Summary

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

Published: February 19, 2018
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Summary

メカノバイオロジー研究のための新しいツールはどのように機械的ストレスを理解に必要な生化学的経路を活性化し、生体反応を引き出します。ここでは、細胞応答の高分解能イメージングをできるようにマイクロ トラップで固定化動物の選択的な機械的刺激のための新しい方法を紹介します。

Abstract

1 つの中央目標メカノバイオロジーの蛋白質および細胞のメカニカル ストレスの相互影響を理解することです。その重要性にもかかわらず機械的ストレスの細胞機能に及ぼす影響はまだよくわかっていません。いくつかのツールは、組織や細胞の同時変形、生きている動物の細胞の活動のイメージングと線虫など、それ以外の場合高度なモバイル モデル生物運動の効率的な制限を有効にするためにこの知識のギャップが存在する部分には、線虫線虫 c. エレガンスのサイズが小さいマイクロ ベースの研究装置に優れた一致のため、マイクロ流体デバイスを用いた固定化のためのソリューションを提示されています。これらのデバイスは高分解能イメージングを使用、動物はポリジメチルシロキサン (PDMS)、ガラス、機械的な力や電気生理学的記録の配信のための物理的なアクセスを制限することに完全に包まれています。最近では、高解像度蛍光顕微鏡と互換性のあるトラップ デザインと空気圧アクチュエータを統合したデバイスを作成しました。作動チャネルは、薄い PDMS ダイヤフラムでワーム トラップ チャネルから区切られます。この振動板は、外部ソースからの圧力を適用することによってワームの側面にそらされます。デバイスは、個々 の機械受容ニューロンをターゲットできます。これらのニューロンの活性化でイメージはカルシウムの遺伝子にコードされた指標と高解像度。この記事は、接触受容体ニューロン (TRNs) でカルシウムに敏感なアクティビティ インジケーター (GCaMP6s) を表現する線虫の系統を用いた一般的な方法を示します。メソッドはしかし、プローブと TRNs にもカルシウム センサーに限定ではない、他の機械的に敏感な細胞またはセンサーに拡張できます。

Introduction

タッチの感覚は、彼らの環境に関する重要な情報を持つ動物を提供します。適用された力によって、無害な楽しい、または痛みを伴う、タッチは感知されます。タッチの中に組織の変形は、最もよくイオン チャンネル受容体蛋白質を表現する皮膚に埋め込まれた特殊な受容細胞によって検出されます。タッチと痛みの間にイオン チャネル活性化への力覚のリンク手順が完全に理解されていません。さらに少ないは、皮膚組織が機械的変形、メカノレセプターがひずみの変化を検出するかどうかをフィルターか1,2,3のストレスについて知られています。一部、このギャップの理解では、生きている動物の皮の表面に細胞レベルで反応を観察しながら正確な機械的刺激を適用する適切なツールの欠如から発生します。適用し、隔離されたセル4,5で力を測定してもリビングの Piezo1 受容体を有効にして、原子間力顕微鏡を広く使用されているに対し細胞6、特に生きている動物を使用して同様の実験は、 線虫、被写体の本質的なモビリティのために悪名高く挑戦されています。この挑戦は、伝統的寒天パッド1,7,8,9の個々 の動物を固定する獣医または手術用シアノアクリ レート系接着剤を使用して回避します。このアプローチは、生産されているが、接着剤と機械的コンプライアンスの軟寒天培地表面固定化に必要なスキルに関連する制限があります。マイクロ流体戦略は、接着にリンクされている合併症のいくつかを回避する無料の代替です。

線虫は動物のサイズのために、マイクロ流体技術のためのよい適合をある完全にマップされた神経系の遺伝モデル生物です。マイクロ ベースのデバイスは高分解能イメージングと関連する神経調節刺激の配信を行いながらそれ以外の場合非常にモバイルの動物を抑制できるという利点を提供しています。マイクロ流体の助けを借りて技術、動物の生活は害10,11, 生涯12,13上行動活動の監視と高解像度を実現することがなく固定化することができます。神経活動14,15,16,17のイメージング。さらに、タッチと痛みの感覚は、生理1,8、機械式4,18,19、特徴付けることができるために必要な多くの受容ニューロン分子レベル20,21,22

線虫 c. エレガンス6 TRNs、動物の前部 (ALML/R と AVM) を支配する 3 つのうち、3 つは動物の後部 (PLML/R と PVM) を支配するを使用してその体壁に穏やかな機械的刺激を感覚します。生化学的信号に適用された力の伝達に必要なイオン チャネル分子は TRNs8で幅広く研究されています。本稿では正確な機械力を固定化c. の elegansの皮膚に適用する研究者を可能にするマイクロ流体プラットフォーム23回虫、光イメージングによるその内部組織の変形を読みながら。明確に定義された機械的刺激を提示に加えてカルシウム トランジェントを受容ニューロン細胞レベル下の解像度で記録し、形態学的および解剖学的機能と相関できます。デバイスは、単一の動物を保持し、その皮膚 (図 1および図 2) 六つの空気圧アクチュエータのチャンネルの横にあるを示す中央トラップ チャネルで構成されます。六つのチャンネルは、各ワームの 6 TRNs に機械的刺激を提供するトラップ チャネルに沿って配置されます。これらのチャネルは、薄い PDMS のダイヤフラムがあり、外部の空気圧力源 (図 1) によって駆動することができますでトラップ室から区切られます。圧力に対する変形を校正この記事で測定を提供しています。各アクチュエータは、個別に対処し、好みの受容を促進するために使用できます。ピエゾ駆動圧力ポンプを使用して圧力を配信、任意の代替デバイスを使用できます。TRNs体内をアクティブにし、大人の線虫に機械的刺激を提供する、デバイスに大人動物の読み込み、カルシウム イメージングを実行する適切な操作装置を示す圧力プロトコルを使用できることを示す実験と結果の分析します。デバイスの作製は、2 つの主な手順で構成されています: 1) SU-8; から金型を作るフォトリソグラフィー・ 2) デバイスにする PDMS を成形します。簡潔、明瞭のために以前に公開された記事およびプロトコル24,25金型とデバイスを生成する方法について読者が呼ばれます。

Protocol

1. デバイスの作製 (補足ファイル 1) 添付マスク ファイルをダウンロードし、商業サービスや社内施設使用クロム マスクを生成します。デバイスの最小寸法は、10 μ m (膜厚アクチュエータ) は、マスク機能を確実に生成するの十分に高い解像度、± 0.25 μ m 以内をいるを確認します。 標準の SU 8 写真平版方法に従って (例えば、24を参?…

Representative Results

SU 8 リソグラフィとチップ接合リソグラフィ プロトコルと PDMS 成形標準的な手順に従います。詳細は23,24,25,26他の場所で見つけることができます。PDMS は硬化後問題なくウェーハをはがします必要があります。PDMS 剥離中に SU 8 機能をはぎ取る、SU 8 接着層?…

Discussion

このプロトコルは、マイクロ流体チップの中に閉じ込め回虫の皮膚に正確な機械的刺激を提供する方法を示します。それは生物的質問に答えるための物理的な刺激の統合を容易にするものです、メカノバイオロジー研究生物ラボでの効率化を目指します。このメソッドは、線虫の機械刺激受容ニューロンの機能を評価するために前の試金を拡張します。以前の定量的、半定量的な手法?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 はサンドラ N. Manosalvas-Kjono、プリム Ladpli に感謝、ファラー Memon、Divya Gopisetty、ヴェロニカ ・ サンチェスのサポート デバイス設計、変異動物の世代。この研究はサポートされている NIH 助成金 R01EB006745 (BLP)、(MBG) に R01NS092099、K99NS089942 (MK) に、(ALN) を F31NS100318、受信した欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金調達のプログラム (付与契約号 715243 MK)。

Materials

Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric – imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter

References

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Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).

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