Summary
Microinjection av sebrafisk befruktede egg og larver er en avgjørende, men utfordrende teknikken brukes i mange sebrafisk modeller. Her presenterer vi et utvalg av Mikroskala verktøy til hjelp i stabilisering og retningen på sebrafisk for både microinjection og bildebehandling.
Abstract
Sebrafisk har dukket opp som en kraftig modell av ulike menneskelige sykdommer og et nyttig verktøy for en økende rekke eksperimentelle studier, som dekker grunnleggende utviklingsbiologi gjennom til store genetiske og kjemiske skjermer. Men stole mange eksperimenter, spesielt de relatert til infeksjon og xenograft modeller, på microinjection og bildebehandling befruktede egg og larver, som er arbeidskrevende teknikker som krever dyktighet og kompetanse. For å bedre presisjon og gjennomstrømningen av gjeldende microinjection teknikker, vi utviklet en rekke microstructured enheter å orientere og stabilisere sebrafisk embryoer på 2 dager innlegget befruktning (dpf) i ventral, rygg eller sideveis retning før den prosedyre. Til hjelp i avbilding av embryo, utviklet vi også en enkel enhet med kanaler som orientere 4 sebrafisk lateralt parallelt mot en glass cover slip. Sammen demonstrere verktøyene som vi presenterer her effektiviteten av photolithographic å generere nyttig enheter for optimalisering av sebrafisk teknikker.
Introduction
Sebrafisk har dukket opp som en kraftig modell for mange felt, fra studier av grunnleggende utviklingsbiologi til store genetiske og kjemiske skjermene1,2. Rutinemessig genetisk manipulasjon, som gene overuttrykte, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese og transgenesis er avhengige av microinjection av genetisk materiale i én celle zygoten, som har ført til utviklingen av enkle, lett-å-bruke, kommersielt tilgjengelige verktøy for orientere og stabilisere egg for injeksjon3. Andre tilnærminger, som transplantasjon og smitte, krever ofte microinjection senere stadium embryoer og larver bruker større gauge kapillær nåler4. Men presenterer bruk av større gauge nåler betydelige tekniske utfordringer, som det er vanskeligere å trenge vevet uten pådriver eller bølgende fosteret. Under disse forholdene, kan det ikke være ideelt orientert for injeksjon vevet den aktuelle vann spenning nødvendig for å stabilisere embryoet mens unngå tørking under prosedyren er vanskelig og embryo.
Etter microinjection er det ofte nyttig å skjermen injisert embryo å velge de som har vært vellykket injisert og ta bilder av det første punktet. For å møte disse utfordringene har vi utviklet en rekke microstructured enheter som bidra til å stabilisere 2 dpf embryo i ulike retninger både for microinjection5, og rask bilde-basert screening etter injeksjon.
For å oppnå tilstrekkelig strukturell oppløsning i disse enhetene, benyttet vi photolithographic teknikker. Brukt i microelectronic næringer og mer nylig extrapolated til microfluidic fabrikasjon, kan disse metodene oppnå loddrett strukturer fra 1-1000 µm, en skala godt egnet til manipulering av sebrafisk befruktede egg og larver. Alle enheter ble laget ved hjelp av polydimethylsiloxane (PDMS), som er billige, fysisk robust, biologisk inert og gjennomsiktig.
Microstructured overflate matriser (MSAs) ble formatert som blokker med PDMS med en mønstret overflaten, slik som enkel kanalene i agarose blokker brukte for egg microinjection. For etter injeksjon screening, kan 6 bildeenheter være plassert i en standard glassbunn 6-vel plate. Disse enhetene er designet for enkel innlasting av embryo, mens lossing prosedyren kan redning av bestemte embryoer, tilrettelegge image-basert screening tilnærminger i en mer brukervennlig måte enn disse enhetene tidligere utviklet av den Beebe laboratorium6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microinjection av Larvene ble godkjent av Massachusetts generelle sykehus Subcommittee på forskning Animal Care under protokollen 2011N000127.
1. enheten fabrikasjon
Merk: Alle dataassistert tegning (CAD) filer brukes til å utforme klima og jordsmonn masker beskrevet her (figur 1) er tilgjengelig for nedlasting. Se tabellen for materiale for koblinger.
- Dikte master mold kjeks i et klasse 1000 rent rom bruker standardmetoder photolithographic7. For mikrostruktur matriser og kanaler, mønster det epoxy-baserte negative photoresist i 3 lag med 3 separate masker, i henhold til produsentens instruksjoner: 100 µm til grunne funksjoner, 200 µm for middels funksjoner og 400 µm for dyp funksjonene. For bildeenheten lag mønster to med 400 µm for funksjonene grunne og 600 µm for dyp funksjoner.
- Tape fullført kjeks til bunnen av en 15 cm Petriskål for støping (figur 2).
2. forberedelse Microstructured overflaten matriser - PDMS
- For å gjøre brukbare enheter, felles polydimethylsiloxane (PDMS), bruke master kjeks som en mold. Kombinere 50 g av PDMS monomer med 5 g av initiatoren og bland godt i en plast veier parabolen med en plast gaffel.
- Hell blandingen forsiktig over mold.
- Degas i et vakuum desiccator i 16-25 inHg (54-85 kPa) 1t.
- For å kurere PDMS, stek ved 65 ° C i minst 3 timer. PDMS bør kur til en fast og fleksibel solid.
- Nøye klippe rundt enheten på master kjeks bruker en skalpell, og pass på å opprettholde kontakt mellom spissen av skalpell og wafer overflaten. Ved hjelp av pinsett, Skrell PDMS replikaen wafer og overføring til en ren 10 cm Petriskål, funksjonen side opp (Figur 3).
- Behandle enheten med oksygen plasma bruker en plasma ovn for 35 s å redusere hydrophobicity.
- Dekk med sebrafisk embryoet medium (E3) som inneholder 168 mg/L av ethyl 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Fjern bobler fra dypere funksjoner av flytende vann over overflaten av enheten med en overføring pipette.
3. forberedelse Microstructured overflaten matriser - Agarose
- For å gjøre en negativ PDMS mold, først behandle en PDMS enhet med oksygen plasma.
-
Behandle PDMS enheten med 1H1T, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane damp å opprette en inert overflate8. Kort:
- Sted PDMS å være behandlet funksjonen-side-fordel i et vakuum kammer i avtrekksvifte.
- Ved PDMS, plassere en liten åpen glass eller aluminium rett og nøye Pipetter 200 µL av PFDTS (98% silane) i retten.
Forsiktig: PFDTS silane er svært ustabilt, reagerer voldsomt med vann, er brannfarlig og forårsaker alvorlige hud og øyne skade på kontakten. Les MSDS i detalj før bruk. - Lukke vakuum kammeret og bruke vakuum i 15-30 minutter, eller til den PFDTS silane er helt fordampet.
- Plasser enheten i en Petriskål og bruke som en form for fersk PDMS, tilberedt som beskrevet i trinn 2.1-2.3.
- Stekes ved 65 ° C i minst 3 h, deretter skallet hele laget av ferske PDMS fra behandlet enheten og plasser i en fersk Petriskål. Dette kan deretter brukes som en negativ mold for å kaste agarose.
- For å forberede agarose, kok en 2% løsning av lav gelling temperaturen agarose i E3 i mikrobølgeovn til agarose er fullstendig oppløst.
- Hell den varme agarose over PDMS negative mold og fjerne bobler i agarose dekker enheten ved rennende varmt agarose over funksjonene med en overføring pipette.
- Når boblene er fjernet, kjøleskap på 4 ° C angi i agarose.
- Fjern agarose blokken fra negative PDMS formen ved å deformeres PDMS fra under for hånd, overføre agarose blokken til en ny Petriskål og våt med E3 med MS-222.
4. forberedelse av PDMS bildeenheter
- For å gjøre brukbare enheter, felles PDMS, med master kjeks som en mold. Kombiner 50 g av PDMS monomer med 5 g av initiativtaker (samme som brukes i trinnet 2.1) og bland godt i en plast veier parabolen med en plast gaffel.
- Hell blandingen forsiktig over mold.
- Degas i et vakuum desiccator i 16-25 inHg (54-85 kPa) 1t.
- For å kurere PDMS, stek ved 65 ° C i minst 3 timer. PDMS bør kur til en fast og fleksibel solid.
- Skjær enhetene fra Master kjeks og slå ut portene med en 1,5 mm slag.
- Behandle enheter og en 6-vel glass bunn godt plate med oksygen plasma for 35 s, som beskrevet i trinn 2.6.
- Bond enheten funksjonen-side-ned til hver glass dekkglassvæske av 6-vel platen ved å plassere den på en 85 ° C kokeplate i 10 min.
Merk: For å bekrefte vellykket binding, bruk fast trykk til en side av limt enheten ved hjelp av pinsett. Enheten skal være knyttet til glass dekkglassvæske.
5. sebrafisk kultur
- Kultur sebrafisk embryo til 2 dpf bruker standardmetoder3.
- Dechorionate embryo bruke tang eller 1 mg/mL protease blande (se materialer tabell)3 minst 30-60 minutter før lasting på enheten, å tillate dem å rette.
- Anaesthetize embryo bruker (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) ved å legge til 1 mL av 25 X lager løsning på E3 i deres Petriskål.
6. retning av sebrafisk på Microstructured overflate - Divot matriser
- Forberede PDMS blokken fra trinn 2.7 (figur 3A) i sin Petriskål slik at det er dekket av en tynn (1-2 mm) E3, som gir lettere manipulasjon av embryoene.
- Overføre antall embryo (vanligvis 10-20 per betingelse) på overflaten av PDMS blokken med en overføring pipette.
- Bruke et micromanipulation verktøy (hår loop eller lignende), presse embryoene til de microstructured divots (figur 3A). Bruk av divots er spesielt egnet til dorsal og ventrale orientering.
Merk: For divots med en strammere passer (dorsal og ventrale), prøve posisjonering i embryo på overflaten av blokken parallelt med divot, og deretter rulle dem på plass ved hjelp av et hår loop. Presser dem dypere inn i divot vil bidra til å holde dem stabile.
7. retning av sebrafisk på Microstructured overflate - Microstructured kanaler
- Trekke E3 av PDMS blokken mønstret med microstructured kanaler (figur 3B) bruker en pipette for overføring til nivået på E3 faller under kanten av blokken, men er fortsatt til stede i reservoaret og kanaler og et tynt lag på PDMS.
- Overfør 10 embryoer fra trinn 5.3 i reservoaret bruker en overføring pipette, være forsiktig med å overflyt kantene.
- Bruke en hår loop, manipulere hvert embryoet til trakten ved inngangen til den aktuelle kanalen og orientere slik at leder av embryoet er mot kanalen og fosteret har riktige retningen som den kommer inn kanalen.
- Skyv hver embryoet ned kanalen med en hår loop til den når den orienting microfeatures i kanalen veggene som bidrar til å holde den på plass. Bruk av microstructured kanaler er spesielt anbefalt for sideveis retningen.
Merk: For å redusere embryoet skyve under microinjection, prøve å justere mengden overflatespenning ved å tegne E3 fra reservoaret.
8. microinjection av sebrafisk
-
Forberede microinjection p.
- Gjøre Borosilikatglass microcapillary nåler med en brønnene avtrekker som beskrevet tidligere4. De resulterende nålene bør være koniske til et punkt i én ende, med en taper lengde på ca 10 mm.
- Forberede løsning som skal injiseres, i dette tilfellet 100 nM chemoattractant (N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanin (fMLP) eller Leukotriene B4 (LTB4)) og 100 nM av 70 kDa Rhodamine dekstran tracer i PBS.
- Laste inn 5 µL løsning i nålen bruker en fint konisk pipette tips (se materialer tabell).
- Montere nålen inn i en micromanipulator montert på en magnetisk stå og koblet til en picopump microinjector.
- Bryte spissen av nålen i 45 ° vinkel ved å knipe koniske spissen med tang.
- Juster injeksjon bolus størrelse til 1 nL ved å justere injeksjon tiden på picopump-kontrolleren.
- Justere vinkelen på microinjection nålen. En nål vinkel på 45 ° på micromanipulation-kontrolleren er vanligvis et godt utgangspunkt, med nålen parallelt med lengden på fosteret. En brattere vinkel kan brukes til å minimere sideveis bevegelse av embryoet under microinjection.
- Kontrollere Petriskål med venstre hånd og p micromanipulator rett, bringe nålen så nært som mulig til det aktuelle området av microinjection, i dette tilfellet otic vesicle.
Merk: Otic vesicle kan identifiseres som avlang orgelet bakenfor øyet som inneholder to mindre tydelig mørke avlang strukturer (otoliths). - Bruker micromanipulation kontrolleren, trenge vevet (i dette tilfellet otic vesicle) slik at spissen av nålen i vesicle og injisere forhåndsinnstilte volumet ved hjelp av fotbryteren for picopump.
Merk: Hvis vevet motstår penetrasjon, prøve å trykke forsiktig micromanipulation kontroller knotten. - For å frigjøre embryoene, flyt E3 over overflaten fra topp til bunn med en overføring pipette, eller av virvlende parabolen slik at embryoene slippes den omkringliggende E3.
- Overføre embryoene til en utvinning rett av E3 uten MS-222 bruker en overføring pipette.
9. screening av embryo bruker PDMS tenkelig apparat
- Prime enheten fra steg 4.7 flytende E3 (+ MS-222) gjennom porten. Dette kan gjøres enten en 1000 µL pipette eller en smal tupp overføring pipette.
- Fylle brønnen med E3 + MS-222 før enheten er dekket.
- Levere 4 injisert embryoer fra trinn 8,7 i hver brønn ved å en overføring pipette. Embryo kan pre bedøvet ved incubating inne E3 + MS-222 for 1-2 min før lasting (trinn 5.3).
- Bruke et micromanipulation verktøy (hår loop eller lignende), orientere embryo ved innfartsveiene av tenkelig kanalene i ønsket retning (hale-første eller hodet først, avhengig av enheten brukes) og presse dem delvis i enheten (figur 4A). Dette vil hjelpe trekke dem inn i enheten jevnt.
- Trekke E3 gjennom enheten fra porten bruker en 1000 µL pipette eller overføre pipette før embryoene trekkes inn i de i riktig retning for imaging (figur 4B).
Merk: Vær forsiktig med å suge embryoene forbi overlapping punktet, dette vil skade embryoene og endre sin retning. - Overføre godt-plate til mikroskopet for imaging (figur 4C).
-
Bildet med en invertert fluorescerende mikroskop.
- Juster forstørrelsesnivået ved å velge passende objektivet. 10 X er vanligvis en nyttig forstørrelse for imaging sebrafisk nøytrofile migrasjon.
- Juster lyskilde intensitet og eksponeringstid for hver kanal slik at hver signalet er klart, men ikke mettet.
- Ta bilder for hver kanal. Her vi brukte grønne fluorescerende protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas rød (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) og kanaler. Flerkanals bilder kombineres under etterbehandling (figur 4B-jeg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåten beskrevet her demonstrerer design (figur 1) og fabrikasjon av enheter for bruk med 2 dpf sebrafisk, bruker photolithographic (figur 2) og myke-litografiske (Figur 3) teknikker. Denne metoden gir rask testing av mange design iterasjoner og modifikasjoner og endringer og optimalisering av mikrostruktur dimensjoner for bruk med sebrafisk på andre stadier av utvikling kan utvide sine programmer.
Vi viser bruken av slike enheter for utfordrende microinjection teknikker og praktisk bildebehandling. Otic vesicle (Figur 4 d, hvit stiplet omriss) gir en nyttig, immun rettigheter og isolerte området for testing nøytrofile rekruttering i sebrafisk9. Teste muligheten for sebrafisk nøytrofile å svare på standard chemoattractants, 100 nM fMLP og LTB4 var microinjected i otic blemmer av 2 dpf sebrafisk embryo (figur 4F, J), med microstructured kanal enhet ( Figur 1G) å stabilisere embryo i laterale retning. Injeksjoner var spores med høy molekylvekt Rhodamine dekstran, og utføres i Tg(mpx:EGFP) embryoer å lette visualisering av nøytrofile rekruttering. Uninjected embryoer (Figur 4 d, H) og embryo injisert med Rhodamine alene (figur 4Ejeg) ble brukt som negative kontroller. Microinjection, embryo ble overført til bildeenheten kanal (figur 1A, B) og fotografert bruker en EVOS fluorescerende mikroskopet (figur 4C) på 30 min og 5 h innlegget injeksjon (Figur 4 d- G og Figur 4 H-K, henholdsvis). Som forventet, ble et lite antall fluorescerende nøytrofile rekruttert til uekte-injisert otic vesicle på det tidlige timepoint (figur 4I), sannsynligvis på grunn av skade-mediert rekruttering. Interessant, ble de Rhodamine dekstran tracer observert vil akkumuleres i otoliths under eksperimentet. For begge chemoattractants (figur 4F, J), nøytrofile ble rekruttert i høye tall, særlig i svar på LTB4 (figur 4F).
Representant resultatene vises her viser vellykket bruk av denne metoden for microinjection og bildebehandling for sebrafisk. I sammenheng med sebrafisk nøytrofile rekruttering analyser, kan bruk av disse verktøyene sammen med detaljert live Bildeteknikker og sofistikert celle migrasjon analyse10 gir en nyttig plattform for senere eksperimenter i dette feltet.
Figur 1: Computer assistert tegning (CAD) design av klima og jordsmonn masker. (A-C) CAD design for microstructured overflaten divots for plassering i lateral (A), ventrale (B) og dorsal (C) orientering. Forskjellige fargede linjer representerer CAD maske design for ulike funksjoner, med grønne 100 µm, blå 200 µm og røde 400 µm funksjonen høyder. Skala bar = 500 µm. (D-F) CAD design for microstructured kanaler for plassering i lateral (D), ventrale (E) og dorsal (F) orientering. Forskjellige fargede linjer representerer maske design for ulike funksjoner, med grønne 100 µm, blå 200 µm og røde 400 µm funksjonen høyder. Skala bar: 500 µm. (G-jeg) CAD design for bildeenheter designet for lasting hodet først (G) eller hale-første (H og jeg). Blå linjer representerer 400 µm funksjoner, mens røde linjene representerer 600 µm funksjoner. Pilene viser retningen hvor larvene er lastet. Skala bar = 200 µm. Dette tallet har blitt endret fra Ellett et al. 5 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: silikon master wafer. (A) øverst i master wafer viser funksjoner for orientere personlige larver i divots. (B) nedre delen av master wafer viser design for microstructured kanaler. Dette tallet har blitt endret fra Ellett et al. 5 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Microstructured PDMS enheter. (A) PDMS blokk kastet fra master wafer viser divots for orientere personlige larver. (B) PDMS blokkere støpt fra master wafer viser microstructured kanaler. Dette tallet har blitt endret fra Ellett et al. 5 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultater: Imaging rekruttering av sebrafisk nøytrofile etter microinjection levering av chemoattractants til otic vesicle. (A-B) Lasting og montering embryo for bildebehandling. (A) i hodet første enhet med embryo klar for lasting, med port angitt (svarte pilen). (B) den lastet embryoer når de har vært trukket inn posisjon (gul pil). (C) 6-vel glass bunn plate med bildeenheter på mikroskopet. Dette formatet kan imaging 4 lateralt orientert embryo per brønn (24 embryo totalt), bruker standard invertert mikroskop. (D-G) Nøytrofile (EGFP-grønn) i en uninjected (D) embryoet og følgende otic vesicle microinjection av Rhodamine dekstran (røde, open hvitt pilhode) alene (E), 100 nM LTB4 (F), og 100 nM fMLP (G) 30 min post injeksjon (mpi). (H-K) Nøytrofile (EGFP-grønn) i et uninjected (H) embryo og 5 h etter otic vesicle microinjection av Rhodamine dekstran (røde, open hvitt pilhode) alene (jeg), 100 nM LTB4 (J), og 100 nM fMLP (K) 5t innlegget injeksjon ( HPI). Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi bruk av enheter vi nylig utviklet for å lette 2 dpf sebrafisk microinjection5, og introdusere en enkel agarose uten montering enhet for praktisk bildebehandling av embryo. Disse verktøyene Uthev verktøyet photolithographic teknikker for fabrikasjon av enheter som er nyttig for sebrafisk teknikker.
Vi har funnet MSA enheter spesielt nyttig for injeksjon av celler eller partikler utsatt for aggregering innen microinjection nålen, som sopp conidia eller menneskelig kreftceller, som krever bruk av en større bar nål for levering. Injeksjon i otic vesicle (Figur 4) presenterer en spesiell utfordring, som embryo ofte ruller ved kontakt med nålen. Vi finner at bruk av microstructured kanaler som orientere og stabilisere sebrafisk i en lateral retning forbedret både ytelse og nøyaktighet av denne teknikken i våre hender.
For rask bildebehandling av sidelengs orientert sebrafisk på forskjellige tidspunkt, for eksempel vurdering av nøytrofile rekruttering eller xenograft metastasering, unngå agarose økte montering konsistens mellom embryoer og redusert sjansene for skader under stolpe-tenkelig redning. Disse enhetene også viser løftet for lengre tid forfalle bildebehandling, og har blitt brukt til vellykket fange flerkanals multiplane bilder med minimal fisk bevegelse over 12 timer. Fordi de ikke er begrenset av agarose, aktiv forlengelse av Larvene under denne perioden (~ 300 µm fra 54-78 hpf)11 er ubegrenset og kan gå som normalt.
De viktigste trinnene i utarbeidelse og bruk av disse verktøyene er felles for bruk av de fleste PDMS basert microfluidic enheter: enheter må være grundig fuktet og bobler unngås. For å unngå slike problemer, våt enhetene i E3 umiddelbart etter at de er laget, mens den overflaten hydrophilicity av oksygen plasma behandling er fortsatt til stede. Re-behandling med oksygen plasma kan også brukes til å gjenopprette transiently hydrophilicity til alderen PDMS enheter.
Presis geometrier her utnytte den høy oppløsningen photolithographic teknikker, men gjeldende design grense bruk sebrafisk under den andre dagen etter befruktning. Re-design av geometrier basert på gjeldende plattform gir vellykket retningen på 1 dpf og 3 dpf for microinjection. Retningen for mer spenstig 4 dpf Larvene med oppblåst svømmeblære ville trolig være mer utfordrende, og krever tettsittende geometrier i kombinasjon med høyere vann spenning. Sammensatte enheter integrere flyt eller vakuum kan gi en alternativ tilnærming gjelder for et bredere spekter av utviklingsstadier, men vil også kreve bruk av pumper og rør, økende kostnader og risiko for enhetsfeil.
PDMS er en kostnadseffektiv og nyttig materiale for fabrikasjon enheter som beskrevet her, gir biocompatibility, gjennomsiktighet og gjenbruk. En ulempe med å bruke PDMS enheter for sebrafisk er hydrophobicity, som kan gjøre vedlikehold av grunne lag av E3 på overflaten av enheten utfordrende. Dette problemet kan unngås ved å kaste microinjection enhetene i agarose, selv om dette begrenser gjenbruk og øker gebrekkelighet av enheter. Et foretrukket alternativ ville være identifikasjon av en biokompatible overflatebehandling som øker hydrophilicity PDMS12, eller bruk av en passende plastikk substrat.
Gjeldende metoder for microinjection av sebrafisk på 2 dpf bruk enten vann spenning4 eller enkel kanaler kastet i agarose bruke kommersielle muggsopp nakkens og plassere larvene. Disse gir begrenset kontroll over retningen og kan kompliseres av rask tørking av embryo. Microstructures integrert i divots og kanaler som brukes her er utviklet for å orientere og nakkens Larvene uten avhengig utelukkende på vann spenning, dermed redusere risikoen for tørking. Divots med 3D trykt former har tidligere brukt for orientering av embryo for bildebehandling formål13, selv om dybden av disse divots gjorde dem utilgjengelig for microinjection.
Bruk av microfluidic systemer for sebrafisk bildebehandling blir stadig vanligere14.
Flere gjennomflytsenhet systemer er utviklet for å tillate observasjon av sebrafisk utvikling over tid mulighet til å introdusere forbindelser på etterspørsel15,16,17. Mer komplekse enheter er designet for å rekke embryo mens den fortsatt er innenfor deres plasmocitara, som gir en enkel sfærisk geometri som kan lett manipuleres med relativt høy gjennomstrømning i disse systemene18,19. Flere grupper har utviklet plattformer for stiller opp og imaging larvestadiet sebrafisk i ulike retninger6,20, den mest brukervennlige er den passive micropump drevet "ZEBRA" system utviklet av Beebe lab6 . I motsetning til ZEBRA systemet, enheten som beskriver vi bruker her suge, generert ved hjelp av en standard overføring pipette, å trekke Larvene inn kanalene, mens parallelt i stedet for sekvensiell lasting av Larvene kan redning av personlige Larvene stolpe-tenkelig av Bruk positiv flyt gjennom samme port. Videre krever vår tilnærming en mindre footprint, så PDMS enheter kan festes til konvensjonelle glass-6-og bunnplater for bildebehandling.
Dagens eksperimentelle design bruker separate enheter for microinjection og imaging primært slik at de kan brukes med konvensjonelle microinjection utstyr og standard invertert mikroskop. Microfluidic metoder for automatisert microinjection av sebrafisk egg allerede finnes21, og i kombinasjon med "fisk-felle" type metoder for svært nøyaktig stiller opp og retningen på Larvene20, det er påregnelig at enheter integrere automatisert larver injeksjon og bildebehandling kan også en dag bli en realitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne gjerne takke David Langenau for sjenerøst å gi akvariet plass; Eric Stone, John C. Moore og Qin Tang for hjelp med sebrafisk vedlikehold og reagenser, og Anne Robertson og Elliott Hagedorn fra Leonard Zon lab for anskaffelse sebrafisk påkjenningen brukes her. De vil også gjerne takke Octavio Hurtado for råd på photolithographic teknikker. FE ble finansiert av stipend fra Shriner's Hospital for barn og American australske Association. Dette arbeidet ble finansiert av NIH gi GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
