Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l’imagerie simultanée de thalamocortical axon branching et synapse formation dans cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Les axones thalamocortical individuels et leurs terminaisons présynaptiques sont visualisés par une technique d’électroporation monocellulaires avec DsRed et synaptophysine GFP-étiquetée.
Abstract
Axon branching et synapse formation sont des processus cruciales pour l’établissement des circuits neuronaux précises. Au cours du développement, axones sensoriels thalamocortical (TC) forment des branches et des synapses dans des calques spécifiques du cortex cérébral. Malgré l’évidente corrélation spatiale entre la formation d’axon branching et synapse, le lien de causalité entre eux est mal compris. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis au point une méthode d’imagerie simultanée de ramification et synapse formation des axones TC individuels organotypique cocultures.
Ce protocole décrit une méthode qui consiste en une combinaison d’une co-culture organotypique et électroporation. Cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral facilitent la manipulation génétique et l’observation des processus axonales, préservant les structures caractéristiques telles que la configuration laminaire. Deux plasmides distincts codant DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par une technique d’électroporation. Cette méthode nous a permis de visualiser individuels morphologies axones des neurones de TC et leurs sites présynaptiques simultanément. La méthode a également permis d’observation à long terme, qui a révélé le lien de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.
Introduction
La projection de thalamocortical (TC) dans le cerveau des mammifères est un système adéquat d’enquêter sur le guidage axonal et ciblage des mécanismes. Au cours du développement, les axones sensoriels de TC poussent dans la plaque corticale et les branches de la forme et les synapses préférentiellement en couche IV des aires sensorielles primaires dans le cortex cérébral1,2. Même après la mise en place de connexions fondamentales, tonnelles axonales et terminaux synaptiques est remodelés selon les changements environnementaux3,4. Cependant, comment la morphologie axon TC est dynamiquement modifiée est mal comprise. Une des principales raisons est le manque d’une technique adéquate pour observer les changements structurels au niveau unicellulaire. Bien que les développements récents en microscopie, telles que la microscopie biphotonique, ont permis l’observation directe de la vie les neurones corticaux en vivo, il y a des limites encore techniques pour capturer le général TC trajectoires5, 6. par conséquent, méthodes in vitro pour l’imagerie direct des axones TC fournirait des outils puissants pour les analyses structurelles d’axon branching et synapse formation.
Notre groupe pour la première fois mis en place une méthode de culture statique tranche avec membrane perméable7. En utilisant cette méthode, une tranche de cortex de rat a été co-cultivées avec un bloc thalamique sensoriel et connexions TC lamina spécifiques ont été récapitulées dans ce organotypique cocultures7,8. Étiquetage clairsemée avec une protéine fluorescente plus loin nous a permis d’observer la croissance axonale TC et la direction générale de la formation9,10,11. Récemment, nous avons développé une méthode originale pour l’imagerie simultanée de la ramification et la formation des synapses des axones de TC individuels dans l’organotypique cocultures12. Afin de visualiser simultanément les axones de TC et sites présynaptiques, DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par électroporation de la co-culture organotypique. La méthode actuelle facilite l’analyse morphologique des axones de TC et permet l’observation à long terme, qui peut être utilisée pour montrer la relation de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies par les comités de protection animale de l’Université d’Osaka et de la société de Neuroscience du Japon.
1. organotypique cocultures du thalamus et le cortex cérébral
Remarque : La procédure détaillée, consultez l’original publications7,8,13. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Rats Sprague-Dawley (SD) sont utilisés pour les cultures de neurones.
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Préparation des réactifs
Remarque : Les volumes de réactifs suivants sont pour le cerveau d’un rat.- Préparer 10 x mis à jour le supplément N2 13: insuline (50 μg/mL), progestérone (200 nM), hydrocortisone (200 nM), sélénite de sodium (300 nM), la transferrine (1 mg/mL), putrescine (1 mM), glucose (60 mg/mL)
- Milieu de culture contenant du sérum prepare (10 mL) : 85 % DMEM/F12, majoration de 10 % x 10 modifié N2, 5 % sérum fœtal (SVF)
- Milieu de culture sans sérum prepare (20 mL) : 90 % DMEM/F12, majoration de 10 % x 10 modifié N2
- Préparer la solution de collagène queue rat (0,5 mL). En bref, prendre des fibres tendres d’une queue de rat dans des conditions stériles et incuber pendant la nuit dans une solution d’acide acétique. Après centrifugation, recueillir le surnageant (quelques mg/mL) et les stocker dans un réfrigérateur13.
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Préparation de plats de la culture
- Placer un insert membrane dans une boîte de Pétri de 35 mm.
- Ajouter 40-50 μL de solution de collagène queue rat à la membrane et répandre la solution de collagène autour du centre.
- Sécher à l’air la membrane complètement dans un banc propre.
- Mettre 1,5 à 2 mL de milieu de culture contenant du sérum dans le plat, pour que la membrane est trempée avec le milieu.
- Posez le plat de la culture dans un incubateur (37 ° C, l’air humidifié 95 % et 5 % CO2) avant l’ensemencement.
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Préparation de tranches de cortex
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec l’éthanol à 70 % pendant 10 min ou plus.
- Disséquer le cerveau entier rapidement d’un jour après la naissance (P) 2 rat sous anesthésie glacee (plongé dans la glace-chips pendant quelques minutes).
- Place le cerveau dans une boîte de Pétri contenant 100 mL de Hanks froide de 100 mm équilibré de solution saline.
- Retirer le corps de pia du cerveau avec une pince fine et couper des tranches de cortex (300-400 μm d’épaisseur) du cortex visuel et somatosensoriel avec des ciseaux microchirurgicales (pour détails, voir Figure 1).
Remarque : L’épaisseur des tranches de cortex est grossièrement estimée par l’ampleur des grilles sous un microscope binoculaire.
Remarque : Par ailleurs, des tranches de cortex peuvent être faites avec un vibratome dans des conditions stériles. - Le transfert de quelques tranches de cortex sur l’insertion de la membrane avec une pipette en plastique jetable.
- Ajustez les positions des tranches près du centre de l’insert de culture avec une pipette Pasteur feu poli (pour plus de détails, voir8,13) et retirer les excès du milieu de l’insert.
Remarque : Ajuster le niveau du médium légèrement au-dessous de la surface des tranches afin que les tranches peuvent recevoir un nombre suffisant de fois le gaz et le milieu. Cela est essentiel pour la viabilité des cellules. - Maintenir les tranches dans le milieu de culture à 37 ° C dans un milieu contenant du sérum de humidifié 95 % air et 5 % de CO2et de la culture seul pendant une journée avant un bloc thalamique est pris et placé à côté de lui.
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Préparation des blocs thalamiques
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec l’éthanol à 70 % pendant 10 min ou plus.
- Anesthésier une enceinte rat (embryonnaire jour 15) par injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 mg/kg) contenant des anesthésiques.
- Disséquer chaque embryon à partir des cornes utérines et placez les embryons dans une boîte de Pétri contenant 100 mL de solution saline équilibrée de Hanks froide de 100 mm.
- Sous un microscope binoculaire, retirer le cerveau de chaque embryon et couper des blocs thalamiques qui contiennent principalement du noyau géniculé complexe et latérales (environ 0,5 mm x 3) de ventrobasal7 à l’aide de ciseaux microchirurgicales (voir Figure 1).
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Culture et maintenir organotypique cocultures
- À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer le bloc thalamique à côté de la surface ventriculaire de la corticale tranche qui a été placé sur le filtre à membrane.
- Maintenir les cocultures dans le milieu de culture contenant du sérum à 37 ° C dans un environnement d’air humidifié de 95 % et 5 % de CO2.
- La moitié du milieu avec le milieu de culture sans sérum échanger après deux jours de culture. Par la suite, échanger le milieu tous les 2-3 jours.
Remarque : Le niveau du support doit être vérifié après l’échange moyen, tel qu’il est important pour la survie des cellules.
2. électroporation
Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles.
Remarque : Effectuer électroporation un jour après la préparation des blocs thalamiques pour éviter le détachement des blocs.
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Plasmides
- Faire un mélange des plasmides comme suit : pCAGGS-DsRed 2 μg/μL ; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL.
Remarque : Purifier les deux plasmides utilisant un kit de Maxiprep exempte d’endotoxine et se dissolvent dans la solution saline équilibrée de Hanks.
- Faire un mélange des plasmides comme suit : pCAGGS-DsRed 2 μg/μL ; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL.
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Installation de matériel d’électroporation
Les instruments électriques comme un stimulateur et un isolateur doivent être connectés, comme illustré à la Figure 2.- Connectez le stimulateur à l’isolateur biphasique.
- Connecter l’électrode (un fil d’argent 0,2 mm de diamètre) à la borne négative de l’isolateur.
- Connecter l’électrode (un diamètre de 1 mm de fil d’argent) en série avec une résistance de 100 Ω et la borne positive de l’isolateur.
- Connectez l’amplificateur à l’oscilloscope afin de vérifier que les courants électriques sont transmis à travers la résistance en mesurant la tension avec l’amplificateur.
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Préparation des pipettes en verre
Remarque : Deux types de pipettes en verre sont utilisés pour l’application d’impulsions électriques et éjection de la solution de plasmide.- Faire les pipettes de capillaires en verre avec un extracteur de l’électrode.
- Casser l’embout de la pipette d’éjection (le diamètre de pointe devrait être 20-50 μm).
- Meuler et polir l’embout de la pipette d’électrode avec papier de verre suivie d’incendie-polissage (le diamètre intérieur doit être de 50-200 μm).
Remarque : La pointe de l’électrode doit être plane et lisse, car elle touche directement le tissu.
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Procédure d’électroporation
- Connecter les pipettes d’éjection et électrode pour les manipulateurs.
- Insérez un fil d’argent (0,2 mm de diamètre) dans la pipette de l’électrode.
- Fixez la pipette de l’éjection d’une seringue de 1 mL avec un tube en plastique.
- Prendre > 5 μL de solution de plasmide dans la pipette d’éjection par succion de la seringue.
- Mettre la co-culture sur la scène de l’électroporation et introduire l’électrode de diamètre 1 mm dans le milieu de culture.
- Placez la pipette d’éjection sur l’explant thalamique.
- Pousser la seringue manuellement après que la pointe touche la surface du bloc thalamique.
Remarque : Sur 0,5 μL du plasmide solution est habituellement utilisée par un seul bloc thalamique. - Placez la pipette de l’électrode sur le bloc thalamique immédiatement après le retrait de la pipette d’éjection.
- Délivrer des impulsions électriques (50-400 μA, 3 à 5 trains de 200 pulsations carrées de 1 ms durée à 200 Hz). Contrôler l’amplitude et le nombre de trains sur l’oscilloscope.
Remarque : L’amplitude des courants électriques dépend du diamètre intérieur de l’électrode de pipette13. - Escamoter la pipette de l’électrode et remettez le plat dans l’incubateur.
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Observation microscopique
- Mettre la boîte de Petri sur un stade microscopique d’un microscope confocal vertical équipé de deux jeux de filtres pour EGFP (excitation, 488 nm ; émission, 515 nm) et DsRed (excitation, 514 nm ; émission, 565 nm).
- Prendre des photos des sections optiques 10-25 à tailles µm-étape 1-7 avec un 20 X long-travail distance objectif. Sélectionnez des axones étiquetées individuellement distingués qui expriment la DsRed tant SYP-EGFP.
Remarque : La zone observée est d’environ 0,7 x 0,7 mm (correspondant à 1024 x 1024 pixels, c'est-à-dire, 0,68 μm/pixel). - Capturer des images toutes les 24 h pour l’imagerie quotidienne. Remplissez moins de 10 min à température ambiante et les cultures dans l’incubateur. Pour l’imagerie de péremption court-intervalle de temps, conserver la culture dans une chambre de culture, qui maintient que l’environnement d’humidifie 95 % air et 5 % de CO2 à 37 ° C.
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Representative Results
L’expérience décrite ici a pour but de révéler la relation entre TC axon branching et synapse formation. Afin de visualiser simultanément les trajectoires axonales et emplacements des sites présynaptiques, unique ou quelques cellules thalamiques organotypique cocultures ont été transfectées avec deux plasmides codant SYP-EGFP et DsRed utilisant l’électroporation. Au cours de la deuxième semaine de la culture, les axones TC distinguables individuellement étaient clairement étiquetés par DsRed (Figure 3). Seulement les axones qui présentaient la DsRed et SYP-EGFP ont été sélectionnés pour l’observation. Étiquetées TC axones ont envahi la tranche corticale et formé des branches principalement dans les couches supérieures, indiquant que les axones thalamiques dans l’organotypique cocultures les branches de forme avec spécificité laminaire ressemblant à celle en vivo7, 8,10,14,15,16,17. Dans le même temps, on observe des agrégations ponctuées de SYP-EGFP (examen SYP-EGFP) le long des axones DsRed marqué TC (Figure 3D-3F). Étant donné que ces punctums SYP-EGFP étaient pour la plupart colocalized avec des signaux d’immunopositifs pour VGLUT2, qui est un marqueur présynaptique des cellules thalamiques, et PSD95, qui est un marqueur postsynaptique général, il est probable que SYP-EGFP examen représentent essentiellement présynaptiques sites sur TC axones12.
Time-lapse imagerie des axones TC supplémentaires ont montré qu’axon branching et la formation des synapses des neurones thalamiques étaient continu et dynamique avec l’addition et élimination (Figure 4)12. En outre, la plupart des branches trouvées à émerger de l’examen de SYP-EGFP, indiquant que les sites présynaptiques déclenchent formation direction (pour plus de détails, voir12).
Figure 1 . La procédure de préparation d’un cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. (A) la vue de dessus d’un cerveau de rat néonatal. La première coupe est faite en parallèle à la ligne médiane (1). Puis, 300 - 500-μm d’épaisseur des sections coronales sont découpées dans le cortex visuel et somatosensoriel primaire (2). Enfin, faites un parasagittale coupe pour obtenir des tranches de cortex (3). (B) une représentation schématique d’une co-culture organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Des tranches de cortex de rat postnatal jour 2 et thalamiques pâtés de maisons de jour embryonnaire 15 sont co-cultivées sur la membrane filtrante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Un diagramme schématique des instruments électriques pour l’électroporation. Le stimulateur, l’isolant et la pipette de l’électrode sont connectées en série. Pour remettre l’ADN chargée négativement, la pipette de l’électrode est reliée à la borne négative de l’isolateur. Les courants électriques pour l’électroporation peuvent être contrôlés avec l’oscilloscope. TH : thalamus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Les axones de thalamocortical dans une co-culture après 2 semaines de culture. (A–F) Coexpression de SYP-EGFP avec DsRed dans un axone thalamocortical (TC). Plasmides DsRed plus SYP-EGFP ont été introduits dans des cellules cultivées thalamiques à 1 jour in vitro (DIV) utilisant l’électroporation. (A) une co-culture organotypique de tranches thalamiques et corticales après 12 cellules thalamiques DIV. (B) DsRed A marqué un axone s’étende la tranche corticale et forme des branches dans les couches supérieures. (C) une image agrandie de la région en boîte à (A). (D-F) montrent la DsRed marqué TC axon (D) et SYP-EGFP punctums (E) dans la région en boîte de (C). Discrète accumulation de SYP-EGFP a été observée le long d’un seul axone de TC. Th : thalamus. Barreaux de l’échelle : (B) 1 mm, (C) 100 µm et (F) 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Time-lapse imagerie d’un axone thalamocortical exprimant SYP-EGFP et DsRed dans une co-culture organotypique. DsRed plus plasmides SYP-EGFP ont été introduits dans des cellules cultivées thalamiques à 1 DIV utilisant l’électroporation. Cet axone a été photographié par jour pendant 4 jours (11 DIV à 14 DIV). Barre d’échelle : 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole actuel est également un outil puissant pour étudier les aspects liés au développement de la croissance des axones autrement que de la projection de TC11. Par exemple, une combinaison de la culture de la tranche corticale et la technique d’électroporation permet de visualiser chaque morphologie axonale des neurones corticaux et à long terme d’observation9,18.
En utilisant le protocole actuel, les rôles des gènes intéressants chez axon branching et synapse formation peuvent également être analysés par la co-expression de protéines fluorescentes et les gènes d’intérêt. En règle générale, plus 90 % des cellules exprimant la protéine fluorescente co transfected avec un plasmide deuxième lorsque le rapport molaire des solutions plasmide est réglé à 1 / 218,19. Toutefois, le ratio optimal peut être différent comme l’efficacité de transfection Co, et le niveau d’expression sont variés entre les vecteurs.
Bien que le protocole actuel est efficace pour des expériences de Time-lapse, il y a quelques problèmes techniques. Pour l’imagerie quotidienne, une co-culture a été placé sur un stade microscopique de tous les jours. Bien que le développement axonal ne semblait pas être sérieusement affectés par imagerie quotidienne10, chaque observation doit être effectuée dans les 10 min pour minimiser l’évaporation de la solution nutritive et les variations de pH du milieu de culture. Par ailleurs, il serait préférable de maintenir la température, l’humidité et pH des cultures sur le stade microscopique12.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions également Gabriel Hand lecture critique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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