분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성
Summary
이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.
Abstract
축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 하는 정확한 신경 회로 설정 하기 위한 중요 한 프로세스입니다. 개발 하는 동안 감각 thalamocortical (TC) 축 삭 대뇌 피 질의 특정 레이어에 지점과 시 냅 스 형성합니다. 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이 명백한 공간 상관 관계에도 불구 하 고 그들 사이의 인과 관계가 제대로 이해 된다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 최근 organotypic cocultures에서 개별 TC 축 삭의 분기 및 시 냅 스 대형의 동시 이미징 방법을 개발.
이 프로토콜 organotypic coculture 및 electroporation의 조합으로 구성 되는 방법을 설명 합니다. 시상과 대뇌 피 질의 Organotypic cocultures 유전자 조작 및 axonal 프로세스, 박판 모양 구성 등 독특한 구조를 보존의 관측을 촉진 한다. 두 가지 플라스 미드 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 인코딩 했다 electroporation 기술에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 이 메서드를 사용 하 여 TC 뉴런의 개별 axonal 형태학 및 연 접 사이트를 동시에 시각화 수 있었습니다. 메서드는 또한 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 밝혀 장기 관찰을 사용할 수 있습니다.
Introduction
포유류 두뇌에 있는 thalamocortical (TC) 투영 축 삭 지도 메커니즘을 대상으로 조사에 적합 한 시스템입니다. 개발 하는 동안 감각 TC axons 외피 격판덮개 및 양식 지점과 시 냅 스에 우선적으로 레이어 IV의 대뇌 피 질1,2차 감각 영역에서 성장 한다. 근본적인 연결의 설립 후에 axonal 아 버와 시 냅 스 터미널은 환경 변화3,4에 따라 리 모델링. 그러나, 어떻게 TC 축 삭 형태학 동적으로 변경 되는 제대로 이해. 주된 이유 중 하나는 단일 세포 수준에서 구조적인 변화를 관찰 하는 적절 한 기법의 부족 이다. 전반적인 TC 궤적5, 을 캡처에 대 한 여전히 기술적인 제한이 있다 현미경 검사 법, 2 광자 현미경 등 최근 개발 허용 생활 대뇌 피 질의 뉴런에 vivo에서의 직접 관찰, 비록 6. 따라서, TC 축 삭의 라이브 이미징 방법 체 외에서 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 구조 분석을 위한 강력한 도구를 제공 것.
처음으로 우리 그룹 설립 투과성 막7정적 슬라이스 문화 방법. 이 방법을 사용 하 여, 쥐 대뇌 피 질의 조각 했다 감각 thalamic 블록, cocultured 그리고 lamina 특정 TC 연결 했다이 organotypic cocultures7,8지. 형광 단백질으로 스파스 라벨 추가 수 있었습니다 TC 축 삭 성장 및 지점 형성9,,1011관찰. 최근에, 분기의 동시 이미징에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다 그리고는 organotypic에서 개별 TC 축 삭 시 냅 스 형성 cocultures12. TC 축 삭과 연 접 사이트를 동시에 시각화할 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 했다 organotypic coculture의 electroporation에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 현재 메서드는 TC axons의 형태소 분석을 용이 하 게 하 고 장기 관찰, 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 표시 하는 데 사용할 수 있습니다 허용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 또한 TC 프로젝션11의 다른 축 삭 성장 발달 측면을 연구 하는 강력한 도구입니다. 예를 들어, 대뇌 피 질의 조각 문화와 electroporation 기술은의 조합을 대뇌 피 질의 신경 세포와 장기 관찰9,18의 개별 axonal 형태를 시각화 수 있습니다.
현재 프로토콜을 사용 하 여 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성에 흥미 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 또한 중요 한 독서에 대 한 가브리엘 손을 감사합니다.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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