Summary
Mechanobiology araştırma için yeni araçlar nasıl mekanik stres anlamak için gerekli biyokimyasal yollar etkinleştirir ve biyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Burada, hücresel tepkilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bir mikrosıvısal tuzak ile immobilize hayvanların seçici mekanik uyarılması için yeni bir yöntem vitrin.
Abstract
Mechanobiology bir merkezi amacı karşılıklı etkisi protein ve hücreleri mekanik stres anlamaktır. Önemini rağmen hücresel fonksiyonu mekanik stres etkisi hala kötü anlaşılmaktadır. Birkaç araçlarını etkinleştirme nedeniyle aynı anda deformasyon doku ve hücreleri, Canlı hayvanlarda hücresel hareketlilik görüntüleme ve verimli sınırlama-in hareketliliği Yuvarlak solucanlar gibi aksi takdirde son derece mobil model organizmalarda kısmen, bu bilgi boşluğu bulunmaktadır Caenorhabditis elegans. C. elegans küçük boyutunu onları havacilik dayalı araştırma aygıtlar için mükemmel bir maç yapar ve mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak immobilizasyon için çözümler sunulmuştur. Bu aygıtlar yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin rağmen hayvan tamamen polydimethylsiloxane (PDMS) ve cam, mekanik güç ya da Elektrofizyolojik kayıtlar teslim etmek için fiziksel erişimi sınırlama kaplı olduğu. Son zamanlarda, yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile uyumlu bir bindirme tasarım ile pnömatik aktüatörler entegre bir cihaz geliştirdi. Çalıştırma kanal solucan-bindirme kanaldan ince PDMS diyafram tarafından ayrılır. Bu diyafram içine belgili tanımlık yan-in bir kurt bir dış kaynaktan basınç uygulayarak uğramaktadır. Cihazın bireysel mechanosensitive nöronlar hedefleyebilirsiniz. Bu nöronların harekete geçirmek, yansıma genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeler ile yüksek çözünürlüklü. Bu makalede C. elegans suşları kalsiyum duyarlı etkinlik göstergesi (GCaMP6s) onların dokunmatik reseptör nöronlarda (TRNs) ifade kullanarak genel yöntem sunuyor. Yöntemi bir sonda TRNs ne de kalsiyum sensörler sınırlı değildir, ancak diğer mekanik olarak duyarlı hücreleri veya sensörler için genişletilebilir.
Introduction
Dokunma duygusu hayvanlar çevreleri hakkında çok önemli bilgiler sağlar. Bağlı olarak uygulanan kuvvet, dokunmatik zararsız, zevk veya acı olarak algılanmaktadır. Dokunmatik sırasında doku deformasyon reseptör proteinler, en sık iyon kanalları hızlı deride katıştırılmış özel mekanoreseptör hücreleri tarafından algılanır. Kuvvet algı iyon kanal etkinleştirme dokunma ve ağrı sırasında bağlanma adımları tam olarak anlaşılmış değildir. Daha az nasıl deri dokusu mekanik deformasyon ve gerginlik içinde mechanoreceptors değişiklikleri olup filtreler veya1,2,3stres bilinir. Bu boşluğu anlamada, kısmen, hassas mekanik elektrodlar kesilmediğini gözleyerek yanıt-e doğru hücresel düzeyde yaşayan hayvan cilt yüzeyine uygulamak için uygun araçlar eksikliği kaynaklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskobu kapsamlı uygulamak ve izole hücreler4,5 Kuvvetleri ölçmek için ve aynı zamanda yaşam Piezo1 reseptörleri etkinleştirmek için kullanılmıştır, ancak6, benzer deneyler yaşayan hayvanlar, özellikle kullanarak hücreler C. elegans, konu içsel hareketlilik nedeniyle Rootkitler zor olmuştur. Bu meydan okuma geleneksel olarak bireysel hayvanlar agar yastıkları1,7,8,9üzerinde hareketsiz için veteriner - veya cerrahi-sınıf cyanoacrylate tutkal kullanarak atlatılabilirdi. Bu yaklaşım üretken beri ama yapıştırma ve mekanik uygunluk yumuşak agar yüzeyinde immobilizasyon için gerekli beceri ile ilgili sınırlamalar vardır. Bazı yapıştırma için bağlı komplikasyonları önler bir ücretsiz alternatif havacilik stratejisidir.
Yuvarlak solucanlar C. elegans genetik model organizma bu hayvanın büyüklüğü nedeniyle, havacilik teknoloji için iyi bir seçimdir tamamen eşlenen bir sinir sistemi var. Havacilik tabanlı cihazlar teklif aksi takdirde son derece mobil hayvan yüksek çözünürlüklü görüntü ve ilgili nöro-düzenleyici uyaranların teslimat yaparken ölçülü avantaj. Mikrosıvısal yardımıyla teknolojileri, hayvanlar yaşayan bütün ömrünü12,13 üzerinde davranış faaliyet izleme ve yüksek çözünürlüklü etkinleştirme zararı10,11olmadan, etkisiz hale nöronal aktivite14,15,16,17ve görüntüleme. , Daha fazla dokunma ve ağrı hissi kendi fizyolojik1,8, mekanik4,18,19, karakterize edilebilir için gerekli birçok mekanoreseptör nöronlar ve moleküler seviye20,21,22.
C. elegans altı TRNs, üç olan hayvanın anterior (ALML/R ve AVM) innervate ve üç olan hayvanın arka (PLML/R ve PVM) innervate kullanarak kendi vücut duvar yumuşak mekanik uyaranlara hissediyor. Biyokimyasal bir sinyal uygulanan bir yürürlüğe transducing için gerekli iyon kanal molekülleri onun TRNs8' kapsamlı bir şekilde inceledik. Bu makalede araştırmacılar hassas mekanik kuvvetleri bir immobilize C. elegans kaplamasına uygulamak sağlayan bir mikrosıvısal platformu23 sunar kendi iç dokulara deformasyon tarafından optik görüntüleme okunurken yuvarlak kurt,. İyi tanımlanmış mekanik uyaranlara sunan ek olarak, kalsiyum geçişler mekanoreseptör nöron hücre altı çözünürlük ile kaydedilen ve morfolojik ve anatomik özellikleri ile ilişkili. Cihazın kendi cilt altı pnömatik çalıştırma kanalları (Resim 1 ve Şekil 2) yanındaki sunar ve tek bir hayvan tutan bir merkezi bindirme kanalı oluşur. Altı kanala mekanik uyaranlara her solucan'ın altı TRNs sunmak için bindirme kanalı boyunca konumlandırılır. Bu kanallar bir dış hava basınç kaynağı (şekil 1) tarafından yürütülen ince PDMS Diaframlar, bindirme odasından ayrılır. Saptırma basınç ile ilgili olarak kalibre edilmiş ve bu makaledeki ölçümler sağlamak. Her aktüatör ayrı ayrı ele alınması ve seçim mekanoreseptör uyarmak için kullanılır. Basınç bir piezo-driven basınç pompası kullanılarak teslim edilen ancak başka herhangi bir aygıtı kullanılabilir. Biz basınç Protokolü TRNs vivo içinde harekete geçirmek ve çalışma cihazları mekanik uyaranlara için yetişkin C. elegansteslim, Yetişkin hayvanların içine aygıt yükleme, kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için uygun göstermek için kullanılabilir göstermek deneyleri ve sonuçlarını çözümleme. Cihaz imalat iki ana adımlardan oluşur: 1) SU-8; bir kalıp yapmak fotolitografi ve 2) bir cihaz yapmak için PDMS kalıp. Kısalık ve netlik uğruna, okuyucular için daha önce yayımlanmış makaleleri ve protokoller24,25 kalıpları ve cihazlar üretmek konusunda yönergeler için denir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cihaz imalat
- (Ek dosya 1) ekli maskesi dosyası indirmek ve bir ticari hizmet veya şirket içi tesis kullanarak bir krom maskesi oluşturmak. Cihazın üzerindeki en küçük boyutu 10 µm (aktüatör membran kalınlığı) olduğu için maske güvenilir özellikleri üretmek için yeterince yüksek çözünürlük, ± 0.25 µm içinde olduğundan emin olun.
-
Standart SU-8 fotolitografi yöntemleri uygulayın (örneğin, başvuran24,25,26) kalıp PDMS cihazların; sonraki üretim için imal etmek Aşağıda listelenen adımları bir özetini.
Not: Işığa duyarlı bir malzeme, hangi Glossar ultraviyole ışığa maruz kalma üzerine SU-8'dir (en fazla emme ~ 365 nm). Üreticinin yönergelerini sonrası pişirin ve yumuşak-fırında, pozlama (UV), işleme parametrelerini belirlemek için bir başlangıç noktası olarak kullanın.- SU-8 2002 bir silikon gofret spin-ceket yatırıp küçük yapıların daha iyi yapışma için 2 µm yaklaşık kalınlığı için. Yumuşak-pişir 95 ° C'de 1 dk sıcak tabakta, biraz aşırı (UV) tüm yüzey açığa (~ 100 mJ/cm2) ve 95 ° C'de 2 min için sıcak tabakta sonrası fırında
- Spin-ceket aygıt özellikleri tanımlamak için 47-µm kalın bir tabaka SU-8 2050. 15 s (130 d/d/s hızlanma) ve 90 için sonra 2000 rpm 500 RPM dönüş hızı kullanmak s (260 d/d/s hızlanma). Gerekirse yineleyin ve fotorezist uygun kalınlıkta olsun için dönüş hızı ayarlayın.
- Bir sıcak tabakta ve sonra 95 ° C'de 7 dk. 65 ° C'de 2 min için yumuşak oyuncak Üretici yönergelerine uygun fotorezist maruz (~ 160 mJ/cm2) düz yan duvarlar emin olmak için bir krom maskesi ve uzun-pass filtre kullanarak.
- Gofret kaldırmak ve sonrası bir sıcak tabakta ve 95 ° C'de 7 dk 1 dk 65 ° c için fırında
- Yıkamaya SU-8 geliştirici ile dağıtılması ve 2-propanol ile temiz.
- Gofret üzerinde bir aspiratör 30 dk (Sabit-pişir) fotorezist özellikleri stabilize etmek için 180 ° C'de pişirin.
-
Standart yineleme yöntemleri27kalıp kullanarak SU-8 modeli PDMS yinelemeden olun.
- SU-8 kalıp PDMS adezyon (silanization) azaltmak için trichloromethylsilane (TCMS) Buhar ile tedavi.
Uyarı: Toksik ve su-reaktif TCMS.- Desenli gofret su veya suda çözünen reaktifler arındırılmış bir duman başlıklı bir Sırça fanus vakum desiccator içinde bir gofret raf yerleştirin.
- Başlık altında bir damlalık cam yemek için TCMS 1 damla uygulamak ve desiccator içinde yerleştirmek için kullanın.
- Desiccator kapağını kapatın ve en az 20 dk için gofret kat TCMS buharı sağlar.
- Delik ve desiccator açın. Bell kavanoz kapağı açın ve plastik cımbız kullanarak gofret çıkarın. Bir Petri kabına veya alüminyum folyo tekne PDMS yineleme yoğurmak için yerleştirin. TCMS kaplı malzemelerin uygun tehlikeli atık bertaraf.
- Mix PDMS (10:1 oranı) 40 g temel polimer ve 4 g PDMS kür Aracısı kullanarak.
- SU-8 kalıp karışımı dökün ve en az 30 dk içinde bir vakum odası için karışım degas.
- En az 6 h 70 ° c fırında tedavisi.
- SU-8 kalıp PDMS adezyon (silanization) azaltmak için trichloromethylsilane (TCMS) Buhar ile tedavi.
- PDMS gofret yatay düz bir yüzeye ayarlayarak ve dikkatle PDMS soyulmuştu gofret kaldırın. Kalıp zarar verebilir gibi gofret bu adım sırasında viraj değil yukarı doğru.
Not: SU-8 eksik yapışma gofret veya eksik silanization için bu adımı sırasında SU-8 yapıların yıkım neden olabilir. - Öyle ki bir 24 mm x 60 mm coverslip cihazlar uyacaktır PDMS cihazları bireysel fiş içine kesti.
- 1-mm biyopsi yumruk kullanarak, delik giriş, iki çıkışları ve altı aktüatörler bir 1-mm biyopsi yumruk kullanarak yapmak. Cihazın kenarları etrafında 2 mm çapında daireler için amaç.
-
Cam kapak paket fişi Bond PDMS cips.
- Her iki yüzeyleri 80 W oksijen plazma için ortaya çıkarmak (30 s).
- Yavaşça maruz PDMS yüzey açıkorur bir mühür için kapak fişinin maruz yüzeyine yerleştirin.
- Sıcak bir tabak (100 ° C, 10 dk) üstünde belgili tanımlık aygıt tavlamak.
Not: Yetersiz bağ sızıntı nedeniyle cihazın yetersizliğine yol açabilir.
2. mikroskop hazırlanması
Not: Transjenik hayvanlar: kalsiyum göstergesi GCaMP6s28 veya faiz (örneğin, TRN); neuron(s) diğer genetik olarak kodlanmış etkinlik soruşturma gibi hızlı küçük lateral ve mekanik stimülasyon nedeniyle ortaya çıkan odak hareket eserler için düzeltmek için farklı bir dalga boyu, yayan bir etkinlik bağımsız floresan protein co hızlı. Otomatik analiz yazılımı izler ve hareket kaynaklı değişiklikleri için etkinlik sonda şiddeti dengeler. Solucan suşları GN69223 (ya da AQ323629) GCaMP6s (veya GCaMP6m) hızlı ve kalsiyum bağımsız tagRFP mec-7 promotor kontrol altında. Ayrıca, GN692 TRNs GCaMP6s Floresan23uyarma sırasında etkinleştirmesi nedeniyle mavi ışık sensörü lite-130 engeller mutasyon lite-1(ce314)içerir.
-
Bir mikroskop sistemi GCaMP ve RFP eşzamanlı uyarma için ayarlarsınız.
- Sürekli bir ışık kaynağı ve ikili şerit uyarma filtrenin sadece mavi ve sarı ışık iletir veya sadece dalgaboyu eşzamanlı mavi gibi tanımlanmış bir bant genişliği yayar bir ışık kaynağı kullanın (0.77 mW) ve sarı (1,21 mW) LED uyarma kaynakları için Kalsiyum-bağımlı ve bağımsız Floresans eşzamanlı uyarma anılan sıraya göre.
- Bir dijital fotoğraf makinesi mikroskobu görüntülerin kayıt etkinleştirmek için kullanın.
Not: Çoğu kamera resim alma için bir yazılım ile birlikte gelir. Alternatif olarak, kamera ve potansiyel olarak da mikroskobu sisteminin diğer bölümleri denetlemek için kullanılan serbestçe kullanılabilir yazılım vardır. - Kamera doygunluk kaçınmak için floresan yoğunluğu göre uyarma yoğunluğunu ayarlayın.
-
Bir floresan kübü uyarma kaynak seçimine bağlı olarak bir uyarma filtre ile donatılmış olması gerekiyor.
Not: 488-nm GFP ve 580 nm mCherry uyarma filtre burada kullanıldı.- Mavi ve sarı ışık yansıtan ve yeşil ve kırmızı ışık gönderme için küp bir ışın ayırıcı ekleyin.
- 10 X amaç ve yüksek büyütme objektif mikroskopla donatmak (örneğin, 63 X / 1.32 NA petrol) uyarma örnek ışık odaklanmak için.
- Bir ışın ayırıcı GCaMP ve kalsiyum bağımsız sinyal aynı anda kayıt için kamera önünde bağlayın. Işın bölücü bir dikroik ayna olduğundan emin olun (uzun geçmek, kesme, 570 nm) bir emisyon filtre kullanarak için yeşil yeşil ve kırmızı ışık ayırmak için (525 merkezli passband nm 50 nm genişliği ile) ve kırmızı ışık için bir emisyon filtre (632 merkezli passband 60 nm nm genişlik).
- Proje üst yarısı üzerine yeşil ve kırmızı Floresans (yeşil) ve alt yarısı (kırmızı), sırasıyla fotoğraf makinesinin chip (bkz. şekil 3). Bu yönlendirme sağlanan analiz yazılımı için bir önkoşuldur.
3. hayvan hazırlık
- Yaş senkronize genç yetişkin veya yetişkinlere yönelik ilk günden C. elegans, Porta-de-la-Riva vd tarafından daha önce açıklandığı şekilde hazırlayın 31
- Mikrosıvısal çip hazırlamak.
- Yerçekimi akışı rezervuar bağlanmak (~ çip seviyesinden 60 cm) içeren filtre (0.2 µm polyethersulfone şırınga filtre) M9 arabelleğe çipin bir çıkış. Diğer çıkış iki çıkış atık konteyner, Yani, bir filtre şişesi bir prize bağlayın. Diğer çıkış atık kapsayıcı Peristaltik pompa için bağlayın.
Not: tüm bağlantılar için polietilen (PE) boru kullanmak ve metal tüp bağlantı parçaları için çip PE boru bağlanın. Bu şekilde tüm atık çözümler çip dışarı fışkırma ve atık kapta toplanır. Çıkış kanalları aracılığıyla akış solucan daha sonra yakalama işlemi sırasında rahat tutacak bir nazik emiş oluşturur. - Hazırlamak oluşan arasında bağlantı yapan operatördür 50-mm uzun PE boru (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) ile her iki ucundaki metal boru (ölçüm boyutu 23TW, 0.635-mm OD). Basın-fit Bunlar arasında bağlantı yapan operatördür her altı çalıştırma parmak ve solucan giriş içine (bkz. şekil 1). Tekrarlanan kaldırma PDMS delikleri giymek yol açar gibi bu interconnectors çipi içinde bırakın.
- Yerçekimi akışı rezervuar bağlanmak (~ çip seviyesinden 60 cm) içeren filtre (0.2 µm polyethersulfone şırınga filtre) M9 arabelleğe çipin bir çıkış. Diğer çıkış iki çıkış atık konteyner, Yani, bir filtre şişesi bir prize bağlayın. Diğer çıkış atık kapsayıcı Peristaltik pompa için bağlayın.
- Mikroskop çipte bir yer. Çekme 2 – 5 solucanlar içine bir damla (0.2 µm şırınga filtre) M9 arabellek filtre ve 1 mL şırınga onları pistonu hafifçe çekerek 1 mL şırınga bağlı bir PE boru (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) içine çekmek için kullanın. Hayvanlara şırınga değil de PE tüp içinde tutun.
Not: Çok fazla solucan veya filtre uygulanmamış çip çözümlerinde tıkanma için yol açabilir. - PE boru şırınganın solucan giriş (Resim 1 ve Şekil 2), ara bağlantı için belgili tanımlık küçük parça bağlayın. Kapak açarak yerçekimi akışını etkinleştirmek ve Peristaltik pompa başlar. Sonra yavaşça hayvanlar kesilmediğini gözleyerek kanal aydınlık alan modunda 10 X lens ile mikroskop altında bindirme kanal taşımak için şırınga pistonu şırınganın tuşuna basın.
Not: Bazen görünen hava kabarcıkları bir sorun teşkil değil; Bunlar genellikle otomatik olarak çıkış taşınır. Çeşitli hayvanlar 'bekleme odasında Park' ve sırayla kullanılır.- Hayvan yakalama Kanal yükleme sonra (Ayrıca bkz: Şekil 2), hafifçe iterek veya hayvan başkanı kanal ön konik şeklinde konumlandırmak için dalgıç şırınganın çekerek konumunu ayarlayın.
- Solucan (yetişkin gün 1) yongasında mahsur kalmak için uygun büyüklükte olduğundan emin olun.
- Solucan (kuyruk ucu hariç) vücudun yakınındaki burun kanalından tüm kesit doldurmak değildir veya solucan şırınga pistonu hareket ettirmeden kanal ekseni boyunca giderse , bindirme kanaldan kaybolana kadar şırınga pistonu basarak solucanı silmek ve yeni bir yük (bkz. Adım 3.8).
- Floresan mikroskop ve daha yüksek büyütme objektif (40 X veya daha yüksek) moduna geçirin ve faiz nöron neurite birinin aktüatörler diyafram yalan konusunda kontrol edin. Eğer değilse, çekme veya itme pistonu hayvan konumunu ayarlamak. Bu yardımcı olmazsa, solucanı ve yeni bir yük.
- Faiz nöron hücre gövdesi üzerinde odaklanmak ve ara bağlantı nöron hücre gövdesi ön tarafındaki en yakın Aktüatörün PE boru kullanarak bir programlanabilir basınç pompası bağlayın.
- Deneme aktüatör ve nöron arasındaki uzaklık ölçme gerektiriyorsa, görüş alanı her iki görüş alanı ve channelwall görüntünün alt ve üst kenarına paralel değiştirin.
- Programlanabilir basınç pompa kullanarak bir basınç Protokolü tanımlar.
Not: Bu iletişim kuralı için istenen deney ayarlanabilir.- Bir süre resim silsilesi (normalleştirme için gerekli), en az 50 adet fotoğraf karşılık gelen 0 kPa sabit bir basınç ile başlayın. 10 Hz bir görüntüleme hızı için bu 5 s. Ekle istenen uyarıcı dalga biçimi ve basınç karşılık gelen ve uyarıcı bir ikinci adım olarak tanımlamak.
Not: bir büyük nöronal yanıt üretir gibi TRNs uyarıcı için bir adım (Yani, 275 kPa) üst üste bir sinüs dalga formu (Yani, 75 kPa, 10 Hz) tavsiye edilir. - Deneme ek uyaranlara gerektiriyorsa, bir dönem en az 10 dahil et 0 kPa uyaranlara arasında sürekli bir baskı s. Basınç pompası değiştirmeden önce enstrüman basınç solucan gerçek deneme önce yanlışlıkla uyarılması önlemek için sabit 0 kPa olduğundan emin olun.
- Bir süre resim silsilesi (normalleştirme için gerekli), en az 50 adet fotoğraf karşılık gelen 0 kPa sabit bir basınç ile başlayın. 10 Hz bir görüntüleme hızı için bu 5 s. Ekle istenen uyarıcı dalga biçimi ve basınç karşılık gelen ve uyarıcı bir ikinci adım olarak tanımlamak.
- Görüntüleme ve baskı iletişim kuralı çalıştırın.
- Görüntü alma yazılım kamera, görüntü sırası 10 Hz değerinde bir çekim hızı 100 MS basınç protokol süresince kullanarak ayarlayın. Öyle ki maksimal Floresans artış kamera emdirmek değil uyarma yoğunluğunu ayarlayın. Görüntüleri normalleştirme için ilk uyarıcı önce en az 50 adet fotoğraf ile *.tif dosyası olarak kaydedin.
- Görüntü alma yazılım ve yazılım programlanabilir pompa basınç protokolünde görüntüleme Protokolü başlatın. Kayıt sırasında faiz nöron 10 x 10 piksel bir alanda parlak bir noktadır, sıralı Albümdeki 10 piksel daha öteye taşımaz ve görüş alanı kayıt sırasında kalır gözlemlemek.
Not: Eğer bu yapılmazsa, analiz yazılımı başarısız olur. Parlak noktalar (yani autofluorescence) nöron çevresinde zor nöronların kayıtları temiz olun. Bu sorunu gidermek için tuzak solucanı ve yeni bir solucan çipin yükleyin. Solucan çok fazla hareket ederse, yeni bir kayıt aynı solucanın deneyin ve solucan hareket gözlemlemek. Sorun devam ederse solucan mahsur kalmak için çok küçük olabilir. Bu durumda bu solucanı ve biraz daha büyük bir solucan tuzağın içine yükleyin. - Nöronlar en az 10 piksel tüm kayıt sırasında ayrılır sürece birden fazla nöronlar gelen sinyalleri istenirse, görüş alanı aynı anda kayıt.
- Habituation araştırmak için deneme hkr bir hayvan üzerinde gerçekleştirin.
- Bindirme kanaldan solucanı.
- Sonraki çalışmaları için solucan tutmak isterseniz, yerçekimi akışı ve atık konteyner doğru çip çıkışları kesin. Tüm solucan bindirme kanalı ile akış kanalına itilir kadar şırınga pistonu hafifçe bastırın.
- Bir damlacık çip dışında hayvan görünene kadar şırınga pistonu tuşuna basmaya devam edin. PE boru solucan giriş üzerinden de dahil olmak üzere şırınga kesmek, damlacık de solucan Aspire edin ve agar tabağa aktarmak için kullanın.
- Bu solucan tutmak için istenmiyorsa, tüm solucan bindirme kanalı ile akış kanalına itilir kadar şırınga pistonu basarak solucanı; yerçekimi akışı ve Peristaltik pompa emme hayvan çip dışarı ve atık konteyner içine taşıyacak.
4. analiz
- Download ve install belgili tanımlık yeni Fiji sürüm32.
- Download ve install belgili tanımlık en yeni java SDK yorum.
Not: gerekirse, silmek veya yeni yüklenen java derleyicisi kullanmak Fiji için Fiji klasörünün içindeki java klasörü yeniden adlandırın. -
Fiji yazılımını açın.
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açarak yeni yüklenen java derleyicisi çalışır durumda olup olmadığını kontrol edin ' eklentileri | Yardımcı programlar | ImageJ | Özellikler.
- Download belgili tanımlık pokinganalyzer*.java eğe (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, ek dosya 2' ye bakın).
- Sürükleyin ve bir eklenti olarak açmak için yazılım penceresinde .java dosya sürükleyip bırakamazsınız.
-
Derlemek ve koşmak belgili tanımlık pokinganalyzer*.java eğe Fiji'de Ctrl + R tuşlarına basarak; bir grafik kullanıcı arabirimi (alay Analyzer) (şekil 3) açılır.
- "Yardım" sekmesinde tıklatın ve yazılımı ve çözümlemeyi gerçekleştirmek nasıl gereksinimleri hakkında okuyun. Başlamak için belgili tanımlık çözümlemek için video dosyası konum belirleyin "Open video" sekmesini seçin: "Açık bir Video" düğmesini tıklatın, video konumuna gidin ve açın.
Not: Yazılımın açıldı bu sekme ile başlar. Başlatma sırasında açık değilse yeni bir analiz "Open video" sekmesinde tıklatın. Video a.tif biçiminde ise, programın dahili video açın ve ilk görüntü arabirimin alt kısmında görüntüleyin. Eğer görüntü çözümlenmesi gereken bir video değil, başka bir video açmak için "bir video açın" düğmesini tıklatın. - Devam etmek için "Define ROIs" sekmesini tıklatın. Bu sekmede, TRN konumunu tanımlayın. Not açılan video ilk görüntü bu sekmesini "Define TRN" düğmesini alt kısmında görüntülenir ve nöron GCaMP floresan-meli göstermek görüntülenen resmin üst kısmında tıklayın.
- İsteğe bağlı: aktüatör görüntünün üst yarısında görünür durumdaysa program otomatik olarak mesafe nöron ve eyleyici isterseniz izleyebilirsiniz. Bu, Denetim "Tanımla aktüatör?" -kutu, "Define aktüatör" butonuna tıklayın ve aktüatör görüntünün üst yarısında tıklayın.
- "Analiz" sekmesinde Tanımla resim alma hızı tıklatın. Alanına bir sayı girin veya yukarı veya aşağı düğmelerini sayısı azaltmak veya artırmak için. Eğer önceki sekmesinde "Tanımla aktüatör?" -kutusu seçiliyse, program mesafeyi hesaplayabilir bu yüzden kamera hücre boyutu, büyütme ve binning faktör tanımlayın.
- "Analiz Başlat" butonuna tıklayın.
Not: Program şimdi nöron tarafından üst yarısında görüntü sırayla onun Floresans izler (kalsiyum bağımlı) ve alt yarısında (kalsiyum bağımsız) görüntü sırası. Program kayıt düzlemde nöron hareket için hesap için 10 x 10 piksel nöron aşağıdaki resimdeki nöron konumunu bulmak için önceki görüntünün konumunu yüzölçümü araştıracağız. Floresan arka plan floresan (Fbg) düzeltme ve floresan ilk 50 görüntüleri (F0) tarafından bölen tarafından iki devrede hesaplar:
Nöron tarafından neden olduğu floresan yeşil, etkinlik bağlı kanal (FCa2 +) değişimler recoding vardır uçaktan hareket sonra floresan kırmızı, etkinlik bağımsız kanalını (F kullanarak düzeltildi corr) ve kalsiyum-bağımlı ön uyaran standart sapma (sdCa2 +) ve bağımsız floresan (sdcorr) tarafından:
- Program arabirimi alt bölümündeki durum çubuğunda ilerleme durumunu gösterir; durum çubuğu % 100 ulaştığında, "Sonuçlar" sekmesini tıklayın. Durum çubuğunun önce % 100 durursa, program program video çözümleyemedi nedenini belirten bir hata iletisi verecektir.
- Sinyal-gürültü oranı çok düşük ise, programı nöron belirleyemez; Sonraki kayıtları görüntüleme parametrelerini ayarlamak.
- Nöron görüş alanı kayıt sırasında terk ederse, program artık takip edemiyorum ve durur. Sonraki kayıtlar için kayıt başına görüş alanı ortasında nöron yerleştirmek.
- Bazı bölgelerde görüş alanı doygun otomatik analiz geçersiz sonuçlar üretecektir. Sonraki kayıtlar için Floresans sinyal fotoğraf makinesi sensörünün emdirmek değil emin olun.
- 'Sonuç' sekmesinde sonucu üst bölümünde görüntülenir. Bir sekmeyle ayrılmış *.txt sonuç tablosunun yanında tıkırtı "Kurtarmak sonuç tablo üzerinde" kaydedin.
Not: Bu tablo saniye ve normalleştirilmiş kalsiyum-bağımlı floresan (kalsiyum bağımsız Floresans tarafından düzeltildi) zamanında oluşur. Önceden tanımlanmış ise, aynı zamanda turnuvalar ve µm aktüatör arasındaki toplam mesafe içerir ve sonra floresan yoğunluğu temsilcisi sonuçlarını turnuvalar ve µm. kanal duvara dik eyleyici arasındaki uzaklığı artırın stimülasyon uzaklığı en yakın aktüatör için hücre vücudun karşı şekil 4' te çizilen. - Bir kayıt (10'dan fazla piksele ayrılmış) birden fazla nöronlar iseniz, "Define ROIs" sekmesinde yeniden tıklatın ve ikinci nöron 4.6.2 adımıyla geri dönün.
- "Yardım" sekmesinde tıklatın ve yazılımı ve çözümlemeyi gerçekleştirmek nasıl gereksinimleri hakkında okuyun. Başlamak için belgili tanımlık çözümlemek için video dosyası konum belirleyin "Open video" sekmesini seçin: "Açık bir Video" düğmesini tıklatın, video konumuna gidin ve açın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SU-8 litografi ve çip bağlanma
Litografi Protokolü ve PDMS kalıplama standart yordamları izleyin. Bilgi23,24,25,26başka bir yerde bulunabilir. PDMS sorunsuz gofret kür sonra akasındaki. Eğer PDMS peeling sırasında SU-8 özellikleri rip off, SU-8 yapışma katman veya silanization yetersizdi. Plazma aktivasyonu cam coverslips ve PDMS cips zayıf bağ kaçak yakalama kanal veya pnömatik aktüatörler sonuçlanan performansında azalma ve stimülasyon yokluğu neden olabilir yeterli değilse. Sıvı kaçağı belirgin çipi kullanılamaz ise.
Aktüatör performans
Tüm PDMS aktüatörler ve çip hava havzanın bağlayan boru düzgün Diyaframlar uygun Pnömatik çalıştırma sağlamak için korumalı getirilmelidir. Tekrarlanan ekleme ve kaldırma (tesisat) PE boru PDMS delik zarar ve Basınç azalmasına yol. Böyle basınç kaybı aktüatör saptırma ve immobilize hayvan cilde uygulanan kuvvet sınırlar. Diyafram saptırma istenilen basınç ile birkaç çalıştırma döngü gerçekleştirme ve teorik Öngörüler sayısal değerlerle karşılaştırarak boş bir çip (hiçbir hayvan mevcut) kullanılarak ölçülebilir. Membran ve solucan sınır görselleştirmek zor olduğundan diyafram saptırma bir hayvan yakalama kanaldaki huzurunda ölçüldü değil. Bu hassas kalibrasyon kapana kısılmış bir hayvanla birlikte değil olanaklı kılar. Tablo 1 baskı bir fonksiyonu olarak saptırma beklenen listeler. Elastik plaka teorisi kullanarak bu değerleri hesaplanır ve ayrıntıları-ebilmek bulunmak içinde Nekimken vd. 23 bu ilişki çip döküm ve çip ve cam ve çip basınç kaynaklarına bağlanma seals arasında bağ bütünlüğünü gibi diğer faktörler sırasında oluşturulan diyafram kalınlığı farklılıkları ile değişir bekleniyor. Değerleri 1 µm 450 kPa basınç, geçmeyen hafif varyasyon ile tekrarlanabilir buradaydı. Biz üç farklı uyarıcı profil için diyaframlar performansını nitelendirmiştir ve Nekimken ve arkbaktılar okuyucu bakın. 23 Özet, orada değerleri Tablo 1' den sapma göz önünde bulundurulacak çeşitli faktörler: 1) bir sızıntı tüp ya da boru konektörler 2) PDMS alternatif oranını temel polimer ve kür Aracısı neden olabilir, farklı bir esneklik vardır. ya da 3) PDMS yaşlı ve crosslink için zaman içinde devam etti. Bu nedenle, uygulama bir ay içinde hazırlanan cips kullanılması tavsiye edilir.
Bindirme performans
Solucanlar çip giriş yerleştirdikten sonra şırınga ile hafif bir basınç bir tek hayvan yakalama kanal içinde yer ve onun cilt altı aktüatörler (şekil 1) yanında mevcut. Önemlisi, hayvanın burun mutlaka arabellek göle çıkıntı gerekmez. Bunun yerine, neurite yakın aktüatör bitişik ve hücre gövdesi mikroskop görüş alanı içinde öyle ki hayvan konumlandırmak daha önemlidir. Öyle ki aktüatör faiz anterior hücre gövdesi yatıyor başarmak optimum nöronal harekete geçirmek için aktüatör ve hücre vücut arasındaki mesafe ayarlanmalıdır. Deneyim, nöron hücre gövdesi için posterior, hayır harekete geçirmek kalsiyum gerçekleşecek ve uyarılmış geçişler yok olacak. Uygun immobilizasyon genç yetişkin ya da bir - gün eski hünsa (iki yaş bunlar için en iyi duruma getirilmiş aygıtları aynı maskeyi mevcuttur) ile elde edilebilir. Daha küçük hayvanlar koleksiyonu rezervuar kayma veya yanal bindirme kanal içinde taşıyabilirsiniz. Çok büyük hayvanlar TRNs ve sonraki başarısızlık mekanoreseptör geçişler algılamak için erken harekete geçirmek içinde sonuçlanabilir kanal içine sıkılmış. Ayrıca, büyük solucan kaldırma zorlu, hayvanın ölümüne lider ve/veya cihaz tıkanma. Yanal ve dikey olarak taşımak ücretsiz bu yüzden bu tasarım ile PLM neuron genellikle tamamen, immobilize olamaz. PLM nöronlar başarıyla etkinleştirdiniz, kalsiyum geçişler bu nöronların kayıt kuyruk dikey hareket nedeniyle zor olsa da. Başka bir bindirme tasarım PLM33sayfasından kaydetmek için kullanılan.
Kalsiyum geçişler ve analiz görüntüleme
Bir kez yerde, hayvanlar altı aktüatörler birini kullanarak teşvik olabilir. Altı aktüatörler mekanik uyaranlara her altı TRNs sunmak için konumlandırılmış. 450-kPa içi basınç kaynağına bağlı bir mikrosıvısal akış denetleyicisi için hayvan 2-s 275 kPa adım, 2-s 0-275 kPa rampa ve 2-s buzz (75 kPa, 275 kPa adım ile üst üste 10 Hz sinüs) oluşan bir uyarıcı protokol sunmak için kullanılan , her 10-s bekleyen noktayla ayrılmış. Kalsiyum geçişler aynı anda kaydedilen görüntü sıralarını Fiji, bir özel olarak yazılmış yazılım mevcut bizim GitHub hesabı (yukarı bakın ve https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer) kullanarak analiz edildi. Biz sadece uyaranlara yukarıda 400 kPa basınç elde ise basınç rampalar ve basınç adımları TRNs aktif bulundu. Buna karşılık, tüm TRNs baskılar < 275 kPa bir sinüsoidal, 10-Hz Buzz'ı kullanmaya teşvik sağlam bir aktivasyon (şekil 4) gözlenmiştir. Genel olarak, TRNs daha iyi için kısa bir sinüsoidal uyarıcı cevap verdi (denilen 'buzz'), farklı yöntemleri1,9kullanarak önceki raporları ile anlaşma. Stimülasyon bir vızıltı ile yüksek verimli, önde gelen ~ harekete geçirmek tüm nöronlar ve deneme sürümleri içinde yüzde 90'ını test (şekil 4). Doğal olarak, ister uyarıcı dorsal veya ventral tarafta uygulandı ve bağımsız hücre beden ve neurite uyarıcı konumuna arasındaki mesafe olarak gözlenen güçlü hiçbir korelasyon vardı. Gelecekteki çalışmaları en büyük yanıt gecikme uyarıcı mesafe ile karşılıklı olarak ilişkilendirir olup olmadığını araştırmak gerekir.
Şekil 1: çip Tasarım bakış. (A)photomask ve elde edilen çip gösterildiği tüm bağlayıcılar ile şematik düzeni. Üç Merkezi bindirme kanal her tarafında altı çalıştırma parmak vardır. Ölçek çubuğu 3 mm. (B) = mikrosıvısal cihazın fotoğraf PDMS ile coverslip için gümrüklü ve tüp solucanı giriş ve solucan çıkışları bağlı. Diğer beş değil işgal ederken tek çalıştırma parmak basınç kaynağına bağlıdır. Başvuru23 yaratıcı ortak lisans altında rakam bölümlerini yeniden oluşturduktan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yakın çekim merkezi bindirme kanal ve yakalama yordamı. (A)şeması bindirme kanalı çizim. Solucan giriş tarafındaki sütunlar solucan yönlendirmek ve hayvanlar yüklenmesini kolaylaştırmak yardımcı olur. Çalıştırma parmak basınç altında ve ince bir diyafram girinti içine sıkışmış numune. Ölçek çubuğu 200 µm. (B) temsilcisi video çerçeve yatay kanal yakalanan bir solucanın =. Kanal altı pnömatik aktüatörler bırakmaya solucan gelir gibi tasarlanmıştır. Kuyruk sola, sağa başıdır. Bireysel dokunmatik reseptör nöronlar (TRNs) konumunu oklarla gösterilir ve bu şekilde etiketli. Ölçek çubuğu 100 µm (içinde tüm panelleri) =. Başvuru23 yaratıcı ortak lisans altında rakam bölümlerini yeniden oluşturduktan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Bu iletişim kuralı ile alınan kalsiyum izlerini analiz etmek için sağlanan Fiji eklenti bakış. Yazılım bir grafik kullanıcı arabirimi başlatır. Kullanıcı arabiriminin ilk sekme ("Open video") bir video açmak için düğmesini gösterir, yol ve açılan video ilk karesini görüntüler. İkinci sekme ("Define ROIs") bir dokunmatik reseptör nöron, "Define aktüatör" düğmesi ve "Define aktüatör" düğmesini etkinleştirmek için onay kutusunu tanımlamak için düğme içerir. Videonun ilk karesi alt bölümünde görüntülenir. Üçüncü sekmesini ("analiz") üst kısmında görüntü analizi için ayarlanabilir parametreler görüntülenir. Orta bölümü "Analiz Başlat" düğmesini gösterir. Alt kısmında bir ilerleme çubuğu geçerli analiz ilerlemesini gösterir. Dördüncü sekmesinde, "Sonuçlar", sonucu zaman içinde göreli floresan yoğunluğu bir grafik görüntülenir. Alt bölümünde sonuç tabloyu kaydetmek için bir düğme vardır. Beşinci sekmesi, "Yardım", gereksinimleri analiz yazılımı ve öğretim için nasıl kullanılacağını gösteren bir yardım metni görüntülenir. Şekil başvuru23 yaratıcı ortak lisans altında uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bireysel nöronlar mekanik uyaranlara yanıt. (A)temsilcisi Floresans test GCamP6s, etiketli AVM dokunmatik reseptör nöron önce ve sonra bir vızıltı ile mekanik uyarım. Ölçek çubuğu 10 µm. renkli ölçek = = 1500-3500 gri değerleri. (B) 275 kPa adım, 275 kPa rampası ve 275 kPa adım (buzz) ile üst üste bir sinüs (75 kPa; 10 Hz) temsil eden 2 s diyafram uyarma dahil olmak üzere uyarıcı protokolü. (C) normalleştirilmiş GCamP6s yoğunluğu izleme AVM uyarılmış vahşi türü hayvanlar b'de gösterildiği profil ile kaydedilen (± SEM gölgeli alan olarak demek) (yeşil, n = 14) ve hayvanları mutant mekanoreseptör Kanal alt birim mec-4 (mavi, n = 10), yani mekanik stres yanıt kolaylaştırmak için bilinir. Bu geçişler Uygulamalı mekanik uyaranlara tarafından indüklenir gösterir. Başvuru23 yaratıcı ortak lisans altında rakam bölümlerini yeniden oluşturduktan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Basınç (kPa) | Saptırma (µm) demek | SD | Beklenen saptırma (µm) |
| 0 | -0.01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0.77 | 0,26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3,13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0,79 | 3.03571 |
| 300 | 4,61 | 0,79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0.82 | 4.25 |
| 400 | 5.92 | 0.82 | 4.85714 |
| 450 | 6,43 | 0,75 | 5.46429 |
Tablo 1: 0 – 450'den değişen uygulanan baskılar için deneysel sapma değerleri beklenen kPa ve onların teorik tahminlerin. Veriler için bir adım uyarıcı elde. ± SD demek Bu veriler bir boş bindirme kanalı ile satın alınan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı bir mikrosıvısal çip sıkışmış bir yuvarlak kurt cilt için hassas mekanik stimülasyon teslim etmeye yönelik bir yöntem gösterir. Bu biyolojik sorulara cevap için fiziksel uyaranlara entegrasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır ve mechanobiology araştırma biyolojik Labs'de düzene amaçlamaktadır. Bu yöntem mechanosensory nöronlarda C. elegansişlevini değerlendirmek için önceki deneyleri genişletir. Önceki nicel ve yarı kantitatif teknikleri Kuvvetleri1,34 ve davranış35ölçülen ama nöronal aktivite yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile entegre etmek zordu. Böylece bu çip kullanımı mevcut uygulamalar genişletir ve performans için nazik dokunuş gerekli nöronlar uyarılması için optimize edilmiştir düşünüyoruz. Biz ulaşmak 5 µm, aktüatör saptırma neredeyse maksimal nöronal yanıt ulaşmak için yeterince güçlü bir uyarıcı olan en iyi duruma getirilmiş. Küçük farklılıklar ile biz bu tasarım vücut yüzey36innervate PVD nociceptors gibi sert dokunmatik reseptörleri uyarmak için kullanılan olabilir inanıyoruz.
Değişiklikler ve sorun giderme
Temiz SU-8 litografi için kullanılabilir yer yok, bir benchtop temiz kutusu veya SU-8 yumuşak-litografi istasyonları UV lambaları, programlanabilir Ocak ve spin coaters kullanılabilir. Temiz Oda Özellikleri kullanımını önler cihazlar da olabilir mikrosıvısal üretimi için düşük maliyetli bir alternatif26izledi.
Tasarımında biz tek bir hayvan bir mikrosıvısal kanaldaki immobilizes varolan bir yakalama tekniği hayata. Tuzak tasarım solucan36koku hissi eğitim için kullanılan bir aygıttan uyarlanmış, ama solucan hareketi bastırmak için tek uygun seçenek değil. Diğer stratejileri solucanlar mikrosıvısal aygıt içinde tutmak için rapor etmiştir: CO2, elektroforetik ve basınç immobilizasyon11,37,38 kullanılmıştır ve içine entegre olabilir bir değiştirilmiş Tasarım.
Basınç kontrol ve dış basınç kaynağından en çok 800 kPa teslim bir piyasada bulunan, piezoelektrik basınç pompa kullanarak çalıştırma kanalları için teslim. Basınçlı hava ~ 450 kPa sunma yeteneğine sahip olan bina, araştırma için pompa bağlı. Basınçlı hava kaynağı yok varsa, sıkıştırılmış, inert benzin (örneğin, N2) kullanılabilir. Bu büyük deformasyonlar üreten ve yüksek basınç teslim yararı olurdu ama da belgili tanımlık küçük parça için basınç denetleyiciye bağlamak için yüksek basınçlı bağlantı parçaları gerektirir. Küçük parça--dan yumuşak PDMS imalatı basınç kaynaklı deformasyonlar artırmak için alternatif bir yoludur.
Bu deneyde basınç pompa çıkış ile bir basın-fit 20 G metal-tüp bir PE eklenen oluşan yapışkan-Alerjik ve geri dönüşümlü interconnectors takılı PDMS çip 1 mm alıcı açıklıklar (örneğin, punch delik) aracılığıyla bağlı boru. Bunlar basıncı 700 kPa39en direnmeye göstermiştir. Bakım sırasında yinelenen ekleme, ancak alınan gerekir, delikleri çevresinde PDMS gözyaşı ve böylece performans sınırlamak veya çip kullanılamaz hale eğilimi gibi. Bu nedenle, metal boru bir kez eklenen ve sol çipin takılı kaldırma ve art arda ekleme.
Kritik adımlar
Stimülasyon cilt girintiler bir basınçlı çalıştırma kanal tarafından teslim edilir. Ortaya çıkan deformasyon ve mekanoreseptör nöron harekete geçirmek bir optik Floresans mikroskobu ve/veya confocal set-up üzerinde yüksek çözünürlüklü yansıması. Çeşitli faktörler GCaMP yanıt-e doğru tespiti engel olabilir. İlk olarak, C. elegans hızlı aydınlatma ile mavi sonra hücreleri etkinleştiren TRNs21,23, dahil olmak üzere birçok nöronlar bir mavi ışık reseptör30 (488 nm) ışık. Böylece, C. elegans görüntüleme genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensör GCaMP6s kullanarak kendi nöronlar aydınlatma, mekanik stimülasyon23tarafından aktive kalsiyum geçişler engellemeyecek üzerine devreye giriyor. 1 litre mutant arka planda çalışan ya da kırmızı kaymıştır kalsiyum etkinlik sensörleri kullanarak bu confound önler. Uyarıcı profil mechanoreceptors duyarlılığını eşleşmezse, ikinci, mekanik kaynaklı kalsiyum geçici algılanmayabilir. Biz harekete geçirmek için yüksek-genlik adımları ve rampalar algılamak başarısız oldu ama sonra stimülasyon orta dynamics uyaranlara (örneğin, 200 - kPa buzz) ile son derece yüksek sinyalleri uyarılmış. Son olarak, TRNs alıştırmak için yinelenen bir çekim gücü teslim ile kısa (< 60 s) interstimulus aralıkları. Böylece, nerede habituation okudu durumlarda dışında habituation en aza indirmek tasarım stimülasyon sıraları önemlidir.
Enkaz ve toz arabellekleri kolayca küçük bindirme kanal yapışmasına neden olabilir olarak tüm çözümleri, filtreleme öneririz. Ayrıca, Hayvan Yaş senkronize ve boyutu eşlemeli Chip'in tasarım gerekir; hayvanlar genç yetişkinler daha küçük aygıtı aracılığıyla slayt veya ölçülü için başarısız ve daha büyük hayvan yakalama kanalları giremezsiniz ve patlama ve/veya çip tıkanma tehlikede. Tıkanma, durumunda aşırı baskı uygulamaya solucan veya yerçekimi akışı giriş kanalları temiz olabilir, ama da uygun yetersizliği neden olabilir.
Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi çeşitli faktörler analiz programında bir hata neden olabilir. Kod derleme içinde karşılaşılan sorunlar, en son Fiji yazılımını çalıştıran ve bu Fiji en yeni Java derleyicisi kullanarak doğrulama önerilir. Program çalışıyor, ancak beklenmedik sonuçlar lütfen gerçek mekanik stimülasyon temel ve arka plan Floresans uygun bir tahmin sağlamak için yapılmadan önce kaydedilmiş filmi bir 50-çerçeve tampon vardır emin olun. Ayrıca, görüş alanı yeşil, etkinlik-bağımlı (GCaMP6s) ve kırmızı etkinlik bağımsız (tagRFP) kanal kabul kamera çip, alt ve üst yarısı sırasıyla projelendirilen için. Eğer optik ışın bölücü görüntüleri sensör sol ve sağ yarısı projeler, kayıt sırasında istediğiniz yönlendirmeyi elde etmek veya bir ön-işleme adımda görüntü yığınları döndürmek için 90 ° fotoğraf makinesini açın. Ayrıca, program tarafından onun Floresans nöron tanımlar ve sinyal-gürültü oranı veya kontrast çok düşük ise başarısız olur. Bu durumda, uyarma yoğunluğu ve/veya pozlama zaman değiştirmek sorunu çözüyor. Nöron hangi durumda nöron görüş alanı merkezinde yeni bir satın alma başlamadan önce yerleştirilmiş olmalıdır kayıt sırasında görüş alanı terk ederse program de durdurur.
Teknik sınırlamaları
Mevcut tasarım vücut duvar mekanoreseptör nöronlar PVD nociceptors ve TRNs ama değil solucan'ın baş bölgesi, FLP ve kül gibi innervate mechanoreceptors gibi uyarılması sağlar. Basınç sınırlıdır < 700 kPa. Daha büyük baskılar için farklı Tüp bağlantı parçaları istihdam gerekir. Bu yana 500 kPa basınç kaynağı burada geçmemişse, maksimum basınç uygulamak mümkün için 450 kPa sınırlıydı. Burada geçişler görülmektedir kalsiyum beklenen sinyal üst kenarlığını işaretleyin. Başka bir tasarım için bizim aktüatörler onların en boy oranını kısıtlamasıdır. Prensip olarak, ince zarlar daha büyük deformasyonlar sağlayacak ancak yapıları yüksek en-boy oranı ile güvenilir bir şekilde imal etmek zordur. Daha büyük deformasyonlar gerekli ise, daha geniş erişim düzenekleri veya her iki taraftan paralel deformasyonlar Cho vd tarafından sunulan gibi yararlı olabilir 29
Her ne kadar biz diyafram deformasyon izleyebilirsiniz, çalıştırma kanalları pnömatik uyarılması sırasında uygulanan Kuvvetleri ölçmek zordur. İlke sınırlama Aktüatörün temas bölgesinin iyi tanımlanmış değildir. Aktüatör kendisi ile saptırma artan iletişim RADIUS değiştirir çalıştırma sırasında elastik ve vinçlerin olduğundan budur. Akılda bu uyarılar ile 5 µm girinti (yaklaşık 300 kPa çalıştırma basınç boş bir çip) yaklaşık 3.8 µN solucan Petzold vd. , solucan sertlik tahminlere göre uygulamak için tahmin edilmektedir tahmin edebilirsiniz 34 nöronal geçerli kuvvet bağımlılığı beri solucanlar farklı stiffnesses1,34, ancak, uyarıcı şiddeti kuvvet yerine bir ölçüsü önerildiği gibi girinti izleme değiştirir.
Bu iletişim kuralı yayılması kullanıcıların havacilik C. elegans bir model sistem kullanarak mechanobiology araştırma için yararlanmak ve böylece alanında önemli bu konuda bilim ilerlemesini hızlandırmak yardımcı olacağını umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli teşekkür ediyoruz, Farah Memon, Divya Gopisetty ve Veronica Sanchez için aygıt tasarım ve mutant hayvanlar nesil destek. Bu araştırma desteklenmiştir NIH hibe tarafından R01EB006745 (BLP), R01NS092099 (için MBG), K99NS089942 (MK için) F31NS100318 (için ALN) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden alınan finansman programı () Sözleşme No 715243 vermek MK için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H.
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
