Summary
Det här protokollet beskriver en metod för samtidig avbildning av thalamocortical axon förgrening och synapsen bildande i organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken. Enskilda thalamocortical axoner och deras presynaptiska terminaler visualiseras av en enda cell elektroporation teknik med DsRed och GFP-märkta synaptophysin.
Abstract
Axon förgrening och synapsen bildandet är avgörande processer för att fastställa exakt neuronala kretsar. Under utveckling bildar sensorisk thalamocortical (TC) axoner grenar och synapser i specifika lager av hjärnbarken. Trots uppenbara rumsliga sambandet mellan axon förgrening och synapsen bildandet, är orsakssambandet mellan dem dåligt förstått. För att lösa problemet, utvecklat vi nyligen en metod för samtidig avbildning av förgrening och synapsen bildandet av enskilda TC axoner i organotypic cocultures.
Det här protokollet beskriver en metod som består av en kombination av en organotypic coculture och elektroporation. Organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken underlätta gen manipulation och observation av axonal processer, bevara karakteristiska strukturer såsom laminar konfiguration. Två distinkta plasmider kodning DsRed och andra-taggade synaptophysin (SYP-andra) var samtidig transfekterade till ett litet antal thalamic nervceller av en elektroporation teknik. Denna metod tillät oss att visualisera enskilda axonal morfologier TC nervceller och deras presynaptiska webbplatser samtidigt. Metoden också aktiverat långsiktig observation som avslöjade orsakssambandet mellan axon förgrening och synaps bildas.
Introduction
Thalamocortical (TC) projektionen i däggdjur hjärnan är ett lämpligt system att undersöka axon vägledning och inriktning mekanismer. Under utveckling växer sensoriska TC axoner i kortikala plattan, och formuläret grenar och synapser prioriterat i lager IV av de primära sensoriska områdena i hjärnbarken1,2. Även efter etableringen av grundläggande anslutningar, är axonal arbors och synaptiska terminaler ombyggda beroende på miljöförändringar3,4. Dock är hur TC axon morfologi ändras dynamiskt dåligt känd. En av de främsta orsakerna är bristen på en lämplig teknik att iaktta strukturella förändringar på en enda cell-nivå. Även om den senaste utvecklingen inom mikroskopi, såsom 2-foton mikroskopi, har gett direkt observation av levande kortikala nervceller i vivo, finns det fortfarande tekniska begränsningar för att fånga den totala TC banor5, 6. därför in vitro- metoder för levande avbildning av TC axoner skulle ge kraftfulla verktyg för strukturella analyser av axon förgrening och synaps bildas.
Vår grupp för första gången etablerade en statisk slice kultur metod med högpermeabla membran7. Med den här metoden en råtta kortikala skiva var cocultured med en sensorisk thalamic block och lamina-specifika TC anslutningar var återgetts i detta organotypic cocultures7,8. Glesa märkning med en fluorescerande protein ytterligare tillät oss att iaktta TC axon tillväxt och gren bildandet9,10,11. Nyligen har vi utvecklat en ny metod för samtidig avbildning av förgrening och synapsen bildandet av enskilda TC axoner i organotypic cocultures12. För att visualisera TC axoner och presynaptiska platser samtidigt, var DsRed och andra-taggade synaptophysin (SYP-andra) samtidig transfekterade till ett litet antal thalamic nervceller av elektroporation av den organotypic coculture. Den nuvarande metoden underlättar Morfologisk analys av TC axoner och möjliggör långsiktig observation, som kan användas för att Visa sambandet mellan axon förgrening och synaps bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimenten utfördes enligt riktlinjer fastställda av djurskydd kommittéerna av Osaka University och Japan neurovetenskap Society.
1. Organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken
Obs: För detaljerade förfarandet, se den ursprungliga publikationer7,8,13. Alla bör utföras under sterila förhållanden. Sprague-Dawley (SD) råttor används för neuronala kulturer.
-
Preparat av reagenser
Obs: Volymer av följande reagenser är för en råtthjärna.- Förbereda 10 x modifierade N2 tillägg 13: insulin (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrokortison (200 nM), natrium selenit (300 nM), transferrin (1 mg/mL), dimetylsulfat (1 mM), glukos (60 mg/mL)
- Förbereda serum-innehållande odlingsmedium (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x modified N2 supplement, 5% fetalt bovint serum (FBS)
- Förbereda serumfritt odlingsmedium (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x modified N2 supplement
- Förbereda rat tail kollagen lösning (0,5 mL). I korthet ta anbud fibrer från en råtta svans under sterila förhållanden och inkubera i ättiksyralösning över natten. Efter centrifugering, samla supernatanten (några mg/mL) och förvaras i ett kylskåp13.
-
Beredning av kultur rätter
- Placera en membran infoga i en 35 mm petriskål.
- Tillsätt 40-50 μl av rat tail kollagen lösning till membranet och sprida kollagen lösningen runt centrum.
- Luften torr membranet fullständigt i en ren bänk.
- Sätta 1,5-2 mL odlingssubstrat som innehåller serum i skålen, så att membranet är indränkt med mediet.
- Placera kultur skålen i en inkubator (37 ° C, fuktad 95% luft och 5% CO2) före plätering.
-
Beredning av kortikala skivor
- Sterilisera alla kirurgiska instrument med 70% etanol i 10 min eller längre.
- Dissekera hela hjärnan snabbt från en postnatal dag (P) 2 råtta under iskalla anestesi (nedsänkt i is-chips i några minuter).
- Plats hjärnan till en 100 mm petriskål innehållande 100 mL kallt Hanks balanserad saltlösning.
- Ta bort pia ärendet från hjärnan med fin pincett och skär kortikala skivor (300-400 μm tjocklek) från den visuella och somatosensoriska cortexen med mikrokirurgiska saxar (för detaljer, se figur 1).
Obs: Tjockleken på kortikal skivor beräknas ungefär av omfattningen av galler under ett binokulärt Mikroskop.
Obs: Alternativt, kortikala skivor kan göras med en vibratome under sterila förhållanden. - Överföra några kortikala skivor på membran insatsen med en disponibel plast pipett.
- Justera positionerna för skivor nära stadens kultur insatsen med en eld polerade Pasteur-pipett (för detaljer, se8,13) och ta bort överflödig medium från skäret.
Obs: Justera nivån av medium strax under ytan av skivor så att skivorna kan få en tillräcklig tillgång på både gas och medium. Detta är avgörande för cellernas viabilitet. - Upprätthålla skivor i odlingsmediet serum-innehållande vid 37 ° C i en miljö av befuktade 95% luft och 5% CO2, och kultur ensam för en dag innan ett thalamic block och försätts bredvid den.
-
Beredning av thalamic block
- Sterilisera alla kirurgiska instrument med 70% etanol i 10 min eller längre.
- Söva en gravid råtta (embryonala dag 15) av intraperitoneal injektion av pentobarbital (50 mg/kg) som innehåller bedövningsmedel.
- Dissekera varje embryo från livmoderns horn och placera embryon i ett 100 mm petriskål innehållande 100 mL kallt Hanks balanserad saltlösning.
- Under ett binokulärt Mikroskop, bort hjärnan från varje embryo och skär thalamic block som innehåller huvudsakligen den ventrobasal komplexa och laterala geniculate nucleus (ca 0,5 mm x 3)7 med hjälp av mikrokirurgiska saxar (se figur 1).
-
Kultur och underhålla organotypic cocultures
- Använd en Pasteur-pipett, placera thalamic blocket bredvid ventrikulära ytan av kortikala skiva som har placerats på membranfiltret.
- Upprätthålla cocultures i odlingsmediet serum-innehållande vid 37 ° C i en miljö av fuktad 95% luft och 5% CO2.
- Byta hälften av medlet med det serumfritt odlingsmediet efter två dagar i kultur. Därefter exchange medium varje 2-3 dagar.
Obs: Nivån på mediet bör kontrolleras efter medium utbyte, eftersom det är viktigt för cellöverlevnad.
2. elektroporation
Alla bör utföras under sterila förhållanden.
Obs: Utföra elektroporation en dag efter beredningen av thalamic block för att förhindra avlossning av blocken.
-
Plasmider
- Gör en blandning av plasmider enligt följande: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-andra 3.5 μg/μL.
Obs: Rena de båda plasmider som använder ett endotoxinfria Maxiprep kit och lös i Hanks balanserad saltlösning.
- Gör en blandning av plasmider enligt följande: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-andra 3.5 μg/μL.
-
Elektroporation utrustning setup
De elektriska instrument såsom en stimulator och en isolator bör anslutas som visas i figur 2.- Anslut stimulatorn till bifasisk Frånkopplingsdonet.
- Anslut en elektrod (en silvertråd 0,2 mm diameter) till den negativa terminalen av isolator.
- Anslut en elektrod (ett silver tråd 1 mm diameter) i serie till en 100 Ω motstånd och den positiva terminalen av isolator.
- Anslut förstärkaren till oscilloskopet att övervaka om elektriska strömmar skickas över resistorn genom att mäta spänningen med förstärkaren.
-
Beredning av glas pipetter
Obs: Två typer av glas pipetter används för utmatning av Plasmiden lösningen och tillämpning av elektriska pulser.- Göra pipetterna från glas kapillärer med en elektrod avdragare.
- Bryta den tips för utmatning pipetten (spets diameter bör vara 20-50 μm).
- Slipa och polera spetsen på pipetten elektrod med sandpapper följt av eld-polering (innerdiameter bör vara 50-200 μm).
Obs: Elektroden spetsen bör vara plan och jämn, som det berör direkt vävnaden.
-
Förfarande av elektroporation
- Anslut de utmatning och elektroden pipetterna till manipulatorer.
- Infoga en silvertråd (0,2 mm diameter) i elektroden pipetten.
- Koppla utmatning pipetten till en 1 mL spruta med ett plaströr.
- Ta upp > 5 μL av Plasmiden lösning i utskjutningen pipetten av sprutan sug.
- Sätta coculture på elektroporation scenen, och infoga 1 mm diameter elektroden i odlingssubstratet.
- Placera utmatning pipetten på den thalamic explant.
- Skjut på sprutan manuellt efter spets vidrör ytan av thalamic blocket.
Obs: Om 0,5 μL av Plasmiden används vanligtvis lösning per ett thalamic kvarter. - Placera elektroden pipetten på thalamic blocket omedelbart efter indragning av utskjutningen pipetten.
- Leverera elektriska pulser (50-400 μA, 3 till 5 tåg av 200 kvadrat pulser med 1 ms varaktighet vid 200 Hz). Övervaka amplituden och antalet tåg på oscilloskopet.
Obs: Amplituden av elektriska strömmar beror på den inre diametern av en elektrod pipett13. - Återkalla elektrod pipetten och återgå skålen till inkubatorn.
-
Mikroskopisk observation
- Pålagt en mikroskopisk scenen av en upprätt confocal Mikroskop utrustad med två filter för andra kultur skålen (excitation, 488 nm, emission, 515 nm) och DsRed (excitation, 514 nm, emission, 565 nm).
- Ta bilder av 10-25 optiska delar på 1-7 µm-steg storlekar med en 20 X lång arbetande avståndet objektiv. Välj individuellt distinguishable märkt axoner som uttrycker både DsRed och SYP-andra.
Obs: Observerade området är cirka 0,7 x 0,7 mm (motsvarar 1024 x 1024 pixlar, det vill säga, 0,68 μm/pixel). - Fånga bilder varje 24 h för daglig avbildning. Slutföra inom 10 min i rumstemperatur, och återgå kulturerna till inkubatorn. För kort-intervall tid förflutit imaging, Förvara odlingen i en kultur kammare, som upprätthåller miljön av tilluften 95% luft och 5% CO2 vid 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentet beskrivs här syftar till att avslöja förhållandet mellan TC axon förgrening och synaps bildas. För att samtidigt visualisera axonal banor och platser av presynaptiska platser, enstaka eller ett fåtal thalamic celler i organotypic cocultures var transfekterade med två plasmider kodning SYP-andra och DsRed med elektroporation. Under den andra veckan i kultur, var individuellt distinguishable TC axoner tydligt märkt av DsRed (figur 3). Endast den axoner som uppvisade DsRed och SYP-andra valdes ut för observation. Märkt TC axoner invaderade kortikala slice och bildade filialer främst i de övre skikten, vilket indikerar att thalamic axoner i organotypic cocultures form grenar med laminär specificitet som liknar som hittade i vivo7, 8,10,14,15,16,17. Samtidigt observeras punktuell aggregeringar av SYP-andra (SYP-andra puncta) längs DsRed-märkt TC axoner (figur 3D-3F). Eftersom dessa SYP-andra puncta var mestadels colocalized med immunopositive signaler för VGLUT2, som är en presynaptiska markör thalamic celler, och PSD95, som är en allmän postsynaptiska markör, är det sannolikt att SYP-andra puncta mestadels representerar presynaptiska platser på TC axoner12.
Time-lapse avbildning av TC axoner visade att axon förgrening och synapsen bildandet av thalamic nervceller var kontinuerlig och dynamisk med tillägg och eliminering (figur 4)12. Dessutom hittades de flesta grenar växa fram från SYP-andra puncta, vilket indikerar att presynaptiska platser utlösa gren bildandet (för detaljer, se12).
Figur 1 . Förfarandet för utarbetande av en organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken. (A) övre vyn av en neonatal råtta hjärna. Det första snittet görs parallellt med mittlinjen (1). Sedan, 300 - 500-μm tjock koronalt avsnitt skärs från den primära visuella och somatosensoriska cortexen (2). Slutligen, göra en parasagittal klippa för att få de kortikala skivorna (3). (B) en schematisk representation av en organotypic coculture av thalamus och hjärnbarken. Kortikala skivor från postnatal dag 2 rat och thalamic kvarter från embryonala dag 15 är cocultured på membranfiltret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . En schematisk bild av elektriska instrument för elektroporation. Stimulatorn, Frånkopplingsdonet och elektroden pipetten är anslutna i serie. För att leverera negativt laddade DNA, är elektrod pipetten ansluten till den negativa terminalen av isolator. De elektriska strömmarna för elektroporation kan övervakas med oscilloskopet. TH: thalamus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Thalamocortical axoner i en coculture efter 2 veckor i kultur. (A–F) Coexpression av SYP-andra med DsRed i en thalamocortical (TC) axon. DsRed plus SYP-andra plasmider infördes i odlade thalamic cellerna på 1 dag i vitro (DIV) med elektroporation. (A) en organotypic coculture av thalamic och kortikala skivor efter 12 DIV. (B) A DsRed-märkt thalamic cell sträcker sig ett axon i kortikala slice och bildar grenar i övre skikten. (C) en förstorad bild av boxed regionen (a). (D-F) visar den DsRed-märkt TC axon (D) och SYP-andra puncta (E) i regionen förpackad i (C). Diskreta ansamling av SYP-andra observerades längs en enda TC axon. TH: thalamus. Skala barer: (B) 1 mm, (C) 100 µm, och (F) 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Time-lapse avbildning av en thalamocortical axon uttrycker SYP-andra och DsRed i en organotypic coculture. DsRed plus SYP-andra plasmider infördes i odlade thalamic cellerna på 1 DIV med elektroporation. Detta axon fotograferades dagligen under 4 dagar (11 DIV till 14 DIV). Skalstapeln: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet är också ett kraftfullt verktyg att studera utvecklingsmässiga aspekter av växande axoner annat än av TC projektion11. Exempelvis kan en kombination av kortikala slice kultur och elektroporation tekniken visualisera enskilda axonal morfologi av kortikala nervceller och långsiktig observation9,18.
Med hjälp av det nuvarande protokollet, kan rollerna av intressanta gener i axon förgrening och synaps bildas också analyseras av samtidig uttryck av fluorescerande proteiner och generna som intresse. Normalt är över 90% av fluorescerande protein uttrycker celler samtidig transfekterade med en andra plasmid när molar förhållandet av Plasmiden lösningar justeras till 1:218,19. Men det optimala förhållandet kan vara annorlunda eftersom samtidig transfection effekt och uttryck är varierade bland vektorer.
Även om det nuvarande protokollet är effektivt för time-lapse experiment, finns det några tekniska problem. För daglig imaging placerades en coculture på en mikroskopisk scen varje dag. Även om axonal utveckling inte verkar påverkas allvarligt av dagliga imaging10, bör varje observation slutföras inom 10 min att minimera avdunstning av kultur lösning och förändringar i pH odlingssubstrat. Alternativt skulle det vara bättre att upprätthålla temperatur, fuktighet och pH av kulturerna på mikroskopiska etapp12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar också Gabriel Hand för kritisk läsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
