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Chemistry

Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56527
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

Summary

Se presenta un protocolo para la síntesis, purificación y caracterización de un inhibidor basado en rutenio de la absorción de calcio mitocondrial. Un procedimiento para evaluar su eficacia en células de mamífero permeabilized está demostrado.

Abstract

Detallamos la síntesis y purificación de un inhibidor de la absorción calcio mitocondrial, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La síntesis optimizada de este compuesto inicia de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH en un envase cerrado, produciendo una solución verde. Se logra la purificación con cromatografía de intercambio catiónico. Este compuesto es caracterizado y verificada a ser puros por espectroscopia UV-vis e IR. Las propiedades inhibidoras de absorción calcio mitocondrial se evalúan en las células HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescencia.

Introduction

El calcio mitocondrial es un regulador clave de una serie de procesos que son críticos para la función normal de la célula, incluyendo la apoptosis y la producción de energía. 1 , 2 , 3 el calcio mitocondrial uniporter (MCU), una proteína del transportador de iones que reside en la membrana mitocondrial interna, regula el flujo de iones calcio en las mitocondrias. 4 , 5 , 6 inhibidores químicos de la MCU son herramientas valiosas para continuar los esfuerzos para estudiar la función y funciones celulares de esta proteína de transporte y de calcio mitocondrial. El compuesto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, es uno de los inhibidores selectivos de la conocida sólo para el MCU con un valor informado ded K de 24 μm.7 ,8,9,10 este complejo es una impureza común en formulaciones comerciales de rojo de rutenio (RuRed), un triruthenium di-μ-oxo puente hexacation de la fórmula [(NH3) 5 RU (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que también se ha utilizado como un inhibidor de la absorción de calcio. Aunque Ru360 está disponible en el mercado, es muy costoso. Por otra parte, la síntesis y el aislamiento de Ru360 es desafiado por purificación difíciles procedimientos y métodos de caracterización ambigua.

Recientemente hemos reportado procedimientos alternativos para acceder a un Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este compuesto inhibe el MCU con alta afinidad, similar a Ru360. En este protocolo, describimos nuestro más eficaz síntesis de este compuesto, que comienza de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificación del producto usando resina de intercambio catiónico fuertemente ácida es detallado, junto con errores comunes de este procedimiento. También presentamos los métodos para la caracterización y evaluación de la pureza compuesto y delinear un enfoque simple para probar su eficacia en el bloqueo de la absorción de calcio mitocondrial.

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Protocol

Nota: ácidos concentrados y bases se utilizan en esta síntesis. Utilizar todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza la reacción entre el uso de controles de ingeniería (campana extractora) y equipo de protección personal (EPP) incluyendo gafas de seguridad, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados.

1. preparación de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. síntesis de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. disolver 1.00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) en 5 mL de H 2 O. enfríe la solución marrón oscurezca a 0 ° C en un baño de hielo. Agregar 11 mL (0,23 mol) de solución de hidrato de hidracina de 80% en forma de gota a gota. La reacción inicial será vigorosa con el gas de la evolución, lo que resulta en una solución de color marrón. Deje que la solución resultante a agitar a temperatura ambiente durante 16 h; la solución final será rojo oscuro
      PRECAUCIÓN: La hidracina es agudo tóxico y cancerígeno. Además, las formas anhidras de este reactivo son explosivas. Como siempre, usar campanas apropiadas de PPE y humo al manejar. No concentre estas soluciones sequedad.
    2. a esta solución, agregar aproximadamente 5-10 mL de ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2. En este punto, la solución será amarillo-marrón en color.
    3. De calor esta solución a 105 ° C removiendo durante 1-2 h. Precipita un sólido amarillo de la solución. Cuando no más visiblemente precipitan formas, retirar del fuego.
    4. Permite la mezcla de reacción se enfríen a temperatura ambiente y luego colocar en un baño de hielo de 0 ° C por 10 minutos recoge el amarillo sólido por filtración de vacío y lavado con 5 mL de etanol y éter dietílico.
    5. Disolver totalmente el producto crudo en 15-25 mL de agua caliente. Enfriar 10 mL de una solución concentrada de HCl en un matraz de filtración al colocarlo en un baño de hielo. Filtrar la solución amarilla en la solución de ácido clorhídrico fría para inducir la precipitación de un sólido puro amarillo pálido. Este precipitado de filtro y lavar con 5 mL de HCl 0,5 M, etanol y éter.
    6. Caracterizar el compuesto usando espectroscopía de IR. Verificar la pureza de la identificación de frecuencias de estiramientos de 3226 cm -1, 1604 cm -1, cm 1297 -1 y 801 cm -1. Una impureza menor común en 2069 cm -1 se asigna a [5 N Ru (NH 3) 2] Cl 3.
  2. Síntesis de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. disolver 100 mg (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 en 50 mL de 1 M NH 4 OH en un recipiente de presión esférico de fondo redondo de pared gruesa de 200 mL. Libremente tapa el matraz con un tapón y la mezcla de reacción a 75 ° C por 6 h. Retire del calor y agitar a temperatura ambiente durante 4 días producir una solución verde oscurezca.
      ¡PRECAUCIÓN! Resultados de un recipiente sellado en una acumulación de la presión de la calefacción. Asegúrese de utilizar material de vidrio de seguridad de presión apropiado. Para esta reacción, el propósito de sellar el recipiente es minimizar la pérdida de gases NH 3. Por lo tanto, poner el tapón sin apretar para permitir la liberación de exceso de presión.
  3. Purificación por cromatografía de intercambio catiónico
    1. en un vaso de precipitados de 25 mL, suspender g 5-resina de intercambio catiónico (p. ej., Dowex 50WX2 200-400 mallas (forma de H +) en 10 mL de 0.1 M HCl.
    2. De carga esta mezcla en una columna de 10 mL (10 mm de diámetro, 15 cm altura) con un depósito de disolvente 50 mL. Lavar la resina con aproximadamente 20-30 mL de 0.1 M HCl, hasta que el efluente quede descolorido.
    3. Volver a la solución de reacción verde aislada en paso 1.2.1. A esta solución, Añadir ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2, momento en el que el color de la solución cambia a marrón.
    4. De carga esta solución acidificada a la columna de resina de intercambio catiónico preparada en el paso 1.3.2 transfiriendo suavemente encima de la resina. Que el efluente completamente drenar y seguir cargando la solución. Repita este proceso hasta que se ha agregado la solución completa. La parte superior de la resina será marrón oscuro/negro. La resina se reducirá en volumen un poco.
    5. Perlas de vidrio de uso para cubrir la parte superior de la resina. Estos evitará la resina ser molestado cuando se agregan nuevas soluciones.
    6. Eluir la columna con 20 mL de 1 M de HCl.
    7. Eluir la columna con una concentración elevada de ácido clorhídrico de 1,5 M (≈ 50 mL). Una solución amarilla comenzará a salir de la columna. Aumentar la concentración de HCl 2 m y continuar liberador hasta que el efluente quede descolorido o un verde muy pálido-amarillo. Será necesario para este proceso un volumen total de 150-200 mL.
    8. Aumentar la concentración de ácido clorhídrico a 2.5 M (20-50 mL). Recoger el eluido como fracciones en tubos de ensayo. Aumentar a 3 M de HCl. El producto se procederá a la elución de la columna como una solución verde marrón. Una fracción de rojo marrón también puede comenzar a venir de la columna. Ya que estas fracciones son las impurezas oxidadas rutenio rojo, no piscina con las fracciones marrón verde.
  4. Caracterización y verificación de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. probarlas de las fracciones de Paso 1.3.8. por espectroscopía UV-vis. Para realizar esta tarea, añada 100 μl de una fracción dada en 2 mL de 3 M de NH3 y análisis por espectroscopía UV-vis. Fracciones que contiene el producto puro tendrá una banda de gran absorbancia a 360 nm y una menos intensa absorbancia a 600 nm. Absorbancia a 480 o 533 nm es indicativa de rojo oxidado rutenio e impurezas de rutenio rojo, respectivamente.
    2. Fracciones con puro producto de la piscina y evaporar la solución hasta la sequedad por evaporación rotatoria. El producto estará aislado como un sólido verde marrón. Los rendimientos son típicamente del orden de 5-15 mg (10-20% de rendimiento). Monocristales, convenientes para la difracción de rayos x, pueden obtenerse por la difusión de vapor de etanol en soluciones acuosas de los compuestos.
    3. Para verificar pureza, analizar el compuesto por espectroscopía UV-vis en solución salina con tampón fosfato de pH 7,4 (PBS). Pureza puede evaluarse tomando el cociente de la intensidad de los 360 nm y 600 nm picos. Esta relación es de 31, para un compuesto puro. Compuestos impuros, el cociente será menor.
    4. Análisis de la muestra en el estado sólido por espectroscopia IR. Bandas de diagnóstico están en 3234 cm -1 cm 3151 -1, 1618 cm -1, cm 1313 -1 y 815 cm -1. Se observan bandas de impureza común en 1762 cm -1 y 1400 cm -1, característico de NH 4 cl. rutenio rojo puede ser identificado por bandas en 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 y 800 cm -1.
  5. Evaluación de la inhibición de la absorción de calcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescencia
    PRECAUCIÓN! Los siguientes procedimientos utilizan células de mamíferos. Trabajo debe ser llevado a cabo en campanas de flujo laminar adecuadas que están certificadas para la seguridad biológica de nivel 2 (BSL2) investigación.
    ​ Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 hará referencia a como [Ru] en esta sección
    1. hacer tamponado que contiene glucosa solución salina (BGSS) como los medios de ensayo. BGSS es una solución que comprende 110 mM KCl 1 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), succinato de sodio de 5 mM, 30 μm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-ácido tetraacético (EGTA). Combine todo, excepto el EGTA, ajustar el pH a 7,4. Añade EGTA y vuelva a ajustar pH a 7.4. Para 50 mL de medio de ensayo añada 0,5 mL de glucosa 1 mg/mL.
    2. Cultura HeLa células en cajas Petri de 2 500 cm en Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) con 10% suero fetal bovino (FBS) en una incubadora humidificada con 5% CO 2 en 37 ° C. amplificar las células HeLa crecen en una placa de Petri de 100 mm por la siembra ellos en un plato de petri 500 cm 2. El volumen total de los medios de comunicación en el plato grande es de 115 mL. Cada plato grande producirá células de 18 millones aproximadamente, suficiente para dos experimentos de espectroscopia de fluorescencia.
      1. Crecer las células hasta llegar a 90-95% confluency. Retire los medios de comunicación y lavar las células con PBS pH 7,4 de 15 mL. Añadir 15 mL de ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) en PBS e incubar durante 10 minutos separar las células. Transferir las células a 14 mL fondo Halcón tubos redondos
    3. contar las células con un microscopio invertido trypan azul y un hemocitómetro y calcular el número total de células y el volumen de los medios necesarios para llegar a 7,5 millones de células por volumen de 1.8 mL del medio. Centrifugar las células 10 min a 5310 x g. decantar el sobrenadante y agregar el volumen calculado de BGSS. Resuspender suavemente las células.
      1. Para este ensayo, preparación de soluciones stock de digitonin de 40 mM en dimetil sulfóxido (DMSO), 1 mM de calcio verde-5N en H 2 O y 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] soluciones, preparadas en agua pura, puede variar de 1-3 mM.
        ​ Nota: calcio verde-5N es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad y minimizar la exposición a la luz.
    4. Configurar el Fluorímetro para excitar en 506 nm y leer la emisión en 532 nanómetro con el portacubetas controlado a 37 ° C. preparar una cubeta de acrílico con una barra de agitación o rueda, suspensión de la célula de 1,8 mL de 1.5.2 arriba, solución de digitonin μL 1.8, 3.6 y #181; L calcio verde-5N (solución) y 9 μl [Ru] (para solución stock de 1 mM, concentración final de 5 μm). Incube las células durante 15 min en el Fluorímetro.
      1. Lee los datos como la proporción de excitación/emisión en lugar de la absorción de materia prima. Esta práctica minimiza los errores asociados con las fluctuaciones en la intensidad de la fuente de luz.
      2. Llevar a cabo el primer análisis de la muestra en la ausencia de [Ru] para medir el efecto de la adición de CaCl 2 en la respuesta de las células.
      3. Análisis de comenzar en el Fluorímetro con los ajustes descritos en 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para establecer una línea base de emisión estable y luego agregar 1.8 μl de CaCl 2 (concentración final de 10 μm). La intensidad de emisión aumentará inmediatamente a la adición de CaCl 2 y luego se desvanecerán en el transcurso de minutos como los iones de calcio entrar en la mitocondria. Espere hasta que haya terminado el decaimiento (≈ 5 min). Añadir bolos de calcio adicional para determinar la respuesta de la absorción de calcio mitocondrial de las células no tratadas con [Ru].
    5. En otra cubeta que contiene 5 μm [Ru], repite el experimento tal como se describe arriba en 1.5.4.3. En presencia de inhibidor de la intensidad de emisión aumentan, pero no decae. Esta observación significa que bloquea la absorción de calcio mitocondrial.

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Representative Results

Este método describe una síntesis del calcio mitocondrial absorción inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un material de partida conocido de rutenio. [Ru (NH3)5Cl] CL2 se caracteriza por espectroscopia IR, con modos vibracionales en 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1y 798 cm-1 (figura 1). Una impureza menor en 2069 cm-1 se puede atribuir a Ru (NH3)5N2Cl3. La reacción de esta especie de Ru(III) con 1 M NH4OH ofrece [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. El progreso de esta reacción se evidencia por un cambio drástico en el color de la solución de amarillo a verde. La solución de reacción final es verde oscuro en color. Acidificación de la solución con HCl concentrado resulta en un cambio de color a marrón; un subproducto de esta neutralización es cloruro de amonio, que pueden contaminar el producto final si no es con cuidado. Purificación del compuesto procede mediante cromatografía de intercambio catiónico con resina de malla fuertemente ácido (forma de H+ ). La resina es equilibrada primero con 0,10 M de HCl, y la solución de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 se carga en la columna. El subproducto de cloruro de amonio elutes con los lavados de ácido clorhídrico de 1 M. Compuestos que contienen el rutenio elución en concentraciones más altas de ácido clorhídrico. Una serie de fracciones amarillo, que contienen [Ru (NH3)5Cl] Cl2 material de partida, vienen de la columna cuando la concentración de HCl 1,5 M. El producto deseado elutes entre 2.5-3.0 M HCl y las fracciones resultantes aparecen verde a verde marrón en color.

Antes de la puesta en común las fracciones del producto, se debe verificar su pureza. Porque el compuesto deseado exhibe cierta dependencia de pH en su espectro UV-vis, sugerimos agregar pequeñas alícuotas de las fracciones a altamente básica 3 M NH3 soluciones para asegurar que las características espectrales son los mismos para todas las fracciones. Fracciones puras sólo deben mostrar un pico intenso a 360 nm y un pico débil a 600 nm (figura 2). Picos de cerca de 480 y 533 nm indican la presencia de rutenio marrón y rojo, respectivamente y un pico significativo en 260 nm, con un hombro a 290 nm, significa la presencia de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 a partir de material (figura 3 ). Evaporación rotatoria de fracciones puros ofrece el compuesto deseado como un sólido verde marrón.

El compuesto aislado puede caracterizarse más por espectroscopia UV-vis e IR. El UV-vis espectro (figura 2) muestra los 360 nm y bandas de absorbancia de 600 nm como se describió anteriormente. El coeficiente de extinción para la banda de 600 nm es 850 M-1cm-1 y para la banda de 360 nm es 27000 M-1cm-1. La relación entre la intensidad de la 360 nm en comparación con la banda nm 600 debe ser 31 en PBS pH 7,4, y esta métrica puede ser utilizada con eficacia para medir la pureza del compuesto. El espectro IR debería aparecer como se muestra en la figura 4. Por ejemplo, la frecuencia de estiramiento O-Ru-Ru, es diagnóstica en 850 cm-1. El espectro IR se empleó para determinar el tramo de O-Ru-Ru y procurar que no cloruro de amonio estuvo presente en el producto final. Cloruro de amonio, una impureza común, tiene modos vibracionales en 1762 cm-1 (muy débil) y 1400 cm-1 (fuerte) que se puede fácilmente discernir desde el espectro de IR (figura 5). Rutenio rojo es un subproducto común de la reacción y puede identificarse en IR espectro con tramos en 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 y 800 cm-1, aunque algunos se solapan con el producto deseado ocurrirá) Figura 6).

La respuesta de la absorción de calcio en células HeLa digitonin-permeabilized se observa (figura 7). Los asteriscos indican la adición de un bolo de CaCl2 . En presencia de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 un aumento en la intensidad de emisión se observa en la adición de calcio, pero no abandono, debido a calcio mitocondrial la absorción es observada.

Figure 1
Figura 1 : Espectros infrarrojos de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Los espectros infrarrojo de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 con una muy pequeña [5N Ru (NH3)2] Cl3 impureza. La flecha roja indica la impureza en 2.069 cm-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Espectros UV-vis de representante para el material puro. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Espectros de absorción de cl5 UV-vis y cercano al infrarrojo (recuadro) en PBS pH 7,4. El coeficiente de extinción de la mayor absorbancia a 360 nm es de 27.000 M-1 cm-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Espectros UV-vis de la mezcla de reacción crudo. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis espectros de absorbancia de la mezcla de reacción crudo antes de purificación en PBS pH 7,4. Las flechas rojas indican las impurezas comunes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Representante espectros infrarrojo para puro material. Los espectros infrarrojo de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. El tramo de O-Ru-Ru es en 850 cm-1, los otros tramos de los osciladores de NH3 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5/>
Figura 5 : Espectros infrarrojo que contiene impurezas de NH4Cl. Los espectros infrarrojo de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 con impureza del cloruro de amonio. La flecha roja indica que el cloruro de amonio en 1.400 cm-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Espectros infrarrojos de rojo de rutenio comercial El espectro infrarrojo de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (trazo negro) y comercial rutenio rojo (trazo rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Resultados de la absorción de calcio representante. El aumento de la fluorescencia debido a la adición de calcio a un cóctel de células HeLa digitonin-permeabilized, calcio verde-5N y [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 en BGSS. El blanco contiene no [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 y disminución de la fluorescencia debido a la absorción de Ca2 + en la mitocondria se puede ver. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Captación mitocondrial de calcio inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 puede ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, una conocida rutenio a partir de material, como se describe en este procedimiento. La síntesis de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 se logra fácilmente con poca dificultad. Después de revolver RuCl3 por 16 h en la hidracina hidrato, el pH de la solución debe ajustarse a un valor de 2 con ácido clorhídrico. La caída del pH es fundamental para lograr el producto deseado. Si lo desea, puede modificarse esta síntesis forma [Ru (NH3)5Br] Br2 por refundir en HBr en lugar de HCl.

Hemos observado algunas estrategias para minimizar la formación de subproductos no deseados durante la síntesis del inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial. En particular, mantener el matraz tapón es fundamental para el éxito de esta reacción; Si el frasco es abierto, un número de otros subproductos, incluyendo rutenio rojo (RuRed), se forma en cantidades apreciables. Presumiblemente, el amoníaco gaseoso se pierde desde el recipiente de la reacción abierta y este evento compromisos formación del producto deseado. El tamaño del frasco y el volumen de amoníaco acuoso son también parámetros importantes que no serán modificados significativamente de aquellos descritos en este protocolo, como hemos notado que el rendimiento de esta reacción disminuye en frascos más pequeños. Este método no aumenta drásticamente el rendimiento de este compuesto en comparación con los otros dos métodos que previamente habíamos divulgado. Sin embargo, contienen menos pasos y dan lugar a menos formación de productos secundarios, tales como RuRed. El bajo rendimiento puede atribuirse a la presencia de una pequeña cantidad de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 como desconocido altamente cargada de impurezas que permanecen en la parte superior de la columna. Aunque no hemos explorado muchas de las condiciones de reacción adicional, es posible que mejoras pueden realizarse variando el tiempo de reacción y las concentraciones de reactivo, para obtener mayores rendimientos.

La purificación de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 es la más tediosa y difícil parte de este protocolo. Una columna bien embalada le ayudará grandemente a la separación; carga de la resina como la mezcla es un enfoque efectivo para empacar la columna. Cabe señalar que según aumenta la concentración de HCl en el transcurso de la elución de la columna, la resina se contraerá en tamaño. Para obtener con éxito material puro, la tasa a la cual se incrementa la concentración del ácido no debe apartarse del procedimiento indicado. El producto final será un sólido verde marrón; una solución básica será verde oscuro pero soluciones ácidas será marrón. Si se observa una solución de color rosado a rojo brillante, contaminaciones de rutenio rojo están presentes. La cantidad de RuRed puede ser determinada usando el coeficiente de extinción (62.000 M-1·cm-1 en 533 nm). Este proceso de purificación es relativamente general para columnas de resina de intercambio catiónico fuerte.

La inhibición de la absorción de calcio mitocondrial puede ser probada usando células HeLa permeabilized, el sensor fluorescente calcio calcio verde-5N y un espectrofluorímetro. 13 , 14 este ensayo requiere una gran cantidad de células y por lo tanto requieren la amplificación de la cultura en una muy grande 500 cm2 plato de Petri. Estos frascos de cultivo grande previenen problemas adicionales para minimizar la contaminación microbiana debido a que las superficies expuestas son muy grandes. Trabajo debe realizarse en un gabinete para mantener la esterilidad de flujo laminar. La respuesta de la fluorescencia de calcio verde-5N en células HeLa permeabilized es supervisada por espectroscopia de fluorescencia. La adición de un bolo externo de calcio a la cubeta desencadena un inmediato aumento en fluorescencia, derivados de los iones de calcio interactuando con el sensor. En el transcurso de varios minutos en ausencia de un inhibidor, la intensidad decae debido a la absorción de estos iones de calcio en la mitocondria, un orgánulo que no se puede acceder por el tinte. Cuando este ensayo se realiza en presencia de un inhibidor de la adición de un bolo de los iones del calcio da lugar a un aumento en la intensidad de emisión. El decaimiento debido a la absorción de calcio mitocondrial, sin embargo, no está presente, comprobar las propiedades inhibidoras de la absorción calcio mitocondrial de este compuesto. Este proceso puede utilizarse como pantalla general de inhibidores de la absorción de calcio. Además, este procedimiento puede aplicarse a otras células eucariotas de interés. Este análisis depende de la permeabilización de la membrana celular por lo tanto no proporciona información sobre la capacidad de absorción celular de un complejo.

En Resumen, este protocolo describe la síntesis y purificación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio novela. Este compuesto es de gran valor para el estudio de la biología de calcio mitocondrial y su papel en la fisiología de la célula mamífera. El ensayo relativamente simple para las pruebas de absorción de calcio mitocondrial es también de uso para la detección e investigación de nuevos inhibidores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Cornell. Este trabajo hizo uso del centro de Cornell para materiales comparten instalaciones de investigación, que son apoyadas a través del programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconoce apoyo de una beca de investigación postgrado en NSF (Grant DGE - 1650441) y el Dr. Dave Holowka para obtener ayuda con los experimentos de calcio. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

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Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio
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Nathan, S. R., Wilson, J. J.… More

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

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