Summary

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Published: March 28, 2018
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Summary

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Abstract

Formação de ramificação e sinapse do axônio são processos cruciais para o estabelecimento de circuitos neuronais precisos. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais thalamocortical (TC) formam ramos e sinapses em camadas específicas do córtex cerebral. Apesar da óbvia correlação espacial entre formação de ramificação e sinapse do axônio, a relação causal entre eles é mal compreendida. Para resolver esse problema, recentemente desenvolvemos um método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e sinapse formação de axônios individuais de TC em organotypic cocultures.

Este protocolo descreve um método que consiste em uma combinação de um organotypic coculture e eletroporação. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral facilitam a observação dos processos axonal, preservando estruturas características tais como a configuração laminar e manipulação genética. Dois plasmídeos distintos codificação DsRed e Sinaptofisina com tag EGFP (SYP-EGFP) foram co transfectados em um pequeno número de neurônios talâmicos técnica de eletroporação. Este método permitiu-nos Visualizar morfologias axonal individuais dos neurônios de TC e seus sites pré-sináptica simultaneamente. O método permitiu também a observação a longo prazo, que revelou a relação causal entre formação de ramificação e sinapse do axônio.

Introduction

A projeção thalamocortical (TC) do cérebro de mamíferos é um sistema adequado para investigar a orientação do axônio e mecanismos de direcionamento. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais do TC crescem na placa cortical e ramos de formulário e sinapses preferencialmente em camada IV das áreas sensoriais primárias no córtex cerebral1,2. Mesmo após o estabelecimento de conexões fundamentais, mandris axonal e terminais sinápticos são remodelados dependendo de mudanças ambientais3,4. No entanto, como morfologia do axônio TC é alterada dinamicamente é mal compreendida. Uma das principais razões é a falta de uma técnica adequada para observar mudanças estruturais a nível uma única célula. Embora os desenvolvimentos recentes na microscopia, tais como a microscopia de dois fotões, permitiram a observação directa da vida neurônios corticais na vivo, existem limitações ainda técnicas para capturar o global TC trajetórias5, 6. portanto, em vitro métodos para geração de imagens ao vivo de axônios de TC que fornece ferramentas poderosas para análises estruturais de formação de ramificação e sinapse do axônio.

Nosso grupo pela primeira vez estabeleceu um método de cultura estático fatia com membrana permeável7. Usando este método, uma fatia de cortical do rato foi cocultured com um bloco talâmica sensorial, e conexões de TC de lâmina específica foram recapituladas neste organotypic cocultures7,8. Etiquetando esparsas com uma proteína fluorescente ainda mais nos permitiu observar crescimento do axônio TC e ramo formação9,10,11. Recentemente, temos desenvolvido um novo método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e formação de sinapse de axônios individuais de TC no organotypic cocultures12. Para visualizar sites pré-sináptica e axônios TC simultaneamente, DsRed e EGFP-tag Sinaptofisina (SYP-EGFP) foram co transfectadas em um pequeno número de neurônios talâmicos por eletroporação de coculture o organotypic. O método atual facilita a análise morfológica de axônios de TC e permite a observação a longo prazo, que pode ser usada para mostrar a relação causal entre a formação de ramificação e sinapse do axônio.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos comités de bem-estar animal da Universidade de Osaka e da sociedade de neurociência do Japão. 1. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral Nota: Para o procedimento detalhado, consulte o original publicações7,8,13. Todos os procedimentos devem ser executados sob condições …

Representative Results

O experimento aqui descrito destina-se a revelar a relação entre formação de ramificação e sinapse de axônio de TC. Para visualizar simultaneamente trajetórias axonal e locais de sites pré-sináptica, única ou poucas células talâmicos em organotypic cocultures foram transfectadas com dois plasmídeos codificação SYP-EGFP e DsRed usando eletroporação. Durante a segunda semana de cultura, axônios individualmente distinguíveis do TC foram claramente rotulados por DsRed (<st…

Discussion

O protocolo atual também é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos do desenvolvimento do crescimento de axônios, além do TC projeção11. Por exemplo, uma combinação de cultura fatia cortical e a técnica de eletroporação permite visualizar a morfologia axonal individual de neurônios corticais e observação de longo prazo9,18.

Usando o protocolo atual, os papéis de genes interessantes na formaç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos também o Gabriel Hand para leitura crítica.

Materials

DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

References

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Cite This Article
Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

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