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Neuroscience

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/56553
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University, 2Neuroscience Laboratories, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Summary

このプロトコルでは、視床皮質軸索分岐およびシナプス形成の脊髄共培養系における視床と大脳皮質の同時イメージング法について説明します。個々 の視床皮質軸索とその神経終末は、下流と GFP タグ シナプトフィジン単細胞エレクトロポレーション法による可視化します。

Abstract

軸索分岐とシナプスの形成は、精密な神経回路を確立するための重要なプロセスです。開発中には、感覚視床皮質 (TC) 軸索は大脳皮質の特定のレイヤーで枝とシナプスを形成します。にもかかわらず、軸索分岐とシナプス形成間明白な相関、因果関係はよくわかっていません。この問題に対処するため、我々 は最近脊髄共培養系における軸索 TC 個々 の分岐とシナプス形成の同時イメージング法を開発しました。

このプロトコルでは、切片培養とエレクトロポレーションの組み合わせから成っている方法について説明します。層構成などの特徴的な構造を維持する軸索のプロセスの遺伝子操作と観測の視床と大脳皮質脊髄共培養系を促進します。エンコードした DsRed と EGFP タグ シナプトフィジン (SYP EGFP) 2 つの明瞭なプラスミドはエレクトロポレーション法による視床のニューロンの数が少ないに cotransfected だったこのメソッドでは、個々 の軸索組織の TC ニューロンとシナプス前サイトを同時に可視化することができました。メソッドには、軸索分岐およびシナプス形成の因果関係を明らかにした長期的な観測も有効になります。

Introduction

哺乳類の脳 (TC) 視床皮質投射は、軸索ガイダンスとターゲットのメカニズムを検討する適切なシステムです。開発時に TC の感覚軸索は皮質骨板やフォーム枝や大脳皮質1,2の一次感覚野のシナプスで優先的に層 IV で育ちます。基本的な接続の確立後も環境の変化3,4によって軸索のアーバーおよびシナプス終末が改造されています。ただし、TC 軸索形態を動的に変更する方法がよくわかっていません。主な理由の 1 つは、単一細胞レベルでの構造変化を観察する適切な方法がないです。2 光子顕微鏡などの顕微鏡の最近の進歩は、生活皮質ニューロンの生体内での直接観測を許可している、全体的な TC の軌跡5,をキャプチャするためまだ技術的な限界があります。6。 したがって、体外TC 軸索のライブ イメージング法は、軸索分岐およびシナプス形成の構造解析のための強力なツールを提供します。

初めて私たちのグループは、透過膜7静的スライス培養法を設立しました。このメソッドを使用すると、ラット脳スライスされた感覚視床ブロックと遊走し、ラミナ特異 TC 接続されたこの脊髄共培養系7,8で締めくくっています。蛍光タンパク質を持つスパース ラベリングさらに TC の軸索の成長や枝の形成9,10,11を観察するができました。最近では、我々 は分岐の同時可視化手法を開発しているし、切片における個々 の TC の軸索のシナプス形成 cocultures12。TC 軸索およびシナプス前のサイトを同時に視覚化するには、下流と EGFP タグ シナプトフィジン (SYP EGFP) は切片培養電気穿孔法による視床のニューロンの数が少ないに cotransfected でした。現在のメソッドは TC 軸索の形態素解析を容易に、軸索分岐およびシナプス形成の因果関係を示すため使用できます長期観察できます。

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Protocol

すべての実験は、大阪大学・日本神経科学学会動物愛護委員会によって確立されたガイドラインに従って行われました。

1. 脊髄共培養系視床と大脳皮質の

メモ: 手順については、オリジナルの出版物7,8,13を参照してください。すべてのプロシージャは、無菌条件の下で行わなければなりません。Sprague-dawley (SD) ラットは、神経細胞の培養に使用されます。

  1. 試薬の調製
    注:次の試薬のボリュームは、1 匹のラット脳です。
    1. 変更された N2 サプリメント x 10 の準備13: インスリン (50 μ g/mL)、プロゲステロン (200 nM)、ヒドロコルチゾン (200 nM)、亜セレン酸ナトリウム (300 nM)、トランスフェリン (1 mg/mL)、プトレシン (1 mM)、グルコース (60 mg/mL)
    2. 準備血清を含む培(10 mL): 85 %dmem/f12 キー、変更 10 x N2 サプリメントは 10%、5% ウシ胎児血清 (FBS)
    3. 準備無血清培(20 mL): 90 %dmem/f12 キー、10% 変更 10 x N2 サプリメント
    4. ラット尾コラーゲン溶液0.5 mL を準備します。簡単に言えば、無菌条件下でのラットの尾からの柔らかい繊維を取り、酢酸溶液で一晩インキュベートします。遠心分離の後上澄み (数 mg/mL) を集め、冷蔵庫13します。
  2. 培養皿の準備
    1. 35 mm のペトリ皿に膜挿入を配置します。
    2. 膜にラット尾コラーゲン溶液の 40-50 μ L を追加し、中心の周りのコラーゲン ソリューションを普及します。
    3. 空気は、クリーン ベンチで完全に膜を乾燥させます。
    4. 膜媒体でビショビショですように、皿に 1.5-2 mL の血清を含む培養液を置きます。
    5. めっき前にインキュベーター (37 ° C、加湿の 95% の空気と 5% CO2) で培養皿を配置します。
  3. 皮質の準備
    1. 10 分以上、70% エタノールですべての手術器具を滅菌します。
    2. 生後 (P) 2 からすぐに全脳を解剖 (氷片に数分間浸漬) 冷たい麻酔下ラット。
    3. 場所を 100 mm ペトリ皿冷たいハンクスの 100 mL を含む脳は平衡塩類溶液です。
    4. 微細鉗子で脳から pia 問題を削除し、顕微鏡下のハサミで視覚と体性感覚野から皮質スライス (300-400 μ m 厚) をカット (詳細については、図 1を参照)。
      注:双眼顕微鏡の下のグリッドのスケールでは、皮質の厚さはおよそ。
      注:また、皮質無菌条件下で vibratome を作ることができます。
    5. 使い捨てプラスチック ピペットと膜挿入にいくつかの皮質スライスを転送します。
    6. (詳細についてを参照してください8,13) 火磨かれたパスツール ピペットで文化挿入の中心近くスライスの位置を調整し、挿入から余分なメディアを削除します。
      注:スライスは、ガスとメディアの両方の十分な供給を受信できるように、スライスの表面の下にわずか媒体のレベルを調整します。これはセル実行可能性にとって重要です。
    7. 視床のブロックを取られ、それの隣に置かれた前に 1 日だけで加湿の 95% 空気と 5% CO2と文化の環境で 37 ° C で血清を含む培地のスライスを維持します。
  4. 視床のブロックの準備
    1. 10 分以上、70% エタノールですべての手術器具を滅菌します。
    2. ペントバルビ タール (50 mg/kg) を麻酔薬の入った腹腔内投与による妊娠ラット (15 日) の麻酔します。
    3. 子宮角からそれぞれの胚を解剖し、100 mm ペトリ皿冷たいハンクス平衡塩溶液の 100 mL を含む胚を配置します。
    4. 双眼顕微鏡の下でそれぞれの胚から脳を削除し、核複雑と外側膝状体 (約 0.5 mm × 3)7 (図 1参照) 顕微鏡のはさみを使用してを含む主に視床のブロックをカットします。
  5. 文化し、脊髄共培養系を維持
    1. パスツール ピペットを使用して、メンブラン フィルター上に配置されている皮質スライスの心室の表面の横にある視床ブロックを配置します。
    2. 加湿の 95% の空気と 5% CO2の環境で 37 ° C で血清を含む培地の共培養系を維持します。
    3. 2 日間の培養後培養の無血清培地での培地の半分を交換します。その後、2 〜 3 日ごと媒体を交換します。
      注:媒体のレベルは、細胞の生存のために重要であるメディア交換後チェック必要があります。

2. エレクトロポレーション

すべてのプロシージャは、無菌条件の下で行わなければなりません。

注:エレクトロポレーション 1 日後、ブロックの離脱を防ぐために視床のブロックの準備を実行します。

  1. プラスミド
    1. プラスミドの混合物を次のようにすること: pCAGGS 下流 2 μ g/μ L。pCAG-SYP EGFP の 3.5 μ g/μ l。
      注:エンドトキシン フリーの Maxiprep キットを使用して両方のプラスミッドの浄化し、ハンクス平衡塩溶液中で溶解します。
  2. エレクトロポレーション機器のセットアップ
    刺激物やアイソレータなど電気計測器は、図 2に示すように接続してください。
    1. 相性アイソレータに刺激を接続します。
    2. 電極 (銀線 0.2 mm 径) をアイソレータの負の端子に接続します。
    3. 電極 (銀線 1 mm 径) をシリーズに 100 Ω 抵抗とアイソレータの肯定的なターミナルに接続します。
    4. オシロ スコープ電流増幅器で電圧を測定することによって抵抗の両端で渡されるかどうかを監視するためにアンプを接続します。
  3. ガラス ピペットの準備
    注: ガラス ピペットの 2 種類は、プラスミド溶液の排出と電気パルスの応用に使用されます。
    1. 電極引き手とガラス管からピペットを作る。
    2. (先端径が 20-50 μ m であるべき) 放出ピペットの先端を破る。
    3. 挽くし、サンドペーパー火研磨 (内径は 50-200 μ m であるべき) 続いて電極ピペットの先端を研磨します。
      注:それ直接組織に触れると、電極先端部は平らで滑らかでをする必要があります。
  4. 電気穿孔法の手順
    1. マニピュレーターにイジェクトや電極のピペットを接続します。
    2. 電極ピペットに銀線 (0.2 mm 径) を挿入します。
    3. プラスチック製のチューブを 1 mL の注射器に取り出しピペットを取り付けます。
    4. 取る > 注射器吸引吐出ピペットにプラスミド溶液 5 μ L。
    5. エレクトロポレーション ステージ共を入れて培養培地に 1 mm 径の電極を挿入します。
    6. 視床外植体に放出ピペットを配置します。
    7. 先端が視床のブロックの表面に触れる後に注射器を手動でプッシュします。
      注:プラスミッドの 0.5 μ L についてソリューションは 1 つの視床ブロックあたり通常使用されます。
    8. イジェクション ピペットの撤回後すぐに視床のブロックに電極ピペットを配置します。
    9. 電気パルス (50-400 μ A、200 Hz で 1 ms の 200 の矩形パルスの 3 に 5 列車) を提供します。振幅とオシロ スコープの列車の数を監視します。
      注:電流の振幅は、電極ピペット13の内径に依存します。
    10. 電極ピペットを撤回し、インキュベーターに皿を返します。
  5. 顕微鏡観察
    1. EGFP の 2 つのフィルター セット装備直立した共焦点顕微鏡の顕微鏡ステージ上培養皿を置く (励起、488 nm; 排出, 515 nm) とした DsRed (励起、514 nm; 排出, 565 nm)。
    2. 10-25 光学セクション 1-7 μ m のステップ サイズ、20 X 長作動距離の対物レンズでの画像を取る。個別に区別のラベル付き軸索した DsRed、SYP EGFP の両方を表現するを選択します。
      注:観測地は約 0.7 × 0.7 mm (つまり 1024 x 1024 ピクセルに対応する、0.68 μ m/ピクセル)。
    3. 毎日イメージングのためのすべての 24 h の画像をキャプチャします。室温で 10 分間以内に完了し、インキュベーターに文化を返します。短い間隔の時間タイムラプス イメージングのための環境湿度 95% 空気と 5% CO2 37 ° C で維持する培養室で文化を維持します。

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Representative Results

ここで TC 軸索分岐とシナプス形成との関係を明らかにすることを目的に記載されているの実験。同時に脊髄共培養系における少数の視床細胞やシナプス前のサイトは、単一の場所軸索の軌跡を視覚化するには、SYP EGFP とした DsRed エレクトロポレーションを使用して 2 つのプラスミドを導入させた。文化の第 2 週の間に軸索 TC 個別に区別はっきりした DsRed (図 3) でラベル付けされました。展示した DsRed、SYP EGFP 軸索のみ観察しました。ラベル付きの TC 軸索皮質のスライスを侵略し、切片における視床軸索 cocultures生体内で7,が見つかりましたフォーム枝流の特異性に似ているとことを示す上部の層は、主に枝を形成8,10,14,15,16,17。同時にした DsRed ラベル TC 軸索 (図 3D 3 f) に沿って SYP EGFP (SYP EGFP 涙点) の点状の集計を観察できます。それは可能性が SYP EGFP 涙点ほとんどシナプス前を表すことであるこれら SYP EGFP 涙点頃視床細胞のシナプス マーカーである VGLUT2 と PSD95 は、一般的なシナプス マーカーが陽性信号をコードして, 主TC 軸索12サイト。

さらにその軸索分岐を示した TC 軸索のタイムラプス イメージングと視床のニューロンのシナプス形成された継続的な追加と除去 (図 4)12。さらに、ほとんどの支店が (詳細についてを参照してください12) 支部結成をシナプス前サイトにトリガーを示す、SYP EGFP 涙点から出現する見つかりました。

Figure 1
図 1.視床と大脳皮質の切片の共培養系の準備のためのプロシージャです。(A) 新生仔ラット脳の上面。最初のカットは、(1) 正中線と平行に行われます。その後、300 - 500 μ m 厚のコロナ セクションは一次視覚と体性感覚野 (2) からカットされます。最後に、(3) の皮質のスライスを取得するカット傍矢状洞を作る。(B) A 視床と大脳皮質の切片培養の模式図。生後 2 日目のラット脳スライスと胚 15 日目から視床のブロックは、メンブラン フィルターの遊走が。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.エレクトロポレーション用電気計測器の模式図。刺激、アイソレータ、電極ピペットを直列に接続します。負荷電 DNA を提供するため、電極のピペットはアイソレータの負の端子に接続されます。エレクトロポレーションの電流をオシロ スコープで監視できます。TH: 視床。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.培養 2 週間後共に視床皮質軸索。(A-F)(TC) 視床皮質軸索における共した DsRed と SYP EGFP の発現した DsRed プラス SYP EGFP プラスミド視床細胞 1 日体外(DIV) を使用してエレクトロポレーションで導入されました。(A) 12 部(B) A した DsRed ラベル視床細胞後視床と大脳皮質のスライス切片培養は皮質のスライスに軸索を拡張し、上層の枝を形作る。(C) (A)でボックス化された領域の拡大画像。(D-F)表示した DsRed ラベル TC 軸索(D) 、SYP EGFP 涙点(E) (C)の箱入りの地域。SYP EGFP のディスクリート蓄積は単一 TC 軸索に沿って観察されました。Th: 視床。スケール バー: (B) (C) 1 mm 100 μ m、および(F) 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.切片培養で SYP EGFP とした DsRed を表現する視床皮質軸索のタイムラプス イメージングします。した DsRed プラス SYP EGFP プラスミドは、電気穿孔法を用いた 1 DIV で視床細胞に導入されました。この軸索を毎日イメージしました 4 日間 (14 DIV に 11 部)。スケール バー: 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

現在のプロトコルはまた TC 投影11以外の軸索の成長の発達的側面を研究する強力なツールです。例えば、皮質スライス培養とエレクトロポレーション技術の組み合わせは、皮質ニューロンと長期観測9,18の個々 の軸索形態を視覚化することができます。

現在のプロトコルを使用しては、蛍光タンパク質および興味の遺伝子の共発現による軸索分岐とシナプス形成における興味深い遺伝子の役割を分析できます。通常、以上蛍光蛋白発現細胞の 90% が co transfected 第 2 プラスミド プラスミド溶液のモル比が 1:218,19に調整されます。ただし、最適な比率は共トランスフェクション効果と異なる場合があります、ベクトルの間で発現レベルはさまざま。

現在のプロトコルは効率的タイムラプスの実験のため、いくつかの技術的な問題があります。日常用、共は、毎日顕微鏡ステージ上置かれました。毎日イメージング10によって真剣に影響を受ける軸索開発いませんでしたが、各観測は培養液と培地の pH の変化の蒸発を最小限に抑えるため 10 分以内完了必要があります。また、温度、湿度、顕微鏡ステージ12の文化の pH を維持するためにより良いででしょう。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 はまた、重要な読書のガブリエルの手を感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries		 192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries		 16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

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References

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Tags

神経科学、問題 133、スライス培養、大脳皮質、視床、シナプス形成、軸索の分枝、皮質の開発、タイムラプス イメージング
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