Summary

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

Published: February 19, 2018
doi:

Summary

כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.

Abstract

מטרה מרכזית אחת של mechanobiology הוא להבין את השפעת הגומלין לחץ מכני על חלבונים ותאים. למרות חשיבותו, השפעת לחץ מכני על תפקוד התאים עדיין ממעטים להבין. בחלקו, הפער בידע קיים בגלל כמה כלים להפעיל בו זמנית דפורמציה של רקמות ותאים, הדמיה של פעילות תאית בבעלי חיים, הגבלת יעיל של תנועתיות אורגניזמים דגם אחרת מאד ניידים, כגון תולעים נימיות Caenorhabditis elegans. גודל קטן של C. elegans גורם להם קשר מצויין למכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה מחקר, פתרונות עבור קיבעון הוצגו באמצעות מכשירי microfluidic. אף על פי התקנים אלה לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, החיה הוא מלא עטוף polydimethylsiloxane (PDMS) וזכוכית, הגבלת גישה פיזית למשלוח בכוח מכני או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחרונה, יצרנו מכשיר המשלב גלילי עם עיצוב השמנה התואמת למיקרוסקופיה פלורסצנטיות ברזולוציה גבוהה. הערוץ הופעה מופרדת מן התעלה תולעת-השמנה באמצעות בדיאפרגמה PDMS דק. הסרעפת הוא הסיט לתוך הצד של תולעת על ידי הפעלת לחץ ממקור חיצוני. המכשיר ניתן לייעד נוירונים בודדים mechanosensitive. ההפעלה של הנוירונים הללו הוא עם תמונה ברזולוציה גבוהה עם מחוון בקידוד גנטית סידן. מאמר זה מציג את השיטה הכללית באמצעות C. elegans זנים לבטא מחוון הפעילות רגיש סידן (GCaMP6s) בנוירונים קולטן שלהם מגע (TRNs). השיטה, אולם אינה מוגבלת TRNs או חיישנים סידן כמו החללית, אלא ניתן להרחיב אחרים תאים רגישים מכנית או חיישנים.

Introduction

חוש המגע מספקת חיות עם מידע חיוני על הסביבה שלהם. בהתאם הכוח יישומית, מגע נתפשת גם לא מזיק, מענג או כואב. להרכב רקמות במהלך המגע הוא זוהה על ידי תאים מיוחדים mechanoreceptor מוטבע בתוך העור המבטאים קולטן חלבונים, לרוב תעלות יונים. השלבים קישור תפיסה כוח יון הפעלת הערוץ במהלך מגע וכאב אינם מובנים במלואם. אפילו פחות ידוע על מה רקמות העור מסננים דפורמציה מכאנית, אם mechanoreceptors לזהות שינויים זן או להדגיש1,2,3. פער זה בהבנה נובע, בין השאר, חוסר הכלים המתאימים כדי להחיל stimulations מכניים מדויקים על פני השטח של העור של חיים תוך התבוננות התגובות ברמה התאית. ואילו מיקרוסקופ כוח אטומי נעשה שימוש נרחב כדי להחיל ולמדוד את כוחות תאים מבודדים4,5 , גם כדי להפעיל את קולטני Piezo1 חי תאים6, ניסויים דומים באמצעות בעלי חיים, במיוחד C. elegans, היו לשמצה מאתגר עקב ניידות פנימית של הנושא. אתגר זה הוא מצויין באופן מסורתי באמצעות דבק cyanoacrylate וטרינרית או כירורגי-כיתה על מנת לשתק חיות בודדות על אגר רפידות1,7,8,9. גישה זו כבר פרודוקטיבי, אבל יש מגבלות הקשורות את המיומנות הדרושה הנייח על ידי הדבקת פני השטח אגר רך על ציות מכני. אסטרטגיה מיקרופלואידיקה הוא חלופה ללא תשלום זה מונע כמה סיבוכים הקשורים הדבקה.

תולעים נימיות C. elegans הוא אורגניזם מודל גנטי עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, בשל הגודל של החיה, היא מתאימה לטכנולוגיה מיקרופלואידיקה. מכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה ההצעה יתרון כי החיות אחרת מאד ניידים יכול לרסנם בעת ביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ואספקה של גירויים נוירו-modulatory רלוונטיים. עם העזרה של microfluidic טכנולוגיות, חיים בעלי חיים יכול להיות משותק ללא נזק10,11, המאפשר ניטור פעילות התנהגותית מעל12,שלמים13 ברזולוציה גבוהה הדמיה של פעילות. עצבית14,15,16,17. יתר על כן, נוירונים mechanoreceptor רבים הדרושים לצורך ניתן לאפיין את תחושת מגע וכאב שלהם פיזיולוגית1,8, מכני4,18,19, ומולקולרית ברמה20,21,22.

C. elegans החושים גירויים מכני עדין לקיר הגוף שלה באמצעות TRNs שש, שלוש מהן innervate של החיה הקדמי (ALML/R ו- AVM), מתוכם 3 innervate אחוריים של החיה (PLML/R ו PVM). מולקולות ערוץ יון הדרושים transducing כוח יישומית לתוך אות הביוכימי נחקרו בהרחבה ב- TRNs8. מאמר זה מציג על פלטפורמה microfluidic23 המאפשרת לחוקרים להחלת כוחות מכניים מדויקים על העור של קיבוע C. elegans העגולה, תוך כדי קריאת החוצה את דפורמציה של רקמות פנימיות שלה על ידי הדמיה אופטית. בנוסף מציג גירויים מכניים מוגדרים היטב, סידן שנחשולי יכול להיות מוקלט בנוירונים mechanoreceptor עם רזולוציה subcellular, בקורלציה עם תכונות מורפולוגיים האנטומי. המכשיר מורכב ערוץ השמנה מרכזית מחזיק חיה יחידה ומציג את עורה ליד שישה ערוצים הופעה פנאומטיים (איור 1 ואיור 2). שישה ערוצים ממוקמות לאורך הערוץ השמנה לספק גירויים מכניים לכל אחד TRNs 6 של התולעת. ערוצים אלה מופרדים מן החדר השמנה באמצעות דיאפרגמות PDMS דק, אשר יכול להיות מונע על ידי מקור לחץ אוויר חיצוני (איור 1). מכויל על סטיה ביחס ללחץ ואנו מספקים את המידות במאמר זה. כל מפעיל יכול להיות התייחס בנפרד, להשתמש בו כדי לעורר את mechanoreceptor של בחירה. הלחץ מועבר באמצעות משאבה ללחץ מונחה piezo אך ניתן להשתמש בכל מכשיר חלופי. אנחנו מראים כי פרוטוקול לחץ יכול לשמש כדי להפעיל TRNs ויוו ומדגימים התקני הפעלה מתאים אספקת גירויים מכניים למבוגרים C. elegans, טעינת למבוגרים בעלי חיים לתוך מכשירים, ביצוע הדמיית סידן ניסויים, וניתוח התוצאות. ייצור המכשיר מורכבת משני שלבים עיקריים: 1) פוטוליתוגרפיה לעשות תבנית מ סו-8; ו- 2) צורניים PDMS כדי להפוך התקן. למען תמציתיות ובהירות, הקוראים נקראים שפורסמו בעבר מאמרים ופרוטוקולים24,25 להוראות כיצד לייצר את תבניות וההתקנים.

Protocol

1. התקן פבריקציה נוספת הורד את הקובץ המצורף מסכת (1 קובץ משלים) וצור מסכה כרום באמצעות שירות מסחרי או מתקן ללא צורך במיקור חוץ. כמו בממד הקטן ביותר על המכשיר הוא 10 מיקרומטר (עובי ממברנה בוכנה), לוודא המסכה יש רזולוציה גבוהה מספיק, בתוך ± 0.25 מיקרומטר, לייצר בצורה אמינה את התכונות.<…

Representative Results

SU-8 ליתוגרפיה, שבב מליטהליתוגרפיה הפרוטוקול לבין דפוס PDMS בצע הליכים סטנדרטיים. פרטים ניתן למצוא במקומות אחרים23,24,25,26. PDMS צריך לקלף את וופל ללא בעיות לאחר ריפוי. אם התכונות SU-8 תעתיקו במהלך PDMS ?…

Discussion

פרוטוקול זה מדגים שיטה להעברת גירוי מכני מדויק על העור של התולעת העגולה לכוד בתוך שבב microfluidic. הוא נועד להקל על קליטת גירויים הפיזי למענה על שאלות ביולוגיות, שמטרתו לייעל את mechanobiology מחקר במעבדות ביולוגיות. שיטה זו מרחיבה מבחני הקודם כדי להעריך את הפונקציה של נוירונים mechanosensory C. elegans. טכ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים סנדרה ש Manosalvas-Kjono, פורים Ladpli, פארה ממון, דיוויה Gopisetty וורוניקה סנצ’ז עבור תמיכה עיצוב המכשיר, דור של חיות. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקים R01EB006745 (קרית אתא), R01NS092099 (כדי מדיניות החזרה), K99NS089942 (כדי ח”כ), F31NS100318 (כדי ALN) ומימון שהתקבלה מ אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות של האיחוד האירופי התוכנית ( להעניק הסכם מס 715243 ח”כ).

Materials

Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric – imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter

References

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
  20. Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Play Video

Cite This Article
Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).

View Video