наняты для макет вводят слуховой пузырек в начале timepoint (Рисунок 4I), скорее всего из-за повреждения опосредованной набора. Интересно, что трассировщик декстрана родамин было отмечено накапливаться в отолиты во время эксперимента. Для обоих chemoattractants (Рисунок 4F, J), нейтрофилы были набраны в более высоких количествах, особенно в ответ на LTB4 (Рисунок 4F).
Представитель результаты, показанные здесь демонстрируют успешное использование этого метода для микроинъекции и томографии у рыбок данио. В контексте данио рерио нейтрофилов набора анализов применение этих инструментов в сочетании с подробной живой методы визуализации и сложные клетки миграции анализ10 может предоставить полезной платформой для дальнейших экспериментов в этой области.
Рисунок 1: компьютерный чертежей (CAD) дизайн масок фотолитографии. (A-C) САПР для microstructured поверхности дерна для позиционирования в боковых (A), вентральной (B) и спинной ориентации (C). Различные цветные линии представляют собой конструкции CAD маски для различных функций, с зеленым 100 мкм, синий 200 мкм и красный 400 мкм функция высот. Шкалы бар = 500 мкм. (D-F) САПР для microstructured каналов для позиционирования в боковых (D), вентральной (E) и спинной ориентации (F). Различные цветные линии представляют собой конструкции маски для различных функций, с зеленым 100 мкм, синий 200 мкм и красный 400 мкм функция высот. Линейки: 500 мкм. (G-я) САПР для изображений устройства, предназначенные для загрузки головой (G) или хвост первый (H и I). Синие линии представляют собой 400 мкм функции, в то время как красные линии обозначают 600 мкм функции. Стрелки показывают направление, в котором загружаются личинки. Шкалы бар = 200 µm. Эта цифра была изменена от Ellett и др. 5 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: мастер вафельные силикона. (A) верхней части функций шоу мастер пластин для ориентации отдельных личинок в дерна. (B) нижней секции Мастер вафли, показаны дизайн для microstructured каналов. Эта цифра была изменена от Ellett и др. 5 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: устройства Microstructured PDMS. (A) PDMS блок литые из главной пластины, показаны дерна для ориентации отдельных личинки. (B) PDMS блокировать литой из главной пластины, показаны microstructured каналы. Эта цифра была изменена от Ellett и др. 5 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результаты: Imaging вербовки данио рерио нейтрофилов после доставки chemoattractants микроинъекции в слуховой пузырек. (A-B) Загрузка и монтаж эмбрионов для воображения. (A) голова первое устройство с эмбрионов, готовые для загрузки, с портом (черная стрелка). (B) загружен эмбрионов после того, как они были втянуты в позицию (желтая стрелка). (C) 6-ну стекла-днище с изображений устройств на микроскопе. Этот формат позволяет изображений 4 боково ориентированных эмбрионов за хорошо (всего 24 эмбрионов), используя стандартный инвертированным микроскопом. (D-G) Нейтрофилы (EGFP-зеленый) в uninjected (D) эмбриона и следующие слуховой пузырек микроинъекции о родамин декстрана (красный, открытые белые стрелки) только (E), 100 Нм LTB4 (F) и 100 Нм fMLP (G) 30 мин пост инъекции (mpi). (H-K) Нейтрофилы (EGFP-зеленый) в uninjected (H) эмбриона и 5 ч после слуховой пузырек микроинъекции в одиночку родамин декстрана (красный, открытые белые стрелки) (я), 100 Нм LTB4 (J) и 100 Нм fMLP (K) 5 h пост инъекции ( HPI). Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь, мы описывают использование устройств мы недавно разработали для облегчения 2 dpf данио рерио микроинъекции5и ввести устройство простой монтаж бесплатно агарозы для удобного отображения эмбрионов. Эти инструменты подчеркнуть полезность фотолитографический техники для изготовления устройств, полезных для данио рерио методов.
Мы нашли MSA устройства особенно полезен для инъекции клеток или частицы склонной к агрегации в пределах микроинъекции иглы, например грибковых конидий или человеческих раковых клеток, которые требуют использования больших отверстие иглы для доставки. Инъекции в слуховой пузырек (рис. 4) представляет особую проблему, как эмбрионы часто крен при контакте с иглой. Мы считаем, что использование microstructured каналов, которые ориентации и стабилизации данио рерио в боковых ориентации значительно улучшить пропускную способность и точность этой техники в наших руках.
Для быстрого изображения горизонтально ориентированной данио рерио в разное время точках, таких как оценки нейтрофилов вербовки или гранулы ксенотрансплантата метастазов, избегая агарозы увеличилась монтажа согласованности между эмбрионов и снижение шансов повреждения во время После визуализации спасения. Эти устройства также обещают за длительное время Замедленная съемка изображений и были использованы для успешно захватить многоканальный, многоплановые изображения с минимальным рыбы движения более 12 ч. Потому что они не ограничиваются агарозы, активные удлинение личинок в течение этого периода (~ 300 мкм от 54-78 hpf)11 является неограниченным и может идти нормально.
Наиболее важные шаги в подготовке и использовании этих средств являются общими для использования большинства устройств microfluidic PDMS основе: устройства должны быть тщательно смоченные и избежать пузырей. Чтобы избежать таких проблем, мокрые в E3 устройства сразу же после того, как они изготовлены, в то время как гидрофильность поверхности, предоставленных плазменной очистки кислорода еще присутствуют. Повторное лечение с кислородной плазмы может также использоваться для временно восстановить гидрофильность возрасте PDMS устройств.
Точной геометрии, используемый здесь воспользоваться преимуществами высокого разрешения фотолитографический методы, но текущее ограничение использования конструкций для данио рерио во второй день после оплодотворения. Re-дизайн геометрии на основе текущей платформы позволит успешно ориентации 1 dpf и 3 dpf для микроинъекции. Ориентация личинок более динамичного 4 dpf с завышенным плавательные пузыри скорее всего будет более сложным и требуют уютно геометрии в сочетании с высокаяа напряженность воды. Комплекс устройств, интеграции потока или вакуум может предоставить альтернативный подход, применимые к широкому кругу стадии развития, но также потребует использования насосов и труб, увеличивая стоимость и риск отказа устройства.
PDMS является экономически эффективным, полезным материалом для изготовления устройств, таких как те, описанные здесь, обеспечивая биосовместимость, прозрачность и повторного использования. Один из недостатков использования PDMS устройств для данио рерио является гидрофобность, который может сделать обслуживание мелких слоев E3 на поверхности устройства сложной. Этой проблемы можно избежать путем приведения устройства микроинъекции в агарозы, хотя это ограничивает возможности повторного использования и увеличивает хрупкость устройств. Предпочтительной альтернативой было бы определение биосовместимых обработки поверхности, что повышает гидрофильность PDMS12, или использования соответствующего пластиковой подложки.
Нынешние методы для микроинъекции данио рерио на 2 dpf использовать либо воды напряжение4 или простые каналы бросили в агарозы, используя коммерческие формы для иммобилизации и положение личинок. Эти подходы обеспечивают ограниченный контроль ориентации и может быть осложнено быстрого высыхания эмбрионов. Микроструктур интегрированы в дерна и каналы, используемые здесь предназначены для ориентации и иммобилизации личинки без полностью в зависимости от напряжения воды, таким образом снижая риск сушки. Дерна с использованием 3D печатной формы ранее были использованы для ориентации эмбрионов для визуализации целей13, хотя глубина этих дерна сделали их недоступными для микроинъекции.
Использование систем microfluidic данио рерио изображений становится все более распространенным14.
Были разработаны несколько потока через системы разрешить наблюдение данио рерио развития со временем с возможностью ввести соединений по запросу15,16,17. Более сложные устройства были разработаны для массива эмбрионов в то время как все еще в пределах их хориона, который обеспечивает простой сферической геометрии, которые могут быть легко манипулировать с относительно высокой пропускной способности в этих системах18,19. Несколько групп разработали платформы для одевающ и визуализации данио рерио личиночной стадии в различных ориентаций6,20, причем наиболее удобной пассивной микронасосом инициативе «Зебра» система, разработанная в лаборатории Биб6 . В отличие от системы Зебра устройство, которое мы описываем здесь использует всасывания, созданный с использованием стандарта передачи пипетки, рисовать личинки в каналы, при выполнении параллельного, а не последовательные загрузки личинок позволяет спасения отдельных личинок после обработки изображений Применяя положительный поток через тот же порт. Кроме того наш подход требует меньше дискового пространства, поэтому PDMS устройства можно стружечные для обычных стекло дно 6-ну пластины для обработки изображений.
Текущий экспериментальный дизайн использует отдельные устройства для микроинъекции и визуализации главным образом так, что они могут использоваться с обычными микроинъекции оборудование и стандарт инвертированный микроскопы. Microfluidic подходы для автоматизированного микроинъекции данио рерио яйца уже существуют21, и в сочетании с методы типа «рыба ловушки» для высокоточной одевающ и ориентации личинки20, можно предположить, что устройства интеграции автоматизированный личиночной инъекций и изображений могут также один день стать реальностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Лангенау за щедро предоставленные аквариум пространства; Эрик Стоун, Джон C. Мур и Цинь Тан для помочь с данио рерио обслуживания и реагентов и Энн Робертсон и Эллиотт Hagedorn Леонард Zon лаборатории для закупки штамм данио рерио, используемый здесь. Они также хотели бы поблагодарить Octavio Уртадо за консультацией по фотолитографический методов. FE финансировалось стипендии от Шрайнер в больницу для детей и Американской ассоциации Австралии. Эта работа финансировалась NIH Грант GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
