Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة لتصوير المتزامن ثالاموكورتيكال إكسون المتفرعة والمشبك تكوين في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المهاد وقشرة الدماغ. محاور عصبية ثالاموكورتيكال الفردية وعلى محطات presynaptic هي تصور بتقنية انهانسر خلية مفردة مع دسريد وسينابتوفيسين معلم التجارة والنقل.
Abstract
تشكيل المتفرعة والمشبك إكسون هي العمليات الحاسمة لإنشاء دوائر الخلايا العصبية الدقيقة. خلال التنمية، وتشكل محاور عصبية حسية ثالاموكورتيكال (TC) فروع ونقاط الاشتباك العصبي في طبقات معينة من قشرة الدماغ. على الرغم من المكانية علاقة متبادلة واضحة بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك، هو غير مفهومة العلاقة السببية بينهما. لمعالجة هذه المسألة، ونحن مؤخرا بوضع طريقة لتصوير المتزامن لتشكيل محاور عصبية TC الفردية في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المتفرعة والمشبك.
ويصف هذا البروتوكول أسلوب الذي يتكون من مجموعة من كوكولتوري أورجانوتيبيك وانهانسر. كوكولتوريس أورجانوتيبيك من قشرة الدماغ والمهاد يسهل التلاعب بالجينات ومراقبة العمليات محواري، الحفاظ على هياكل مميزة مثل تكوين الصفحي. والبلازميدات مميزة اثنين ترميز دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) تم transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك بأسلوب انهانسر. هذه الطريقة سمحت لنا بتصور مورفولوجيس محواري الفردية TC الخلايا العصبية ومواقعهم بريسينابتيك في وقت واحد. كما مكن الأسلوب المراقبة الطويلة الأمد التي كشفت عن العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
Introduction
الإسقاط ثالاموكورتيكال (TC) في الدماغ الثدييات نظام مناسب للتحقيق في إرشادات إكسون واستهداف الآليات. خلال التنمية، وتنمو الحواس TC محاور عصبية في لوحة القشرية، وفروع النموذج ونهايات تفضيلي في طبقة الرابع الابتدائي المناطق الحسية في قشرة الدماغ1،2. حتى بعد إقامة اتصالات أساسية، يتم تشكيلها محواري العرش ومحطات متشابك تبعاً للتغيرات البيئية3،4. ومع ذلك، غير هو مفهومة كيف يتم تبديل مورفولوجيا إكسون TC بشكل حيوي. أحد الأسباب الرئيسية هو عدم وجود أسلوب كافية لمراقبة التغيرات الهيكلية على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري، مثل الفحص المجهري اثنين-فوتون، السماح للمراقبة المباشرة لمعيشة الخلايا العصبية القشرية في فيفو، هناك قيود لا تزال التقنية للالتقاط الإجمالي TC المسارات5، 6-ولذلك، أساليب في المختبر لتصوير مباشر من محاور عصبية TC سيوفر أدوات قوية لتحليلات الهيكلية لتشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
مجموعتنا للمرة الأولى إنشاء أسلوب ثقافة شريحة ثابتة مع نفاذية الأغشية7. باستخدام هذا الأسلوب، كان كوكولتوريد شريحة القشرية الفئران مع كتلة ثالاميك حسية، وقد لخص الصفيحة الخاصة TC اتصالات في هذا7،كوكولتوريس أورجانوتيبيك8. كذلك وسم متفرق مع بروتين فلوري سمح لنا بمراقبة نمو إكسون TC وفرع تشكيل9،،من1011. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتصوير المتزامن التفريع والمشبك تشكيل محاور عصبية TC الفردية في أورجانوتيبيك كوكولتوريس12. تصور TC محاور عصبية ومواقع بريسينابتيك في نفس الوقت، كانت دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك انهانسر كوكولتوري أورجانوتيبيك. الأسلوب الحالي يسهل تحليل الخصائص المورفولوجية لمحاور عصبية TC ويسمح بالمراقبة الطويلة الأجل، التي يمكن أن تستخدم لإظهار العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجان رعاية الحيوان من جامعة أوساكا وجمعية علم الأعصاب اليابان.
1-أورجانوتيبيك كوكولتوريس من قشرة الدماغ والمهاد
ملاحظة: للإجراءات المفصلة، الرجوع إلى الأصل المنشورات7،،من813. وينبغي إجراء جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة. وتستخدم الفئران سبراغ داولي (SD) للثقافات العصبية.
-
الأعمال التحضيرية كواشف
ملاحظة: وحدات التخزين من الكواشف التالية لأحد الفئران الدماغ.- تحضير 10 × معدلة N2 الملحق 13: الأنسولين (50 ميكروغرام/مل)، البروجسترون (200 nM)، الهيدروكورتيزون (200 nM)، سيلينيت الصوديوم (300 نانومتر)، ترانسفيرين (1 ملغ/مل)، بوتريسسيني (1 ملم)، والسكر (60 ملغ/مل)
- تحضير المحتوية على مصل الثقافة المتوسطة (10 مل): 85% DMEM/F12، 10% x 10 تعديل N2 الملحق، 5% مصل بقرى الجنين (FBS)
- تحضير المصل خالية الثقافة المتوسطة (20 مل): 90% DMEM/F12، 10% x 10 تعديل N2 الملحق
- إعداد الفئران الذيل الكولاجين الحل (0.5 مل). وباختصار، تأخذ الألياف العطاء من ذيل جرذ تحت ظروف معقمة واحتضانها في حل حامض الخليك بين عشية وضحاها. بعد الطرد المركزي، جمع المادة طافية (بضعة ملغ/مل) وتخزينها في ثلاجة13.
-
إعداد أطباق الثقافة
- مكان إدراج غشاء إلى 35 مم طبق بيتري.
- إضافة 40-50 ميكروليتر من الفئران الذيل الكولاجين حل للغشاء، ونشر الحل الكولاجين حول المركز.
- الهواء الجاف للغشاء تماما في هيئة نظيفة.
- وضع 1.5-2 مل مستنبت المحتوية على مصل في الطبق، حيث أن الغشاء يتم استيعابه بالمتوسط.
- ضع الصحن الثقافة في حاضنة (37 درجة مئوية والهواء 95% هوميديفيد 5% CO2) قبل الطلاء.
-
إعداد شرائح القشرية
- تعقيم كل الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق أو أطول.
- تشريح الدماغ كله بسرعة من يوم الولادة (ف) 2 الجرذ تحت التخدير المثلج (منغمسين في رقاقات الثلج لبضع دقائق).
- مكان الدماغ إلى 100 مم طبق بتري يحتوي على 100 مل من البرد هانكس متوازنة الحل الملح.
- إزالة الأمر بيا من الدماغ مع الملقط غرامة، وقطع شرائح القشرية (300-400 ميكرومتر سمك) من القشرة البصرية وسوماتوسينسوري مع مقص ميكروسورجيكال (للاطلاع على التفاصيل، انظر الشكل 1).
ملاحظة: وتقدر حجم الشبكات تحت مجهر تقريبا سمك شرائح القشرية.
ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء شرائح القشرية مع فيبرتوم تحت ظروف معقمة. - نقل بضع شرائح القشرية على إدراج غشاء مع ماصة بلاستيك القابل للتصرف.
- ضبط مواقف الشرائح قرب المركز لإدراج الثقافة مع ماصة باستور مصقول النار (لمزيد من التفاصيل، انظر8،13) وإزالة الزائدة المتوسطة من الإدراج.
ملاحظة: ضبط مستوى المتوسط قليلاً تحت سطح الشرائح الشرائح من تلقي إمدادات كافية من الغاز والمتوسطة على السواء. وهذا أمر حاسم لبقاء الخلية. - المحافظة على الشرائح في المتوسط الثقافة المحتوية على مصل في 37 درجة مئوية في بيئة هوميديفيد 95% الهواء و 5% CO2، والثقافة وحدها لمدة يوم واحد قبل أن يتم أخذ كتلة ثالاميك ووضع بجوار ذلك.
-
إعداد كتل ثالاميك
- تعقيم كل الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق أو أطول.
- تخدير الفئران حوامل (الجنينية يوم 15) عن طريق الحقن داخل من بينتوباربيتال (50 مغ/كغ) التي تحتوي على مخدر.
- تشريح الجنين كل من قرون الرحم، ووضع الأجنة في 100 مم طبق بتري يحتوي على 100 مل من محلول ملح متوازن الباردة هانكس.
- تحت مجهر، إزالة الدماغ من كل جنين وقص كتل ثالاميك التي تحتوي أساسا على نواة يتناول المعقدة والجانبية (حوالي 0.5 ملم × 3) فينتروباسال7 باستخدام مقص ميكروسورجيكال (انظر الشكل 1).
-
الثقافة والمحافظة على كوكولتوريس أورجانوتيبيك
- استخدام ماصة باستور، وضع كتلة ثالاميك بجوار سطح البطين الشريحة القشرية التي وضعت على تصفية الأغشية.
- الحفاظ على كوكولتوريس في الأجلين المتوسط والثقافة التي تحتوي على مصل في 37 درجة مئوية في بيئة هوميديفيد 95% الجوية و شركة 5%2.
- تبادل نصف المتوسط مع المتوسط ثقافة خالية من المصل بعد يومين في الثقافة. وبعد ذلك، تبادل المتوسطة كل 2-3 أيام.
ملاحظة: يجب التحقق من مستوى المتوسط بعد تبادل المتوسطة، كما أنه من المهم لبقاء الخلية.
2-انهانسر
وينبغي إجراء جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة.
ملاحظة: أداء انهانسر يوم واحد بعد إعداد كتل ثالاميك لمنع انفصال كتل.
-
البلازميدات
- جعل مزيج البلازميدات كما يلي: بكاجس-دسريد 2 ميكروغرام/ميكروليتر؛ بكاج-ليرة سورية-اجفب 3، 5 ميكروغرام/ميكروليتر.
ملاحظة: تنقية والبلازميدات كلا استخدام مجموعة ماكسيبريب خالية من الذيفان وتذوب في حل هانكس ملح متوازن.
- جعل مزيج البلازميدات كما يلي: بكاجس-دسريد 2 ميكروغرام/ميكروليتر؛ بكاج-ليرة سورية-اجفب 3، 5 ميكروغرام/ميكروليتر.
-
إعداد المعدات انهانسر
يجب أن تكون متصلاً الأجهزة الكهربائية مثل مشجعا وعازل كما هو مبين في الشكل 2.- قم بتوصيل مشجعا في المعزل ثنائية الطور.
- الاتصال قطب كهربائي (سلك فضة قطرها 0.2 مم) إلى محطة سلبية للمعزل.
- الاتصال قطب كهربائي (سلك فضة قطرها 1 مم) في سلسلة إلى مقاوم Ω 100 ومحطة إيجابية للمعزل.
- قم بتوصيل مكبر للصوت للذبذبات لرصد ما إذا كان يتم تمرير تيارات كهربائية عبر المقاوم طريق قياس الجهد مع مكبر للصوت.
-
إعداد الماصات الزجاجية
ملاحظة: تستخدم نوعين من الماصات الزجاجية لقذف الحل بلازميد والتطبيق للنبضات الكهربائية.- جعل الماصات من الزجاج الشعيرات الدموية مع ساحبة كهربائي.
- كسر التلميح ماصة قذف (يجب أن يكون القطر نصيحة 20-50 ميكرومتر).
- طحن وتلميع غيض ماصة قطب كهربائي مع الصنفرة متبوعاً بالنار وتلميع (يجب أن يكون القطر الداخلي 50-200 ميكرومتر).
ملاحظة: ينبغي أن يكون تلميح قطب كهربائي مسطحة وناعمة، كما أنها تمس مباشرة الأنسجة.
-
الداخلي انهانسر
- الاتصال الماصات قذف وقطب كهربائي المتلاعبين.
- إدراج ماصة قطب كهربائي سلك فضة (0.2 مم).
- إرفاق ماصة قذف بحقنه 1 مل مع أنبوب بلاستيكي.
- تناول > 5 ميكروليتر الحل بلازميد إلى ماصة قذف بشفط المحاقن.
- وضع كوكولتوري في مرحلة انهانسر، وإدراج مسرى قطره 1 مم في المتوسط الثقافة.
- ضع ماصة قذف على اكسبلانت ثالاميك.
- دفع المحاقن يدوياً بعد التلميح يمس سطح كتلة ثالاميك.
ملاحظة: حول ميكروليتر 0.5 بلازميد عادة ما تستخدم حل كل كتلة ثالاميك واحد. - ضع ماصة القطب على كتلة ثالاميك فورا بعد سحب ماصة الإخراج.
- توصيل النبضات الكهربائية (50-400 μA، القطارات 3 إلى 5 نبضات مربعة 200 1 المدة مرض التصلب العصبي المتعدد في 200 هرتز). رصد السعة وعدد القطارات على الذبذبات.
ملاحظة: السعة للتيارات الكهربائية يعتمد على القطر الداخلي ماصة مسرى13. - سحب ماصة القطب والعودة الطبق إلى الحاضنة.
-
الملاحظة المجهرية
- وضعت الطبق الثقافة في مرحلة مجهرية مجهر [كنفوكل] تستقيم مزودة بمجموعتين من تصفية اجفب (الإثارة، 488 نانومتر؛ والانبعاثات، 515 نانومتر) ودسريد (الإثارة، 514 نانومتر؛ والانبعاثات، 565 نانومتر).
- التقاط صور لمقاطع 10-25 بصري في أحجام ميكرومتر-الخطوة 1-7 مع عدسة هدف مسافة طويلة-عامل X 20. تحديد محاور عصبية مسماة يمكن تمييزها على حدة التي تعبر عن كل من دسريد واجفب ليرة سورية.
ملاحظة: منطقة الملاحظ حوالي 0.7 x 0.7 مم (المقابلة إلى 1024 × 1024 بكسل، أي، بيكسل ميكرومترات 0.68). - التقاط الصور كل 24 ساعة للتصوير اليومي. إكمال داخل 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والعودة الثقافات للحاضنة. للتصوير بمرور الوقت الفاصل الزمني القصير، تبقى الثقافة في دائرة ثقافة، التي تحافظ البيئة من هوميديفيد 95% الهواء و 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ووصف التجربة هنا يهدف إلى الكشف عن العلاقة بين تشكيل المتفرعة والمشبك إكسون TC. في نفس الوقت تصور مسارات محواري وموقعا من مواقع presynaptic، واحد أو عدد قليل من الخلايا ثالاميك في كوكولتوريس أورجانوتيبيك تم transfected مع اثنين والبلازميدات ترميز اجفب ليرة سورية ودسريد باستخدام انهانسر. خلال الأسبوع الثاني في الثقافة، كانت المسمى محاور عصبية TC منفردة يمكن تمييزها بوضوح قبل دسريد (الشكل 3). واختيرت محاور عصبية التي عرضت دسريد واجفب ليرة سورية فقط للمراقبة. محاور عصبية TC المسمى غزت شريحة القشرية، وشكلت فروع أساسا في الطبقات العليا، مشيراً إلى أن محاور عصبية ثالاميك في أورجانوتيبيك كوكولتوريس فروع النموذج مع خصوصية الصفحي تشبه التي وجدت في فيفو7، 8،،من1014،15،،من1617. في الوقت نفسه، يمكن ملاحظة المجموعات الشروريه لليرة سورية--اجفب (بونكتا اجفب ليرة سورية) على طول محاور عصبية TC المسمى دسريد (الشكل 3د-3F). منذ هذه بونكتا اجفب ليرة سورية كانت في معظمها كولوكاليزيد مع إشارات إيمونوبوسيتيفي VGLUT2، وعلامة بريسينابتيك للخلايا ثالاميك، و PSD95، وعلامة بوستسينابتيك عامة، فمن المحتمل أن بونكتا اجفب ليرة سورية ومعظمها تمثل presynaptic مواقع في محاور عصبية ح12.
الوقت الفاصل بين التصوير من محاور عصبية TC كما أظهرت أن إكسون المتفرعة وتشكيل المشبك من الخلايا العصبية ثالاميك كانت مستمرة ودينامية مع إضافة وإزالة (الشكل 4)12. وعلاوة على ذلك، تم العثور على معظم فروع الخروج من بونكتا اجفب ليرة سورية، مشيراً إلى أن مواقع presynaptic يؤدي تشكيل فرع (لمزيد من التفاصيل، انظر12).
الشكل 1 . الإجراءات المتعلقة بإعداد كوكولتوريس أورجانوتيبيك قشرة الدماغ والمهاد. (أ) عرض أعلى من دماغ الفئران حديثي الولادة. أول خطوة من نوعها تتم موازية لخط الوسط (1). 300-ثم يتم قطع المقاطع الاكليلية 500 ميكرومتر-سميكة من القشرة الأولية somatosensory والبصرية (2). وأخيراً، جعل باراساجيتال قطع للحصول على شرائح القشرية (3). (ب) التمثيل التخطيطي من كوكولتوري أورجانوتيبيك قشرة الدماغ والمهاد. يتم كوكولتوريد القشرية شرائح من الفئران 2 يوم بعد الولادة وكتل ثالاميك من الجنينية يوم 15 على تصفية الأغشية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الرسم تخطيطي للأجهزة الكهربائية انهانسر. وترتبط مشجعا والمعزل ماصة القطب في سلسلة. لتسليم مشحونة سلبا على الحمض النووي، متصل ماصة مسرى المحطة السلبية للمعزل. يمكن رصد التيارات الكهربائية انهانسر مع الذبذبات. TH: المهاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . محاور عصبية ثالاموكورتيكال في كوكولتوري بعد 2 أسابيع في الثقافة- (ومنألف–) كوكسبريشن اجفب ليرة سورية مع دسريد في إكسون ثالاموكورتيكال (TC). وأدخلت في استزراع خلايا ثالاميك في يوم واحد في المختبر (DIV) استخدام انهانسر البلازميدات دسريد بالإضافة إلى اجفب ليرة سورية. (أ) كوكولتوري أورجانوتيبيك شرائح ثالاميك والقشرية بعد الدرجة (ب) 12 المسمى "دسريد" خلية ثالاميك تمتد محور عصبي داخل الشريحة القشرية وأشكال فروع في الطبقات العليا. (ج) صورة مكبرة للمنطقة محاصر في (أ). (د-و) تظهر TC المسمى دسريد إكسون (د) وليرة سورية-اجفب بونكتا (ه) في منطقة محاصر في (ج). ولوحظ تراكم منفصلة من اجفب ليرة سورية على طول إكسون TC واحد. Th: المهاد. تغيير حجم أشرطة: (ب) 1 مم، (ج) 100 ميكرومتر، (و) 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الوقت الفاصل بين التصوير من إكسون ثالاموكورتيكال الإعراب عن اجفب ليرة سورية ودسريد في كوكولتوري أورجانوتيبيك- استخدام انهانسر دسريد بالإضافة إلى اجفب ليرة سورية والبلازميدات أدخلت في استزراع خلايا ثالاميك في الدرجة 1. هذا إكسون تم تصويرها يوميا على مدى 4 أيام (DIV 11 إلى 14 DIV). شريط الحجم: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الحالي أيضا أداة قوية لدراسة الجوانب الإنمائية لتزايد محاور عصبية أخرى غير إسقاط ح11. على سبيل المثال، يسمح الجمع بين الثقافة شريحة القشرية وتقنية انهانسر تصور مورفولوجيا محواري الفردية من الخلايا العصبية القشرية وطويلة الأجل الملاحظة9،18.
باستخدام البروتوكول الحالي، يمكن أيضا أن تحلل أدوار الجينات مثيرة للاهتمام في تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك بالتعبير المشارك من البروتينات الفلورية والجينات الفائدة. عادة، ما يزيد على 90 في المائة خلايا البروتينات الفلورية وإذ تعرب عن هي شاركت transfected مع بلازميد ثانية عندما يتم ضبط نسبة الحلول بلازميد المولى إلى18،1:219. بيد أن النسبة المثلى قد تكون مختلفة كفعالية تعداء المشارك ومستوى التعبير وتتنوع بين ناقلات.
على الرغم من أن البروتوكول الحالي تتسم بالكفاءة لإجراء التجارب على مرور الزمن، وهناك بعض المشاكل التقنية. لتصوير يوميا، انصب كوكولتوري على مرحلة مجهرية كل يوم. على الرغم من أن التنمية محواري لا يبدو أن تتأثر جديا ب التصوير يوميا10، كل ملاحظة ينبغي أن تكتمل في غضون 10 دقيقة لتقليل التبخر حل الثقافة والتغيرات في درجة حموضة المتوسط الثقافة. وبدلاً من ذلك، سيكون من الأفضل للحفاظ على الحرارة والرطوبة والرقم الهيدروجيني للثقافات على المرحلة مجهرية12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أيضا اليد غابرييل لقراءة نقدية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
