Summary
כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.
Abstract
מטרה מרכזית אחת של mechanobiology הוא להבין את השפעת הגומלין לחץ מכני על חלבונים ותאים. למרות חשיבותו, השפעת לחץ מכני על תפקוד התאים עדיין ממעטים להבין. בחלקו, הפער בידע קיים בגלל כמה כלים להפעיל בו זמנית דפורמציה של רקמות ותאים, הדמיה של פעילות תאית בבעלי חיים, הגבלת יעיל של תנועתיות אורגניזמים דגם אחרת מאד ניידים, כגון תולעים נימיות Caenorhabditis elegans. גודל קטן של C. elegans גורם להם קשר מצויין למכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה מחקר, פתרונות עבור קיבעון הוצגו באמצעות מכשירי microfluidic. אף על פי התקנים אלה לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, החיה הוא מלא עטוף polydimethylsiloxane (PDMS) וזכוכית, הגבלת גישה פיזית למשלוח בכוח מכני או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחרונה, יצרנו מכשיר המשלב גלילי עם עיצוב השמנה התואמת למיקרוסקופיה פלורסצנטיות ברזולוציה גבוהה. הערוץ הופעה מופרדת מן התעלה תולעת-השמנה באמצעות בדיאפרגמה PDMS דק. הסרעפת הוא הסיט לתוך הצד של תולעת על ידי הפעלת לחץ ממקור חיצוני. המכשיר ניתן לייעד נוירונים בודדים mechanosensitive. ההפעלה של הנוירונים הללו הוא עם תמונה ברזולוציה גבוהה עם מחוון בקידוד גנטית סידן. מאמר זה מציג את השיטה הכללית באמצעות C. elegans זנים לבטא מחוון הפעילות רגיש סידן (GCaMP6s) בנוירונים קולטן שלהם מגע (TRNs). השיטה, אולם אינה מוגבלת TRNs או חיישנים סידן כמו החללית, אלא ניתן להרחיב אחרים תאים רגישים מכנית או חיישנים.
Introduction
חוש המגע מספקת חיות עם מידע חיוני על הסביבה שלהם. בהתאם הכוח יישומית, מגע נתפשת גם לא מזיק, מענג או כואב. להרכב רקמות במהלך המגע הוא זוהה על ידי תאים מיוחדים mechanoreceptor מוטבע בתוך העור המבטאים קולטן חלבונים, לרוב תעלות יונים. השלבים קישור תפיסה כוח יון הפעלת הערוץ במהלך מגע וכאב אינם מובנים במלואם. אפילו פחות ידוע על מה רקמות העור מסננים דפורמציה מכאנית, אם mechanoreceptors לזהות שינויים זן או להדגיש1,2,3. פער זה בהבנה נובע, בין השאר, חוסר הכלים המתאימים כדי להחיל stimulations מכניים מדויקים על פני השטח של העור של חיים תוך התבוננות התגובות ברמה התאית. ואילו מיקרוסקופ כוח אטומי נעשה שימוש נרחב כדי להחיל ולמדוד את כוחות תאים מבודדים4,5 , גם כדי להפעיל את קולטני Piezo1 חי תאים6, ניסויים דומים באמצעות בעלי חיים, במיוחד C. elegans, היו לשמצה מאתגר עקב ניידות פנימית של הנושא. אתגר זה הוא מצויין באופן מסורתי באמצעות דבק cyanoacrylate וטרינרית או כירורגי-כיתה על מנת לשתק חיות בודדות על אגר רפידות1,7,8,9. גישה זו כבר פרודוקטיבי, אבל יש מגבלות הקשורות את המיומנות הדרושה הנייח על ידי הדבקת פני השטח אגר רך על ציות מכני. אסטרטגיה מיקרופלואידיקה הוא חלופה ללא תשלום זה מונע כמה סיבוכים הקשורים הדבקה.
תולעים נימיות C. elegans הוא אורגניזם מודל גנטי עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, בשל הגודל של החיה, היא מתאימה לטכנולוגיה מיקרופלואידיקה. מכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה ההצעה יתרון כי החיות אחרת מאד ניידים יכול לרסנם בעת ביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ואספקה של גירויים נוירו-modulatory רלוונטיים. עם העזרה של microfluidic טכנולוגיות, חיים בעלי חיים יכול להיות משותק ללא נזק10,11, המאפשר ניטור פעילות התנהגותית מעל12,שלמים13 ברזולוציה גבוהה הדמיה של פעילות. עצבית14,15,16,17. יתר על כן, נוירונים mechanoreceptor רבים הדרושים לצורך ניתן לאפיין את תחושת מגע וכאב שלהם פיזיולוגית1,8, מכני4,18,19, ומולקולרית ברמה20,21,22.
C. elegans החושים גירויים מכני עדין לקיר הגוף שלה באמצעות TRNs שש, שלוש מהן innervate של החיה הקדמי (ALML/R ו- AVM), מתוכם 3 innervate אחוריים של החיה (PLML/R ו PVM). מולקולות ערוץ יון הדרושים transducing כוח יישומית לתוך אות הביוכימי נחקרו בהרחבה ב- TRNs8. מאמר זה מציג על פלטפורמה microfluidic23 המאפשרת לחוקרים להחלת כוחות מכניים מדויקים על העור של קיבוע C. elegans העגולה, תוך כדי קריאת החוצה את דפורמציה של רקמות פנימיות שלה על ידי הדמיה אופטית. בנוסף מציג גירויים מכניים מוגדרים היטב, סידן שנחשולי יכול להיות מוקלט בנוירונים mechanoreceptor עם רזולוציה subcellular, בקורלציה עם תכונות מורפולוגיים האנטומי. המכשיר מורכב ערוץ השמנה מרכזית מחזיק חיה יחידה ומציג את עורה ליד שישה ערוצים הופעה פנאומטיים (איור 1 ואיור 2). שישה ערוצים ממוקמות לאורך הערוץ השמנה לספק גירויים מכניים לכל אחד TRNs 6 של התולעת. ערוצים אלה מופרדים מן החדר השמנה באמצעות דיאפרגמות PDMS דק, אשר יכול להיות מונע על ידי מקור לחץ אוויר חיצוני (איור 1). מכויל על סטיה ביחס ללחץ ואנו מספקים את המידות במאמר זה. כל מפעיל יכול להיות התייחס בנפרד, להשתמש בו כדי לעורר את mechanoreceptor של בחירה. הלחץ מועבר באמצעות משאבה ללחץ מונחה piezo אך ניתן להשתמש בכל מכשיר חלופי. אנחנו מראים כי פרוטוקול לחץ יכול לשמש כדי להפעיל TRNs ויוו ומדגימים התקני הפעלה מתאים אספקת גירויים מכניים למבוגרים C. elegans, טעינת למבוגרים בעלי חיים לתוך מכשירים, ביצוע הדמיית סידן ניסויים, וניתוח התוצאות. ייצור המכשיר מורכבת משני שלבים עיקריים: 1) פוטוליתוגרפיה לעשות תבנית מ סו-8; ו- 2) צורניים PDMS כדי להפוך התקן. למען תמציתיות ובהירות, הקוראים נקראים שפורסמו בעבר מאמרים ופרוטוקולים24,25 להוראות כיצד לייצר את תבניות וההתקנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקן פבריקציה נוספת
- הורד את הקובץ המצורף מסכת (1 קובץ משלים) וצור מסכה כרום באמצעות שירות מסחרי או מתקן ללא צורך במיקור חוץ. כמו בממד הקטן ביותר על המכשיר הוא 10 מיקרומטר (עובי ממברנה בוכנה), לוודא המסכה יש רזולוציה גבוהה מספיק, בתוך ± 0.25 מיקרומטר, לייצר בצורה אמינה את התכונות.
-
בצע בשיטות הרגילות של פוטוליתוגרפיה SU-8 (למשלהפניות24,25,26) ליצור את התבנית לייצור עוקבות של PDMS התקנים; סיכום של הפעולות המצוינות להלן.
הערה: SU-8 הוא חומר לאור, אשר crosslinks בעת חשיפה לאור אולטרה סגול (ספיגה מירבית ~ 365 ננומטר). השתמש בהוראות היצרן כנקודת התחלה לקבוע את הפרמטרים עיבוד עבור הרך-אופים, חשיפה (UV), ולאפות פוסט.- להפקיד 2002 SU-8 על גבי פרוסות סיליקון והמעיל ספין משוער עובי 2 מיקרומטר, הדבקה טובה יותר של מבנים קטנים. רך-אופים על פלטה חמה עבור 1 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מעט יתר על המידה לחשוף (UV) כל השטח (~ mJ/ס מ 1002), ואופים פוסט על פלטה חמה למשך 2 דקות ב 95 ° C.
- ספין-המעיל 47-מיקרומטר בשכבה עבה של סו-8 2050 להגדרת התכונות המכשיר. השתמש מהירות סיבוב של 500 סל ד 15 s (התאוצה סל"ד/s 130), אז 2,000 סל ד עבור 90 s (260 סל"ד/s התאוצה). במידת הצורך, חזור על ולהתאים את המהירות ספין כדי לקבל את העובי המתאים של photoresist.
- רך-אופים על פלטה חמה למשך 2 דקות ב 65 ° C, ולאחר מכן במשך 7 דקות-95 מעלות צלזיוס. לחשוף את photoresist בהתאם להוראות היצרן (~ mJ/cm 1602) באמצעות מסנן מסיכת ומעביר ארוך כרום כדי להבטיח והקירות הצדדיים ישר.
- להסיר את פרוסת סיליקון ואופים פוסט על פלטה חמה 1 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס, ולכל 7 דקות-95 מעלות צלזיוס.
- להמיס סמויה SU-8 עם מפתח, ולנקות עם 2-פרופנול.
- אופים את לחם הקודש על גזייה ב 180 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (קשה לאפות) לייצב את תכונות photoresist.
-
להכין עותק משוכפל PDMS מהמודל SU-8 באמצעות עותק משוכפל רגיל שהמודעות שיטות27.
- פנקו את התבנית SU-8 עם אדי trichloromethylsilane (TCMS) כדי להפחית אדהזיה PDMS (silanization).
התראה: TCMS הוא רעיל, מים-ריאקטיבי.- מניחים את פרוסת סיליקון בדוגמת במעמד וופל בתוך desiccator ואקום בל-ג'אר בשכונה fume ללא מים או ריאגנטים מסיסים במים.
- מתחת למכסה המנוע, להשתמש טפטפת כדי להחיל טיפה 1 של TCMS על צלחת זכוכית ומניחים בפנים desiccator.
- סגור את המכסה desiccator ולאפשר TCMS אדי להרגיע את לחם הקודש לפחות 20 דקות.
- וונט ולאחר מכן פתח את desiccator. פתח את מכסה הצנצנת בל ולהסיר את לחם הקודש באמצעות פינצטה פלסטיק. להכניס בתוך סירה רדיד פטרי או אלומיניום עבור לכייר משוכפל PDMS. תשליך של חומרים מצופים TCMS פסולת מסוכנת נאותה.
- PDMS מיקס (היחס בין 10:1) באמצעות 40 g של בסיס פולימר ו- 4g PDMS ריפוי סוכן.
- שופכים את התערובת מעל כייר SU-8, דגה את התערובת במשך לפחות 30 דקות בתוך תא ואקום.
- התרופה לפחות 6-אייץ '-70 מעלות צלזיוס בתנור.
- פנקו את התבנית SU-8 עם אדי trichloromethylsilane (TCMS) כדי להפחית אדהזיה PDMS (silanization).
- הרם PDMS לחם הקודש על-ידי הגדרת כשהפחד אופקי על משטח שטוח בקפידה מתקלפת את PDMS. לא לכופף את לחם הקודש כלפי מעלה במהלך שלב זה, כמו זה יכול לשבור את התבנית.
הערה: אדהזיה לא שלם של סו-8 פרוסות או לא שלמים silanization יכול לגרום הרס המבנים SU-8 במהלך שלב זה. - חותכים PDMS סביב המכשירים שבבי בודדים כך יתאימו המכשירים coverslip 24 מ"מ x 60 מ"מ.
- באמצעות אגרוף ביופסיה 1 מ מ, לחורר לים, שני שקעים, שישה מפעילים בעזרת אגרוף ביופסיה 1 מ מ. המטרה עבור החוגים מ מ בקוטר 2 בקצוות של המכשיר.
-
PDMS בונד השבבים זכוכית שער גולשת.
- לחשוף את שני המשטחים כדי פלזמה חמצן W 80 (30 s).
- הנח בעדינות את השטח PDMS חשופות על גבי משטח החשוף של תגית כיסוי עבור גושפנקה קונפורמיים.
- Anneal את המכשיר על פלטה חמה (100 ° C, 10 דקות).
הערה: מליטה לא מספיקות יכול להוביל לכשל של המכשיר עקב דליפה.
2. הכנת המיקרוסקופ
הערה: חיות הטרנסגניים: אקספרס מחוון סידן כגון GCaMP6s28 או אחרים המכשיר פעילות גנטית מקודד neuron(s) של עניין (למשל, TRN); שיתוף מבטאים חלבון פלואורסצנטי פעילות עצמאית פולטות-אורך גל שונה לתיקון צדדי קטן וחפצים out-of-להתמקד תנועה המתעוררות עקב גירוי מכני. ניתוח אוטומטיות התוכנה עוקבת אחר, מפצה על תנועה-induced שינויים בעוצמת המכשיר פעילות. התולעת זנים GN69223 (או AQ323629) אקספרס GCaMP6s (או GCaMP6m), את tagRFP ללא תלות סידן תחת השליטה של promotor mec-7. בנוסף, GN692 מכיל את המוטציה lite-1(ce314), אשר מונעת הפעלה של TRNs עקב חיישן אור כחול לייט-130 במהלך עירור של זריחה GCaMP6s23.
-
הגדרת מערכת של מיקרוסקופ עירור סימולטני של GCaMP ו- RFP.
- השתמש מקור אור רציף או פס כפול עירור מסנן מעביר אור רק ציאן וצהוב או השתמש מקור אור הפולטת בלבד אורכי הגל פס מוגדרים כגון ציאן סימולטני (0.77 mW) וצהוב (1.21 mW) מקורות עירור LED עירור סימולטני של זריחה סידן תלוית ועצמאית, בהתאמה.
- השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לאפשר הקלטה של תמונות מיקרוסקופ.
הערה: רוב המצלמות באים עם תוכנה עבור רכישת התמונה. לחלופין, יש תוכנה זמינה בחופשיות יכול לשמש כדי לשלוט המצלמה ואפשרות גם חלקים אחרים של המערכת מיקרוסקופ. - התאם עירור העוצמה בהתבסס על עוצמת קרינה פלואורסצנטית להימנע המצלמה רוויה.
-
השתמש קוביה פלורסצנטיות בהתאם הבחירה של המקור עירור צריך להיות מצויד במסנן עירור.
הערה: 488 ננומטר GFP, 580-nm mCherry מסנן עירור שימש כאן.- להוסיף במפצל קרן הקוביה על המשקף האור ציאן וצהוב והעברת אור ירוק ואדום.
- לצייד את המיקרוסקופ עם 10 X אובייקטיבית, מטרה גבוהה ההגדלה (למשל, 63 X / 1.32 נה שמן) למקד את עירור אור על המדגם.
- הר במפצל קרן לפני המצלמה, הקלטה בו זמנית של GCaMP ואת האות ללא תלות סידן. להבטיח כי המפצל קרן יש מראה ודיקרואיק זוהר (זמן יעבור, ניתוק-570 ננומטר) כדי להפריד בין אור ירוק ואדום באמצעות מסנן פליטה אחד עבור ירוק (passband מרוכז בכל 525 nm עם 50 ננומטר רוחב) ואת מסנן פליטה אחת עבור אור אדום (passband מרוכז בכל 632 nm עם 60 ננומטר רוחב).
- פרויקט ירוק ואדום זריחה על החצי העליון (ירוק), החלק התחתון (אדום), בהתאמה של המצלמה צ'יפ (ראה איור 3). נטייה זו היא תנאי הכרחי עבור תוכנת ניתוח שסופקו.
3. בעלי חיים הכנה
- להכין גיל-מסונכרנות צעירים למבוגרים למבוגרים יום אחד או C. elegans, כפי שתואר קודם לכן על ידי פורטה-de-la-Riva. et al. 31
- הכינו את השבב microfluidic.
- להתחבר למאגר זרימת הכבידה (~ 60 ס מ מעל פני צ'יפ) המכיל מסוננים (0.2-מיקרומטר polyethersulfone מזרק מסנן) מאגר M9 שקע אחד של השבב. להתחבר לשקע אחר שקע אחד של מיכל פסולת שני-outlet, קרי, בקבוקון מסנן. להתחבר לשקע אחרים של הגורם המכיל פסולת משאבה סחרור.
הערה: השתמש צינורות פוליאתילן (PE) עבור כל החיבורים והשתמש צינור מתכת אביזרי להתחבר לצנרת PE את השבב. בדרך זו כל הפתרונות פסולת לרוקן השבב, שליקט את פח אשפה. הזרם דרך הערוצים עודפים יוצר יניקה עדינה שישאיר את התולעת צמוד במהלך תהליך ההשמנה מאוחר יותר. - הכנת חיבורי בהיקף של 50-מ מ ארוך PE צינורות (OD 0.9652 מ מ, 0.5842 מ מ ID) עם צינורות מתכת (מד גודל 23TW, 0.635 מ מ OD) בשני הקצוות. הקש להתאמה אלה מהירים בכל אחת שש אצבעות הופעה, לתוך הים תולעת (ראה איור 1). השאירו את interconnectors האלה השבב, כמו הסרת חוזרות מוביל ללבוש על החורים PDMS.
- להתחבר למאגר זרימת הכבידה (~ 60 ס מ מעל פני צ'יפ) המכיל מסוננים (0.2-מיקרומטר polyethersulfone מזרק מסנן) מאגר M9 שקע אחד של השבב. להתחבר לשקע אחר שקע אחד של מיכל פסולת שני-outlet, קרי, בקבוקון מסנן. להתחבר לשקע אחרים של הגורם המכיל פסולת משאבה סחרור.
- מניחים את השבב על המיקרוסקופ. פיק תולעים 2 – 5 לתוך טיפת מסונן מאגר M9 (0.2-מיקרומטר מזרק מסנן) ולהשתמש מזרק 1-mL למשוך אותם לתוך PE צינורות (OD 0.9652 מ מ, 0.5842 מ מ ID) מחובר מזרק 1-mL על ידי משיכת הבוכנה בעדינות. לשמור את בעלי החיים בצינור PE לא במזרק.
הערה: מדי תולעים או פתרונות לא מסונן בשבב יכול להוביל סתימת. - לחבר את צינורות PE של המזרק interconnect-הים תולעת (איור 1 ו- 2 איור) של השבב. להפעיל את זרימת הכבידה על-ידי פתיחת המסתם ולהתחיל את משאבת סחרור. לאחר מכן לחץ בעדינות על הבוכנה מזרק של המזרק כדי להעביר את החיות לתוך הערוץ השמנה תוך התבוננות על הערוץ תחת מיקרוסקופ עם עדשה X 10 במצב brightfield.
הערה: לעתים להופיע בועות אוויר אינם מהווים בעיה; הם מועברים בדרך כלל באופן אוטומטי לשקע. מספר בעלי חיים יכול להיות 'חנית' בחדר ההמתנה ומשמשת ברצף.- לאחר טעינת החיה לתוך התעלה השמנה (ראה גם באיור 2), להתאים את מיקומו על-ידי בעדינות לדחוף או למשוך את הבוכנה של המזרק כדי למקם את הראש של החיה בצורת מחודדות בחזית התעלה.
- ודא התולעת (למבוגרים יום 1) בגודל הנכון להיות לכוד בתוך השבב.
- אם התולעת אינה ממלאת את כל חתך הרוחב של הערוץ של האף עד סמוך לסוף של הגוף (לא כולל את קצה הזנב) או התולעת נע על הציר של הערוץ מבלי להזיז את הבוכנה של המזרק , להסיר את התולעת על-ידי הקשה על הבוכנה של המזרק עד שהוא נעלם מן התעלה השמנה ולטעון אחד חדש (ראה שלב 3.8).
- לעבור למצב זריחה של המיקרוסקופ, עדשת הגדלה גבוהה יותר (40 X ומעלה) ולבדוק אם neurite של נוירון עניין מגיע לשקר מעבר הסרעפת של אחד מפעילים. אם לא, לכוונן את המיקום של החיה על ידי משיכה או דחיפה הבוכנה. אם זה לא עוזר, להסיר את התולעת, טען אחד חדש.
- מתמקדים בגוף התא של נוירון עניין וחבר את interconnect במפעיל הקרוב הנוירון על הצד הקדמי של הגוף תאים משאבה ללחץ לתכנות באמצעות צינורות PE.
- אם הניסוי מחייב מדידת המרחק בין במפעיל הנוירון, להעביר את שדה הראיה כך שניהם בתוך שדה הראייה, channelwall, הוא מקביל הקצה העליון והתחתון של התמונה.
- הגדרת פרוטוקול לחץ באמצעות המשאבה לחץ ניתן לתיכנות.
הערה: פרוטוקול זה ניתן לכוונן את הניסוי הרצוי.- להתחיל עם לחץ מתמיד של 0 kPa לזמן המתאים לפחות 50 תמונות של רצף תמונות (הכרחי עבור נרמול). עבור שיעור הדמיה של 10 הרץ זה מקביל 5 ס הוסף צורת גל הגירוי הרצוי ולחץ, להגדיר את האורך של הגירוי כמו שלב שני.
הערה: מעורר את TRNs, גל sinusoidal (קרי, 75 kPa, 10 הרץ) נקודות המגע המוצגים בצעד (קרי, 275 kPa) מומלץ כפי שהיא מייצרת לתגובה העצבית גדולים. - אם הניסוי דורש גירויים נוספים, לכלול תקופה של פחות 10 s, בלחץ מתמיד של kPa 0 בין גירויים. לפני החלפת את משאבת לחץ, ודא הלחץ בכלי ב kPa 0 קבוע כדי למנוע גירוי מקרית של התולעת לפני הניסוי בפועל.
- להתחיל עם לחץ מתמיד של 0 kPa לזמן המתאים לפחות 50 תמונות של רצף תמונות (הכרחי עבור נרמול). עבור שיעור הדמיה של 10 הרץ זה מקביל 5 ס הוסף צורת גל הגירוי הרצוי ולחץ, להגדיר את האורך של הגירוי כמו שלב שני.
- להפעיל את פרוטוקול הדמיה ובלחץ.
- בתוכנה רכישת התמונה של המצלמה, להגדיר את רצף תמונות ב-10 הרץ באמצעות מועד החשיפה של 100 ms עבור משך הזמן של פרוטוקול לחץ. התאם את עוצמת עירור כזה כי העלייה פלורסצנטיות מקסימלי לא להרוות את המצלמה. שמור את התמונות כקובץ *.tif עם תמונות לפחות 50 לפני הגירוי הראשון עבור נרמול.
- להתחיל פרוטוקול הדמיה התוכנה רכישת התמונה של פרוטוקול לחץ בתוכנה של המשאבה לתכנות. במהלך ההקלטה, לבחון אם הנוירון עניין הנקודה הבהירה ביותר באזור של 10 x 10 פיקסלים, לא זזה רחוק יותר מאשר 10 פיקסלים רציפים בתמונות, ונשאר בתוך שדה הראייה במהלך ההקלטה.
הערה: אם לא יעשה כן, התוכנה ניתוח ייכשל. כתמים בהירים (קרי: autofluorescence) סביב הנוירון לבצע הקלטות של הנוירונים קשה לנקות. כדי לתקן זאת, הסר את התולעת המלכודת וטען תולעת חדש לתוך השבב. אם התולעת זז יותר מדי, נסה הקלטה חדשה של התולעת זהה ולבחון את התנועה תולעת. אם הבעיה נמשכת התולעת עשויות להיות קטנות מדי להיות לכוד. במקרה זה להסיר את תולעת זו וטען תולעת מעט יותר גדול למלכודת. - אם רצונך בכך, הרשומה אותות מרובים נוירונים בתוך שדה הראייה בו-זמנית כל עוד הנוירונים מופרדות לפחות 10 פיקסלים במהלך כולו.
- לחקור habituation, לבצע את הניסוי שוב ושוב על חיים.
- הסר את התולעת בערוץ השמנה.
- אם זה רצוי לשמור את התולעת על מחקרים מאוחרים יותר, נתק את השקעים של השבב לכיוון זרימת הכבידה של פח אשפה. הקש על הבוכנה של המזרק בעדינות עד התולעת כולו נדחף דרך ערוץ השמנה לתוך ערוץ הזרימה.
- המשך להקיש על הבוכנה המזרק עד החיה מופיע droplet בחוץ השבב. נתק את המזרק כולל את צינורות PE מן הים תולעת, להשתמש בו כדי וארוקן את התולעים ה-droplet ולהעביר אותה אל צלחת אגר.
- אם זה אינו רצוי לשמור את התולעת, להסיר את התולעת על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק עד התולעת כולו נדחף דרך ערוץ השמנה לתוך תעלת זרימה; את זרימת הכבידה, היניקה של המשאבה ממברנות ויישא החיה מחוץ לשבב ולתוך המיכל פסולת.
4. ניתוח
- הורד והתקן את הגירסה החדשה פיג'י32.
- הורד והתקן את הגירסה החדשה ביותר של SDK java.
הערה: אם יש צורך, למחוק או לשנות שם התיקיה java בתוך תיקיית פיג'י פיג'י להשתמש המהדר java חדשה שהותקנה. -
פתח את תוכנת פיג'י.
- בדוק אם התוכנה פועלת המהדר java חדשה שהותקנה על-ידי פתיחת ' תוספים | עזרי | ImageJ | נכסים.
- הורד את הקובץ pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, לראות את 2 הקבצים המשלימים).
- גרור ושחרר את הקובץ .java לתוך חלון התוכנה כדי לפתוח אותו בתור תוסף.
-
בצע הידור והפעלת את הקובץ pokinganalyzer*.java על-ידי לחיצה על מקשי Ctrl + R בפיג'י; ממשק משתמש גרפי (מנתח מציץ) יפתח (איור 3).
- לחץ על הכרטיסייה "עזרה" ולקרוא על הדרישות של התוכנה, כיצד לבצע את הניתוח. כדי להתחיל, בחר את הכרטיסיה "וידאו פתוח" ציין מיקום קובץ וידאו במנתח: לחץ על לחצן "לפתוח וידאו", נווט אל המיקום של הווידאו ולפתוח אותה.
הערה: התוכנה מתחילה עם כרטיסיה זו נפתח. אם זה לא פתוח בעת הפעלת ניתוח חדש לחץ על הכרטיסייה "וידאו פתוח". אם הווידאו בפורמט a.tif, התוכנית פנימי לפתוח את הסרטון ולהציג את התמונה הראשונה בחלק התחתון של הממשק. אם התמונה אינה של וידאו צריך להיות מנותח, לחץ על לחצן "לפתוח את סרטון" כדי לפתוח עוד וידאו. - כדי להמשיך, לחץ על הכרטיסייה "ROIs להגדיר". בכרטיסיה זו, הגדר את המיקום של TRN. שימו לב כי התמונה הראשונה של הוידאו נפתח מוצגת בחלק התחתון של זה tab. לחץ על כפתור "TRN להגדיר" ולחץ על הנוירון בחלק העליון של התמונה המוצגת אשר אמורה להציג את זריחה GCaMP.
- אופציונלי: אם במפעיל מוצגת בחצי העליון של התמונה התוכנית באופן אוטומטי לאתר את המרחק בין הנוירון במפעיל במידת הצורך. עבור בדיקה זו, "קבע במפעיל?" -בתיבה, לחץ על כפתור "למפעיל להגדיר" ולחץ במפעיל בחצי העליון של התמונה.
- לחץ על הכרטיסיה "ניתוח" הגדר קצב רכישת התמונה. הזן מספר בשדה או לחץ על החץ למעלה או למטה כדי להגדיל או להקטין את המספר. אם הכרטיסיה הקודמת "קבע במפעיל?" -תיבה מסומנת, להגדיר גודל התא המצלמה ההגדלה, הגורם binning, אז התוכנית ניתן לחשב את המרחק.
- לחץ על לחצן "התחל ניתוח".
הערה: התוכנית עכשיו לאתר הנוירון מאת שלה פלורסצנטיות ברצף התמונה בחצי העליון (תלוי סידן), בחלק התחתון (סידן עצמאית) של רצף תמונות. לקחת בחשבון נוירון תנועה במישור של הקלטת התוכנית יחקרו על שטח של 10 x 10 פיקסלים מסביב המיקום של הנוירון בתמונה הקודמת כדי למצוא את המיקום של הנוירון בתמונה הבאה. זה יחשב את פלורסצנטיות בשני חצאים על ידי תיקון עבור קרינה פלואורסצנטית הרקע (Fbg) חלוקה זריחה של תמונות ראשון 50 (F0):
קרינה פלואורסצנטית לשינויים בערוץ ירוק, תלויי-פעילות (FCa2 +) הנגרמות על-ידי נוירון תנועה מהמטוס של הם recoding ולאחר מכן תוקנו באמצעות קרינה פלואורסצנטית בערוץ אדום, פעילות עצמאית (נ קור), גירוי מקדים סטיית התקן של הסידן תלוית (sdCa2 +), עצמאית קרינה פלואורסצנטית (sdקור) מאת:
- התוכנית תציג את התקדמותו בשורת המצב בחלק התחתון של הממשק; שורת המצב מגיע ל 100%, לחץ על הכרטיסייה "תוצאות". אם שורת המצב נפסק לפני 100%, התוכנית ייתן הודעת שגיאה המציינת את הסיבה שהתוכנית לא יכול לנתח את הוידאו.
- אם האות ליחס רעש נמוכה מדי, התוכנית לא יכולה לזהות הנוירון; כוונן את הפרמטרים הדמיה בהקלטות עוקבות.
- אם הנוירון עוזב את שדה הראיה במהלך ההקלטה, התוכנית לא יכולים לאתר אותם יותר, יעצור. להקלטות עוקבות, מקם הנוירון באמצע שדה הראייה בתחילת הקלטת.
- אם באזורים מסוימים של שדה הראייה הם רווי, ניתוח אוטומטיות יפיקו תוצאות לא חוקי. להקלטות הבאים, ודא שהאות פלורסצנטיות לא להרוות את חיישן המצלמה.
- בכרטיסיה 'תוצאות', התוצאה מוצגת בחלק העליון. שמירת קובץ המופרד *. txt של טבלת התוצאה על ידי לחיצה על "שמירת תוצאה שולחן".
הערה: בטבלה זו מורכבת הזמן שניות ו סידן תלוית מנורמל קרינה פלואורסצנטית (תורגם על-ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ללא תלות). אם בעבר מוגדר, הוא מכיל גם את המרחק הכולל בין את TRN במפעיל ב מיקרומטר ולהגדיל את המרחק בין את TRN במפעיל בניצב לקיר ערוץ מיקרומטר התוצאות נציג של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאחר גירוי לעומת המרחק של גוף התא כדי במפעיל הקרוב מותוות באיור4. - אם ישנם נוירונים מרובים בהקלטה אחת (מופרדים על ידי יותר מ 10 פיקסלים), לחץ על הכרטיסייה "ROIs להגדיר" שוב ולחזור לשלב 4.6.2 עם הנוירון השני.
- לחץ על הכרטיסייה "עזרה" ולקרוא על הדרישות של התוכנה, כיצד לבצע את הניתוח. כדי להתחיל, בחר את הכרטיסיה "וידאו פתוח" ציין מיקום קובץ וידאו במנתח: לחץ על לחצן "לפתוח וידאו", נווט אל המיקום של הווידאו ולפתוח אותה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SU-8 ליתוגרפיה, שבב מליטה
ליתוגרפיה הפרוטוקול לבין דפוס PDMS בצע הליכים סטנדרטיים. פרטים ניתן למצוא במקומות אחרים23,24,25,26. PDMS צריך לקלף את וופל ללא בעיות לאחר ריפוי. אם התכונות SU-8 תעתיקו במהלך PDMS פילינג, השכבה אדהזיה SU-8 או את silanization היה מספיק. אם פלזמה-הפעלה של coverslips זכוכית דקה והאסימונים PDMS אינה מספיקה, מליטה חלש יכול לגרום בריחת הערוץ השמנה או גלילי וכתוצאה מכך בביצועים היעדרות של גירוי. אם בריחת נוזלים ניכרת, השבב הוא לא שמיש.
ביצועים למפעיל
כל מפעילים את PDMS ואת הצנרת מתחבר השבב המאגר אוויר ייסתמו כראוי כדי להבטיח הופעה פנאומטיים נאותה של דיאפרגמות. הכניסה חוזרים ונשנים והסרה של הצנרת PE (צנרת) נזק PDMS חורים ולהוביל לירידה בלחץ. אובדן גדול בלחץ יגביל למפעיל סטיה ואת הכוח נמרח על העור של החיה קיבוע. סטיה של הסרעפת ניתן למדוד באמצעות שבב של ריק (אין חיה בהווה) על ידי ביצוע כמה מחזורים הופעה עם הלחץ הרצוי והשוואה בין הערכים כמותיים עם תחזיות תיאורטיות. סטיה של הסרעפת לא נמדדה בנוכחותו בעל חיים בערוץ השמנה, כי הגבול ממברנה, תולעת שקשה לדמיין. זה הופך את דיוק כיול עם חיה לכודה. בלתי אפשרי. טבלה 1 מציגה את סטיה הצפוי כפונקציה של לחץ. ערכים אלה חושבו באמצעות תיאוריה צלחת אלסטי, פרטים ניתן למצוא Nekimken. et al. 23 קשר זה צפוי להשתנות עם הבדלי עובי הסרעפת שנוצרו במהלך הליהוק שבב ולגורמים אחרים כגון השלמות לקשר בין השבב ואת זכוכית חותמות מתחבר השבב מקורות הלחץ. כאן, הערכים היו לשחזור עם וריאציה קלה שלא יעלה על 1 מיקרומטר ב kPa 450 בלחץ. אנו שאפיינו את הביצועים של דיאפרגמות עבור כל שלושת הפרופילים גירוי אחר, להפנות את הקורא מעוניין Nekimken et al. 23 סיכום, שם הם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון אם הערכים תסטה טבלה 1: 1) דליפת אבובים או מחברים לצנרת, PDMS 2) יש גמישות שונה, אשר יכול לנבוע יחס חלופית של בסיס פולימר ושל סוכן ריפוי, או 3) PDMS בגילאי והמשיך לקרוא את crosslink לאורך זמן. לכן, מומלץ השימוש שבבי אשר הוכנו תוך חודש של היישום שלהם.
ביצועי השמנה
לאחר הוספת את התולעים לתוך הים של השבב, לחץ עדין עם המזרק צריך למקם חיה יחידה אחת בתוך התעלה השמנה ולהציג עורה לצד מפעילים שש (איור 1). חשוב, האף של בעל החיים אינו בהכרח צריך לבלוט לתוך המאגר מאגר. במקום זאת, חשוב יותר למקם את החיה כזה neurite נמצא סמוך במפעיל הקרוב והוא גוף התא שלה בתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ. כדי להשיג הפעלה עצביים אופטימלית, המרחק בין מפעיל תאי הגוף צריך להיות מותאם כך במפעיל שקרים והשתרשה עמוק בלבה לגוף התא של עניין. מניסיוננו, עבור נוירונים מגורה שהאחורי לגוף התא, הפעלה לא תיקח מקום וסידן שנחשולי יהיה נעדר. קיבעון נכונה יכולה להיות מושגת עם צעיר אנדרוגינוסים למבוגרים או אחד - בן יום (אופטימיזציה עבור אלה הגילאים שני התקנים זמינים על המסכה אותה). חיות קטנות יותר להחליק לתוך המאגר אוסף או להעביר רוחבית בתוך התעלה השמנה. בעלי חיים גדולים מדי תילחץ אל תוך הערוץ, אשר עלול לגרום הפעלה מוקדמת של TRNs, כשל עוקבים כדי לזהות תופעות מעבר mechanoreceptor. כמו כן, הסרה של תולעים גדולות הוא מאתגר, המובילה למוות של החיה ו/או סתימת של המכשיר. עם העיצוב הזה, נוירון PLM בדרך כלל לא יכול להיות משותק לחלוטין, אז זה חופשי לנוע רוחבית ואנכית. אמנם יש לנו בהצלחה להפעיל נוירונים PLM, הקלטה סידן שנחשולי הנוירונים הללו קשה בשל תנועה אנכית של הזנב. עוד דגם השמנה שימש כדי להקליט PLM33.
הדמיה של סידן שנחשולי וניתוח
פעם אחת במקום, החיות יכול להיות מגורה באמצעות אחד מפעילים שש. מפעילים שש ממוקמות לספק גירויים מכניים לכל אחד TRNs 6. בקר זרימת microfluidic מחובר למקור הלחץ הפנימי 450-kPa שימש כדי לספק החיה פרוטוקול גירוי של צעד 275 kPa 2-s, רמפה kPa 2-s 0 – 275, באז 2-s (75 kPa, סינוס 10 הרץ נקודות המגע המוצגים בצעד 275 kPa) , כל אחד המופרדות על-ידי תקופת המתנה של 10-s. רצפי תמונות מוקלטות בו זמנית תופעות מעבר סידן נותחו בפיג'י, באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב זמין בחשבון GitHub שלנו (ראה לעיל ו- https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). מצאנו כי הלחץ רמפות ומדרגות הלחץ מופעל TRNs רק אם הגירויים מושגת הלחצים מעל 400 kPa. לעומת זאת, הפעלה של החזקה של כל TRNs מגורה באמצעות באז sinusoidal, 10-הרץ ב kPa < 275 לחצים נצפתה (איור 4). באופן כללי, TRNs הגיב טוב יותר לגירוי sinusoidal קצר (הנקרא 'באז'), מסכים עם דוחות קודמים באמצעות מתודולוגיות שונות1,9. הגירוי עם שיער קצוץ היא יעילה במיוחד, המוביל ~ 90% של הפעלת כל הנוירונים, בניסויים נבדק (איור 4). באופן מפתיע, היה מתאם חזק מובחנים אם הגירוי הוחלה מהראש או הצד הבטני, היה עצמאי של המרחק בין גוף התא גירוי עמדה על neurite. מחקרים עתידיים יהיה לחקור אם העיכוב של התגובה המרבית בקורלציה עם המרחק הגירוי.
איור 1: סקירה של עיצוב שבב- (א) פריסה סכימטית של photomask ואת השבב שנוצר עם מחברים כל המצוין. יש שש אצבעות הופעה, שלוש בכל צד של התעלה השמנה מרכזית. סרגל קנה מידה = 3 מ מ. (B) תמונה של המכשיר microfluidic עם PDMS מלטשים coverslip ומחובר אבובים לים תולעת, שקעים תולעת. רק באחת האצבעות הופעה מחובר למקור הלחץ, בעוד חמשת האחרים לא תפוסים. חלקים של הדמות שפירטתי מן ההפניה23 במסגרת רשיונות משותפים יצירתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תקריב של השמנה מרכזית ערוץ, השמנה שגרה. (א) שרטוט סכמטי של הערוץ השמנה. העמודים בצד כניסת תולעת לעזור אוריינט התולעת להקל על טעינה של בעלי החיים. האצבעות הופעה יכולה להיות מווסתת והסט בדיאפרגמה דק לתוך הדגימה לכוד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) נציג מוידאו של תולעת להיות כלוא בתוך התעלה האופקית. הערוץ מתוכנן כך התולעת מגיע להניח לרוחב 6 גלילי. הזנב הוא משמאל, הראש ימינה. המיקום של נוירונים קולטן מגע ייחודי (TRNs) המסומנים על ידי חצים, שכותרתו באיור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (ב כל לוחות). חלקים של הדמות שפירטתי מן ההפניה23 במסגרת רשיונות משותפים יצירתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סקירה של התוסף פיג'י שסופקו לנתח עקבות סידן רכשה עם פרוטוקול זה. התוכנה הפעלת ממשק משתמש גרפי. הכרטיסיה הראשונה ("וידאו פתוח") של ממשק המשתמש מראה הלחצן כדי לפתוח וידאו, הוא מציג את הנתיב ואת המסגרת הראשונה של הוידאו שנפתחו. הכרטיסיה השני ("להגדיר ROIs") כוללת הלחצן להגדרת נוירון מגע קולטן, להן תיבות סימון להפעלת לחצן "למפעיל להגדיר" ואת לחצן "למפעיל להגדיר". בחלק התחתון, מוצגת המסגרת הראשונה של הוידאו. בחלק העליון של הכרטיסיה השלישית ("ניתוח"), מוצגים פרמטרים הניתנים לשינוי לניתוח תמונה. החלק האמצעי מראה על לחצן "התחל ניתוח". בחלק התחתון, פס התקדמות מציג את ההתקדמות של הניתוח הנוכחי. בכרטיסיה הרביעי, "תוצאות", התוצאה מוצג גרף של עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחסית לאורך זמן. בחלק התחתון, יש כפתור לשמור את הטבלה תוצאה. בכרטיסיה החמישי, "העזרה", טקסט העזרה מוצג מציג את הדרישות עבור ניתוח תוכנה והדרכה על איך להשתמש בו. איור מקורי הפניה23 במסגרת רשיונות משותפים יצירתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נוירונים בודדים מגיבים לגירויים מכני. (א) micrograph זריחה נציג של GCamP6s עם התווית AVM מגע קולטן נוירון לפני ואחרי גירוי מכני עם שיער קצוץ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. מרחב צבע = $1,500-3,500 ערכי אפור. (B) פרוטוקול גירוי כולל 2 s הסרעפת עירור המייצג צעד 275 kPa, רמפה 275 kPa ו סינוס (75 kPa; 10 הרץ) נקודות המגע המוצגים בצעד 275 kPa (באז). (C) מנורמל GCamP6s עוצמת מעקב (אומר ± SEM שטח מוצל) הוקלט מ- AVM מגורה עם הפרופיל שמוצג ב' של חיות פראי סוג (ירוק, n = 14), חיות מוטציה יחידה משנית ערוץ mechanoreceptor mec-4 (כחול, n = 10), כלומר ידוע כדי להקל על התגובות מכאניים. אפשרות זו מציינת כי תופעות מעבר הן תוצאה של גירויים מכניים יישומית. חלקים של הדמות שפירטתי מן ההפניה23 במסגרת רשיונות משותפים יצירתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| לחץ (kPa) | זאת אומרת סטיה (מיקרומטר) | SD | סטיה הצפוי (מיקרומטר) |
| 0 | -0.01 | 0.01 | 0 |
| 50 | 0.77 | 0.26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0.58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0.74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0.79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0.79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0.82 | 4.25 |
| 400 | 5.92 | 0.82 | 4.85714 |
| 450 | 6.43 | 0.75 | 5.46429 |
טבלה 1: צפויה הסטה ניסיוני ערכים עבור יישומי לחצים הנע בין 0 – 450 kPa ואת תחזיות תיאורטיות שלהם. נתונים נגזר על גירוי שלב. זאת אומרת ± SD. נתונים אלה נרכשו עם ערוץ השמנה ריק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מדגים שיטה להעברת גירוי מכני מדויק על העור של התולעת העגולה לכוד בתוך שבב microfluidic. הוא נועד להקל על קליטת גירויים הפיזי למענה על שאלות ביולוגיות, שמטרתו לייעל את mechanobiology מחקר במעבדות ביולוגיות. שיטה זו מרחיבה מבחני הקודם כדי להעריך את הפונקציה של נוירונים mechanosensory C. elegans. טכניקות למחצה כמותי וסטטיסטי הקודם נמדד כוחות1,34 / התנהגות35, אך קשה להשתלב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה של פעילות. עצבית. וכך, אנו מאמינים כי השימוש של השבב הזה משתרע היישומים הנוכחי, הביצועים שלה ממוטבת עבורו גירוי של נוירונים הדרושים עבור המגע העדין. אנחנו אופטימיזציה של סטיה במפעיל יד 5 מיקרומטר, וזו גירוי חזק מספיק כדי להגיע כמעט מקסימלי תגובות עצביים. בשינויים קלים, אנו מאמינים כי עיצוב זה יכול לשמש כדי לעורר רצפטורים מגע קשות, כגון nociceptors PVD זה innervate משטח הגוף36.
שינויים ופתרון בעיות
אם אין מקום נקי זמין עבור ליתוגרפיה SU-8, ניתן להשתמש תיבה נקי benchtop או סו-8 תחנות רך-ליתוגרפיה מצויד עם מנורות UV, כיריים לתכנות של התקנות ריסוס ספין. חלופה בעלות נמוכה לייצור של microfluidic התקנים אשר ימנע שימוש במתקני חדר נקי יכול להיות גם אחרי26.
עיצוב, אנחנו ליישום טכניקת ההשמנה הקיימת, אשר עוצר בעל חיים בודד בערוץ microfluidic. העיצוב מלכודת מותאמת מהתקן המשמש ללמוד תחושה חוש הריח התולעת36, אבל זה לא האפשרות היחידה לדכא את התנועה תולעת. אסטרטגיות אחרים שדווחו להחזיק את התולעים microfluidic התקנים: CO2, electrophoretic,37,11,compressive הנייח38 היו בשימוש, ואני יכול להיות משולב לתוך ששונה עיצוב.
נמסר לנו לחץ הערוצים הופעה באמצעות משאבה זמין מסחרית, פיזואלקטריים הלחץ אשר יכול לשלוט ולספק kPa עד 800 ממקור לחץ חיצוני. אנחנו מחובר את משאבת אוויר דחוס במחקר בניין, שהיא מסוגלת לגרום kPa ~ 450. אם אין מקור של אוויר דחוס זמין, ניתן להשתמש מיכל דחוס, גז אינרטי (למשל, N2). זה יהיה יתרון נוסף של העברת לחצים גבוהים יותר, יצירת דפורמציות גדולות, אך ידרוש גם אביזרי בלחץ גבוה כדי להתחבר הבקר לחץ לשבב. בודה את השבב של PDMS רך הוא דרך חלופית כדי להגדיל את הלחץ-induced דפורמציות.
בניסוי זה, בשקע של לחץ המשאבה מחובר לשבב PDMS דרך פתחים המקבל 1 מ מ (למשל, ניקוב חורים) מחובר עם interconnectors ללא דבק והפיך המורכב הקש להתאמה 20 גרם מתכת-צינור מוכנס של PE אבובים. אלה הוכחו לעמוד בפני לחצים עד ל kPa 70039. יש לנקוט במהלך הכניסה חוזרות ונשנות, עם זאת, כמו PDMS סביב החורים נוטה לקרוע, ובכך להגביל את הביצועים או להפוך את השבב לבלתי ניתנת לשימוש. מסיבה זו, לאורך צינור מתכת היה להוסיף פעם אחת והוא נשאר מחובר לשבב, ללא הסרת ומחדיר אותו שוב ושוב.
שלבים קריטיים
גירוי מועבר על ידי ערוץ הופעה מווסת, אשר כניסות העור. דפורמציה וכתוצאה מכך והפעלה נוירון mechanoreceptor יכול לדימות עם רזולוציה גבוהה מיקרוסקופ אופטי פלורסצנטיות ו/או הגדרת קונפוקלי. מספר גורמים יכול לעכב את הגילוי של התגובות GCaMP. ראשית, C. elegans אקספרס קולטן אור כחול30 רבים הניריונים, כולל TRNs21,23, אשר מפעילה תאים לאחר תאורה עם כחול (488 ננומטר) אור. לפיכך, הדמיה C. elegans שימוש בחיישן סידן מקודדים גנטית GCaMP6s יהיה להפעיל את הנוירונים שלו על תאורה, טשטוש שנחשולי סידן מופעל על ידי גירוי מכני23. עובד על רקע מוטציה לייט-1 או באמצעות חיישנים פעילות סידן אדום-העביר מונע לעזאזל עם זה. אולי סידן השני, מכנית-induced ארעית לא יזוהו אם הפרופיל הגירוי אינו תואם את רגישות mechanoreceptors. אנחנו לא הצליחו לזהות הפעלה גבוהה-משרעת מדרגות, רמפות, אבל עורר אותות גבוה במיוחד לאחר גירוי עם גירויים dynamics מתונה (למשל, באז - kPa 200). לבסוף, TRNs habituate לגירויים חוזרות הנכללת קצר (< 60 s) מרווחי interstimulus. לכן, חשוב עיצוב גירוי רצפים למזער habituation למעט במקרים שבהם הוא נחקר habituation.
אנו ממליצים סינון כל הפתרונות, כמו פסולת ואבק במאגרי יכולים להיסתם בקלות את הערוץ ההשמנה קטנים. עוד יותר, בעלי חיים חייב להיות גיל-מסונכרנות ותואמים גודל-עיצוב של השבב; בעלי חיים קטנים יותר מבוגרים צעירים להחליק דרך המכשיר או להיכשל לרסן ובעלי חיים גדולים יותר יכול להזין את הערוצים השמנה בסכנה מתפוצץ ו/או סתימת את השבב. במקרה של סתימת, יישום של לחץ מופרז לים זרימה תולעת או הכבידה יכול לנקות את הערוצים, אך יכול גם להוביל לכשל של ההתאמה.
כפי שצוין במקטע תוצאות, מספר גורמים יכול להוביל כשל בתוכנית ניתוח. אם הבעיות הן נתקל את והידור של הקוד, וידוא כי התוכנה פיג'י האחרונה פועלת, פיג'י זה משתמש המהדר Java החדש מומלץ. אם התוכנית פועלת אך ישנם לא צפוי תוצאות נא ודא כי הסרט המוקלט יש מאגר 50-מסגרת לפני גירוי מכני בפועל מתבצע כדי להבטיח הערכה נכונה של זריחה בסיס ורקע. עוד, שדה הראייה של הירוק, תלויי-פעילות (GCaMP6s), האדום, ערוץ פעילות עצמאית (tagRFP) היא כי להיות מוקרנת החצי העליון והתחתון של השבב מצלמה, בהתאמה. אם המפצל קרן פרויקטים את התמונות על גבי חצי ימינה ושמאלה של החיישן, תכבה את המצלמה ב- 90° כדי להשיג את הכיוון הרצוי במהלך ההקלטה או לסובב את אוספי תמונות של שלב עיבוד מראש. יתר על כן, התוכנית מזהה הנוירון על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלה ואת ייכשל אם יחס אות לרעש או ניגודיות נמוכה מדי. במקרה זה, שינוי הזמן עירור העוצמה ו/או חשיפה עשויה לפתור את הבעיה. התוכנית יעצור גם אם הנוירון עוזב את שדה הראיה במהלך ההקלטה, שבו במקרה הנוירון שנמצאת במרכז שדה הראייה לפני שמתחילים רכישה חדשה.
מגבלות של הטכניקה
העיצוב הנוכחי מאפשר גירוי של העצב mechanoreceptor לגוף החומה כמו את nociceptors PVD TRNs, אבל לא mechanoreceptors זה innervate אזור הראש של התולעת, כגון FLP ואפר. . זה מוגבל ללחצים < 700 kPa. עבור לחצים גדולים, ריהוט שפופרת שונים צריך להיות מועסק. מאז אספקת לחץ כאן לא יעלה על 500 kPa, הלחץ המקסימלי ניתן להחיל היה מוגבל ל 450 kPa. הסידן שנחשולי שרואים כאן לסמן את הגבול העליון של האות הצפוי. הגבלה נוספת על העיצוב של מפעילים שלנו הוא שלהם יחס גובה-רוחב. בעקרון, דיאפרגמות רזה תאפשר דפורמציות גדולות יותר, אך מבנים עם יחס גבוה קשה ליצור באופן אמין. אם דפורמציות גדולות יותר חיוניים, מפעילים רחב יותר או דפורמציות במקביל משני הצדדים עשוי להועיל, כפי שהוצגו על ידי צ'ו. et al. 29
למרות שנוכל לפקח על הסרעפת דפורמציה, קשה למדוד את הכוחות מוחל בעת גירוי פנאומטיים של הערוצים הופעה. המגבלה העיקרון הוא איזור המגע במפעיל הוא לא מוגדר היטב. זה בגלל במפעיל עצמו הוא אלסטי, עיוות במהלך הופעה, אשר משנה את הרדיוס ליצירת קשר עם הגדלת סטיה. עם אזהרות אלו בראש, אנחנו יכולים להעריך כניסה 5 מיקרומטר (כ-300 kPa הופעה לחץ בשבב ריק) הוא ניבא להחלת התולעת לפי ההערכות נוקשות תולעת של פצולד. ואח כ 3.8 µN 34 מאז התלות כוח של הזרם עצביים משתנה בתולעים עם stiffnesses שונים1,34, עם זאת, ניטור כניסה כפי מידת עוצמת הגירוי במקום כוח מומלץ.
אנו מקווים כי הפצת פרוטוקול זה יעזור למשתמשים לנצל מיקרופלואידיקה למחקר mechanobiology באמצעות C. elegans כמערכת מודל ובכך להאיץ את ההתקדמות של המדע בנושא חשוב זה בשטח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים סנדרה ש Manosalvas-Kjono, פורים Ladpli, פארה ממון, דיוויה Gopisetty וורוניקה סנצ'ז עבור תמיכה עיצוב המכשיר, דור של חיות. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקים R01EB006745 (קרית אתא), R01NS092099 (כדי מדיניות החזרה), K99NS089942 (כדי ח"כ), F31NS100318 (כדי ALN) ומימון שהתקבלה מ אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות של האיחוד האירופי התוכנית ( להעניק הסכם מס 715243 ח"כ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
