Summary
Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.
Abstract
Doenças neurodegenerativas são frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento, esperança de vida reduzida e neurodegeneração idade-dependente. Para entender o mecanismo celular esses eventos e suas relações causais com o outro, Drosophila melanogaster, com as suas sofisticadas ferramentas de genéticas e diversas características comportamentais, são usadas como modelos de doença para avaliar neurodegenerativas fenótipos. Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para analisar o comportamento de adultos geotaxis negativo de Drosophila , como uma indicação para possíveis defeitos motor associado a neurodegeneração. Uma máquina automatizada é projetada e desenvolvida para sincronização de mosca de unidade usando um impulso elétrico inicial, mais tarde, permitindo a gravação de comportamento negativo geotaxis sobre um curso de segundos a minutos. Imagens do vídeo digitalmente gravado então são processadas com o software RflyDetection concebido para manipulação de dados estatísticos. Diferente do ensaio geotaxis negativo manualmente controlado com base em uma única mosca, este protocolo preciso, rápido e alta produtividade permite a aquisição de dados de mais do que centenas de moscas simultaneamente, proporcionando uma abordagem eficiente para avançar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de locomoção déficits associados a neurodegeneração.
Introduction
Uma variedade de protocolos e métodos foram desenvolvidos para analisar o comportamento de escalada adulto de Drosophila . Um pouco trabalhosa, a análise tradicional principalmente envolve a colocação de uma única mosca dentro de um frasco de individual e usa uma força manual para tocar voa para baixo para a sincronização1,2,3,4. É tedioso e demorado, impróprios para grandes estudos de alta produtividade e tem potenciais variações da força manual usado para bater para baixo as moscas, bem como outras limitações. Para melhorar o ensaio, um ensaio rápido iterativo negativo Geotaxis (anel) foi desenvolvido, que permite alta produtividade análise sobre numerosas moscas no mesmo tempo5. No entanto, o ensaio ainda requer uma força exercer manualmente para sincronizar a voar para ação. Nossa versão do ensaio do anel, revisado com o ensaio anterior, inclui uma base de metal Hospedagem de vários frascos contendo mosca controlados automaticamente por um motor elétrico para conduzir a sincronização voar6. Após a gravação, a mosca subindo imediatamente após a sincronização é gravada então analisados usando um software concebido. Nosso ensaio de anel automatizado eliminou o processo tedioso e trabalho intensivo em coletar dados de uma única mosca, um de cada vez e habilitado para o processo de aquisição de dados para ser mais eficiente. Além disso, o ensaio automatizado do anel tem sido empregado em uma série de estudos para elucidar a mecanismo subjacente a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, validando a abordagem com alta eficiência7,8,9 .
Neste artigo, vamos demonstrar o ensaio automatizado de anel usando o DDC-Gal4 conduzido RNAi moscas. DDC-Gal4 é uma linha de Gal4 especificamente expressando em dopaminérgico (DA) e neurônios serotoninérgicos, representando assim uma ótima ferramenta para analisar os efeitos do gene alvo associados com déficits locomotoras neurodegeneração10de acompanhamento. Além disso, incorporamos UAS-Dicer2, uma linha de mosca que aumenta a eficiência de RNAi, para gerar o UAS-Dicer2; DDC-Gal4 ferramenta linha. As moscas de RNAi escolhemos usar é o auxilin (aux), v16182 de RNAi (auxR16182), um gene que anteriormente identificamos para expor um efeito na atividade locomotora8de voar. auxGFP moscas também são preparadas para analisar os efeitos sobre a superexpressão de aux . Vamos mostrar como usar o ensaio automatizado do anel para medir mosca geotaxis negativa, apresentar os resultados e discutir quaisquer implicações que adquiriu a partir dos resultados.
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Protocol
1. coleção voar
- manter as moscas no padrão alimentar de voar em 25 ° C, umidade de 70% e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
- Recolher UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder voar de dióxido de carbono (CO 2) anestesia.
- Atravessar estas virgens para 2 dias de idade moscas machos adultas carregando os seguintes genótipos: UAS-mCD8GFP (controle), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux superexpressão), e auxR 16182; auxGFP (rescue), com um macho: fêmea relação de 1:2.
- Em separado recentemente coletar eclosed machos e fêmeas em 3 frascos para cada grupo, por experiência, colocando 10 moscas em cada frasco de mosca regular com padrão alimentar em 25 ° C.
- Dependendo do experimento, mantenha o coletados voa até 35 dias e usá-los para análise automatizada de anel no dia 5, 15, 25 e 35.
2. Automatizado do ensaio do anel
- transferir 10 moscas coletadas (unisex) por genótipo em cada frasco, em seguida, fixe o frasco com um parafuso. Analisar o controle de moscas e moscas carregando diferentes genótipos juntos para cada conjunto de experimentos (até 10 frascos simultaneamente, 10 moscas em cada frasco).
- Ligar a câmera digital colocada na frente do aparelho, e começar a gravar uma vez moscas está carregados e prontos.
- Após permitir 1 min para moscas instalar-se em frascos, ligue o controlador de passo que controla o driver passo; isto conduz o pequeno motor elétrico para controlar a alavanca anexada para que consecutivamente sobe e torneiras do aparelho 4 vezes em 2 s. Veja a Figura 1.
- Após a batida, note que as moscas começam a subir a parede. Certifique-se de que a gravação continua.
- Repita a sincronização conforme descrito na etapa 2.3 em intervalo de 60-s para ensaios consecutivos de 3 a 5.
- Repetir o experimento para 5, 15, 25 e 35 dias de idade moscas. Realizar pelo menos 3 experimentos independentes para cada grupo, cada experimento pelo menos 30 coletados voa (3 frascos).
3. Análise de dados
- importar o vídeo gravado para o computador.
- Tirar um instantâneo do vídeo em 6 s depois da batida, para cada julgamento.
- Importar a imagem do instantâneo para o software RflyDetection (ver Figura 2), usando o ' arquivo ' menu.
- Definir as linhas de base superiores e inferiores do frasco precisamente por usando o ícone de linha de base na barra de ferramentas e, em seguida, usando o cursor para marcar as linhas de base superiores e inferiores da imagem.
- o número de moscas por frasco (por exemplo, aqui 10) de entrada no ' Flys em rect ' campo e frasco de comprimento (por exemplo, 14cm aqui) no ' tubo altura ' campo dentro da barra de configurações.
- Nota que as posições individuais de mosca são detectadas e rotuladas com pontos na tela para cada frasco.
Nota: A Figura 2 indica as posições de todos os cliques de botão de menu.
- Nota que as posições individuais de mosca são detectadas e rotuladas com pontos na tela para cada frasco.
- Nota que o software automaticamente determina a distância escalada para cada mosca e exibe os valores em média de 10 moscas em cada frasco em uma tabela no painel da direita. (Ver Figura 2)
- Processo, o número de escalada com software estatístico (por exemplo, prisma) para posterior análise estatística.
- Presente os dados como média ± SEM.
- Calcular o p-valores de importância (indicados com asteriscos, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001) usando ANOVA One-Way com Bonferroni teste de comparação múltipla
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Representative Results
Este artigo demonstra o uso de um ensaio de anel automatizado em avaliar o comportamento de voar geotaxis negativo. Ao contrário o ensaio anterior do anel, nosso ensaio inclui um aparelho automatizado que fornece uma força elétrica para sincronizar a voar para ação e analisa até centenas de moscas simultaneamente (Figura 1). Análise de Dicer2 de ; DDC > auxR16182 moscas mostraram uma diminuição de idade-dependente à distância escalada em um prazo de 6 s para moscas machos e fêmeas, sugerindo que o aux expressão em neurônios DA é crucial para a atividade locomotora voar. Habilidade de escalada parece não ser afectada a superexpressão de auxGFP nos neurônios DA, e expressão co de auxR16182 e auxGFP nos neurônios DA resgatou o fenótipo de RNAi (Figura 2 e Figura 3). Além de validar o ensaio automatizado do anel como uma abordagem eficiente e de alta produtividade para avaliar motor defeitos associados DA degeneração de neurônios, esses resultados indicam também que esta abordagem automatizada é útil na identificação de potencial Risco de doença de Parkinson fatores e fornece uma pista sobre sua função neurodegenerativas.
Figura 1. O aparelho anel automatizado. (A e B) dianteira e traseiras vistas do aparelho: soquete (1), haste de aço vertical (2), um parafuso para fixar o tubo no quadro (3), frascos de plástico transparentes (4), espuma de bar (5), base de metal (6), motorista de micropasso (7), o controlador eletrônico (8), o interruptor (9), pequeno motor elétrico (10) e a alavanca anexado para o pequeno motor elétrico (11). O tamanho do quadro retangular de metal é 46 cm × 26 cm x 16 cm, 10 frascos plásticos transparentes (2,1 cm de diâmetro, 14,5 cm de altura) fixados com parafusos a segurar. Para ligar o aparelho, primeiro clique no interruptor (9), que se liga (8), (7) e (10) consequentemente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise de um representante de instantâneo imagem por RflyDetection. Imagem do instantâneo é importada para o software RflyDetection e ação para cada ícone na interface é indicada com o texto à direita. Depois de definir as linhas de base superior e inferior, o software detecta automaticamente e marca a posição voar dentro do frasco. A distância de escalada (cm) em 6 s para cada mosca e os valores em média para cada frasco são exibidos em uma tabela. Estes números são então importados para o software estatístico para posterior análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Estatística de barra de gráficos, apresentando um declínio de idade-dependente em voar capacidade escalar quando aux expressão é ativador nos neurônios DA. O ensaio de anel automatizado foi usado para analisar o comportamento negativo geotaxis para moscas carregando os seguintes genótipos: auxR16182/ + (nenhum Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 moscas cruzaram para w1118 (controle), UAS-mCD8GFP (controle), auxR16182, auxGFPe auxR16182; auxGFP (resgate). Observe que as moscas masculinas e femininas subiram significativamente mais lento ao longo do tempo quando aux expressão foi reduzida nos neurônios DA. Os aparelho locomotoras défices foram resgatados após reintrodução aux expressão. Moscas de 5, 15, 25 e 35 dias de idade, foram avaliadas. (A) do sexo masculino e feminino (B) moscas são mostradas separadamente. Lendas com rótulos de genótipo correspondente às cores diferentes bar são mostradas à direita. Dados são apresentados como média ± SEM. p-valores de importância (indicados com asteriscos, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, ns: nenhum significado, um bar foi desenhado abaixo os asteriscos para indicar os objetos para comparar) foram calculados comparando com o controle mCD8GFP ou aux RNAi usando ANOVA One-Way com Bonferroni teste de comparação múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ensaio de anel automatizado descrito aqui permite uma análise do elevado-throughput de comportamento de voar geotaxis negativo para centenas de moscas simultaneamente. Anteriormente estratégias existentes para a análise de escalada adulto envolvem observações de uma única mosca em um frasco individual e posição voar manualmente é detectada pelo olho. Este processo um pouco tedioso às vezes pode causar má interpretação ou má interpretação de dados, bem como trabalho trabalhoso. Nosso ensaio automatizado do anel começa com um simples clique, e o aparelho automaticamente sincroniza e avalia a capacidade de até 100 moscas escalar. A sincronização elétrica fornece um meio mais preciso para controlar o tempo e outros parâmetros, para que a captura total de voar escalada adulto processo pode ser cuidadosamente medido.
Em seguida, com o nosso software RflyDetection auto-concebidos, a posição exata de voar pode ser identificada. O software leva em consideração o total 2D frasco área (determinada pelo quadro retangular) e as linhas de base superior e inferior, antes de adquirir posições para todas as moscas dentro de área designada e os apresenta como pontos. Além disso, o cálculo automático de distância escalada e valores em média permite a manipulação de dados mais rápido e fácil. Conjuntos de dados ao longo de um grande grupo de moscas podem ser plausivelmente recolhidos e analisados dentro de um prazo razoável de7,8,9.
Mesmo que um dependente da idade a diminuição da escalada atividade associada a neurodegeneração é descrita aqui, este ensaio é igualmente eficaz na análise da atividade locomotora relevante a defeitos do desenvolvimento. Para este fim, o ensaio automatizado do anel é uma abordagem útil e eficiente para analisar Drosophila geotaxis negativo em qualquer estágio adulto e em um estado normal ou patológico da função cerebral. No entanto, o ensaio tem uso limitado na análise completamente todas as moscas, apesar do software RflyDetection é habilidade identificar manualmente qualquer acidentalmente termos ones.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o centro de estoque de Bloomington e centro de RNAi Viena drosófila para estoques de voar. A patente para o aparelho de anel pertence ao Instituto de pesquisas avançadas de Xangai, da Academia Chinesa de Ciências. Pedidos de software RflyDetection deve ser feito para Fu-de Huang (ver lista de autor). Este trabalho foi apoiado por concessões do nacional básica pesquisa programa de China (973 programa 2013CB945602) e Nacional Natural Science Foundation da China (31270825 e 31171043). Agradecemos a membros de laboratório Ho para discussão e comentários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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