Summary
Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.
Abstract
Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.
Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.
Introduction
La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología de axon de TC es mal entendida. Una de las principales razones es la falta de una adecuada técnica para observar los cambios estructurales a nivel unicelular. Aunque los acontecimientos recientes en microscopía, tales como microscopia de dos fotones, han permitido la observación directa de las neuronas corticales de vivo en vivo, hay limitaciones todavía técnicas para capturar el total TC trayectorias5, 6. por lo tanto, en vitro métodos para la proyección de imagen viva de axones de TC serían proporcionar herramientas poderosas para el análisis estructurales de la formación de ramas y sinapsis axón.
Nuestro grupo por primera vez estableció un método de cultura estática de la rebanada con membrana permeable7. Usando este método, una porción cortical de la rata fue morfología con un bloque sensorial talámico, y conexiones de TC de lámina específica fueron recapituladas en este organotypic cocultures7,8. Etiquetado escasa con una proteína fluorescente más nos permitió observar crecimiento del axon de TC y rama formación9,10,11. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método para la proyección de imagen simultánea de ramificación y formación de sinapsis de axones individuales de TC en el organotypic cocultures12. Para visualizar simultáneamente TC axones y sitios presinápticos, DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por electroporación de la organotypic cocultivo. El método actual facilita el análisis morfológico de los axones de TC y permite la observación a largo plazo, que puede utilizarse para demostrar la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron según las pautas establecidas por los comités de bienestar animal de la Universidad de Osaka y de la sociedad de Neurociencia de Japón.
1. Organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral
Nota: Para el procedimiento detallado, consulte las publicaciones originales7,8,13. Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles. Las ratas de Sprague-Dawley (SD) se utilizan para cultivos neuronales.
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Preparaciones de reactivos
Nota: Volúmenes de los reactivos siguientes son para el cerebro de una rata.- Preparación 10 x suplemento modificado de N2 13: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), selenito de sodio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glucosa (60 mg/mL)
- Preparar medio de cultivo que contiene suero (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 de 10 x modificado de 10%, 5% de suero bovino fetal (FBS)
- Preparar medio de cultivo libre de suero (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento
- Preparar la solución de colágeno de cola de rata (0,5 mL). En Resumen, tomar fibras sensibles de una cola de rata bajo condiciones estériles e incubar durante una noche en solución de ácido acético. Después de la centrifugación, el sobrenadante (unos pocos mg/mL) de recoger y almacenar en un refrigerador13.
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Preparación de platos típicos de la cultura
- Coloque una membrana en una placa de Petri de 35 mm.
- Añadir 40-50 μL de solución de colágeno de cola de rata a la membrana y distribuir la solución de colágeno alrededor del centro.
- Secar la membrana totalmente en una mesa de trabajo limpia.
- Poner 1.5-2 mL de medio de cultivo que contiene el suero en el plato, para que la membrana se empapa con el medio.
- Coloque la placa de cultivo en un incubador (37 ° C, aire humidificado de 95% y 5% CO2) antes de la galjanoplastia.
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Preparación de láminas corticales
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.
- Diseccionar el cerebro entero rápidamente de un día postnatal (P) 2 rata bajo anestesia helada (inmersa en pedacitos de hielo por unos minutos).
- Lugar del cerebro en un 100 mm plato de Petri que contiene 100 mL de frío Hanks había equilibrada solución de sal.
- Saque el asunto de pia el cerebro con pinzas finas y cortar rebanadas corticales (300-400 μm de espesor) de la corteza visual y somatosensorial con tijeras de microcirugía (para detalles, ver figura 1).
Nota: El espesor de las láminas corticales se estima aproximadamente por la escala de redes bajo un microscopio binocular.
Nota: Alternativamente, se pueden hacer rebanadas corticales con un vibratome bajo condiciones estériles. - La transferencia de unas láminas corticales en la inserción de la membrana con una pipeta de plástico desechable.
- Ajustar las posiciones de las láminas cerca del centro de la cultura de inserción con una pipeta Pasteur fuego pulido (para más detalles, vea8,13) y quitar exceso medio de la inserción.
Nota: Ajuste el nivel del medio ligeramente por debajo de la superficie de las rodajas para que las láminas pueden recibir un suministro suficiente del gas y el medio. Esto es crucial para la viabilidad celular. - Mantener las rebanadas en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente humidificado 95% aire y 5% CO2y cultura solo para un día antes de un bloque talámico se toma y se coloca junto a él.
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Preparación de bloques talámicos
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.
- Anestesiar una rata embarazada (embrionario día 15) por inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) que contiene anestésico.
- Diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos y coloque los embriones en una placa de Petri que contiene 100 mL de solución salina equilibrada fría madejas de 100 mm.
- Microscopio binocular, quitar el cerebro de cada embrión y cortar bloques talámicos que contienen principalmente el ventrobasal núcleo articulado lateral y complejo (aproximadamente 0,5 mm x 3)7 con unas tijeras de microcirugía (ver figura 1).
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La cultura y mantener organotypic cocultures
- Con una pipeta Pasteur, colocar el bloque talámico junto a la superficie ventricular de la laminar cortical que se ha colocado en el filtro de membrana.
- Mantener las cocultures en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente de aire humidificado de 95% y 5% CO2.
- La mitad del medio con el medio de cultivo libre de suero de intercambio después de dos días en la cultura. Después de eso, cambiar el medio cada 2-3 días.
Nota: El nivel del medio debe medirse después del cambio de medio, ya que es importante para la supervivencia de la célula.
2. electroporación
Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles.
Nota: Realizar electroporación un día después de la preparación de los bloques talámicas para evitar desprendimiento de los bloques.
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Plásmidos
- Hacer una mezcla de plásmidos como sigue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
Nota: Purificar el ambos plásmidos utilizando el kit de Maxiprep libre de endotoxinas y se disuelven en una solución salina equilibrada de Hanks.
- Hacer una mezcla de plásmidos como sigue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
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Instalación de equipos de electroporación
Los instrumentos eléctricos tales como un estimulador y un aislador deben conectarse como se indica en la figura 2.- Conectar el estimulador para el aislador bifásico.
- Conectar un electrodo (un alambre de plata 0,2 mm de diámetro) a la terminal negativa del seccionador.
- Un electrodo (un alambre de plata 1 mm de diámetro) se conectan en serie a un resistor Ω 100 y el terminal positivo de su aislador.
- Conectar el amplificador al osciloscopio para monitorear si las corrientes eléctricas pasan a través de la resistencia mediante la medición de la tensión con el amplificador.
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Preparación de pipetas de vidrio
Nota: Se utilizan dos tipos de pipetas de vidrio para la eyección de la solución de plásmido y la aplicación de pulsos eléctricos.- Hacer las pipetas de Capillares de vidrio de con un tirador de electrodo.
- Romper la punta de la pipeta de la eyección (el diámetro de la punta debe ser 20-50 μm).
- Moler y para pulir la punta de la pipeta de electrodo con papel de lija seguido fuego pulido (el diámetro interior debe ser de 50-200 μm).
Nota: La punta del electrodo debe ser plana y lisa, ya que toca directamente el tejido.
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Procedimiento de la electroporación
- Conecte las pipetas de la eyección y el electrodo a los manipuladores.
- Inserte un alambre de plata (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de electrodo.
- Coloque la pipeta de expulsión a una jeringa de 1 mL con un tubo de plástico.
- Tomar > 5 μL de solución de plásmido en la pipeta de la eyección por la succión de la jeringa.
- Poner el cocultivo en la etapa de electroporación e Inserte el electrodo de diámetro de 1 mm en el medio de cultivo.
- Coloque la pipeta de eyección en el explante talámica.
- Empujar la jeringa manualmente después de que la punta toque la superficie del bloque talámica.
Nota: Acerca de 0,5 μL del plásmido solución se utiliza generalmente por un bloque talámico. - Coloque la pipeta del electrodo en el bloque talámico inmediatamente después de la retracción de la pipeta de expulsión.
- Entregar pulsos eléctricos (50-400 μA, trenes de 3 a 5 de 200 pulsos cuadrados de 1 ms de duración a 200 Hz). Controlar la amplitud y el número de trenes en el osciloscopio.
Nota: La amplitud de las corrientes eléctricas depende del diámetro interior de un electrodo pipeta13. - Retraiga la pipeta de electrodo y vuelva el plato a la incubadora.
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Observación microscópica
- Poner la placa de cultivo en una etapa microscópica de un microscopio confocal vertical equipado con dos conjuntos de filtro para la EGFP (excitación, 488 nm, emisión, 515 nm) y DsRed (excitación, 514 nm, emisión, 565 nm).
- Tomar imágenes de secciones ópticas de 10-25 en tamaños de 1 a 7 μm-paso con un 20 X trabajo larga distancia objetivo. Seleccione individualmente distinguibles etiquetados axones que expresan DsRed y SYP-EGFP.
Nota: El área observado es aproximadamente de 0,7 x 0,7 mm (correspondiente a 1024 x 1024 píxeles, es decir, 0.68 μm/píxeles). - Capturar imágenes cada 24 h para la proyección de imagen de diario. Completa en 10 min a temperatura ambiente y retomar las culturas de la incubadora. Para la proyección de imagen de lapso corto intervalo de tiempo, conservar el cultivo en un compartimiento de la cultura, que mantiene que el ambiente de humidificado 95% aire y 5% CO2 a 37 ° C.
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Representative Results
El experimento descrito aquí tiene como objetivo revelar la relación entre formación de ramas y sinapsis de axones TC. Para visualizar simultáneamente axonales trayectorias y ubicaciones de los sitios presinápticos, sola o algunas células talámicas en organotypic cocultures fueron transfectadas con dos plásmidos codifican SYP-EGFP y DsRed mediante electroporación. Durante la segunda semana de la cultura, axones TC individualmente distinguibles claramente fueron etiquetados por DsRed (figura 3). Sólo los axones que exhibieron DsRed y SYP-EGFP fueron seleccionados para la observación. Etiquetado TC axones invadieron el segmento cortical y forman ramas principalmente en las capas superiores, lo que indica que los axones talámicos en la organotypic cocultures ramas forma con especificidad laminar que se asemeja a que encontraron en vivo7, 8,10,14,15,16,17. Al mismo tiempo, las agregaciones de SYP-EGFP (puncta SYP-EGFP) pudieran observarse a lo largo de axones DsRed-etiquetados TC (figura 3D-3F). Puesto que estos puncta SYP-EGFP en su mayoría eran colocalized con señales immunopositive para VGLUT2, que es un marcador presináptico de las células talámicas, y PSD95, que es un marcador general de postsynaptic, es probable que SYP-EGFP puncta representan principalmente presináptico sitios en TC axones12.
Imágenes de Time-lapse de axones TC demostró más que ramificaciones de axones y formación de sinapsis de las neuronas talámicas fueron continuo y dinámico con adición y eliminación (figura 4)12. Por otra parte, mayoría de los ramas fueron encontrada de SYP-EGFP puncta, indicando que los sitios presinápticos provocar formación de rama (para detalles, ver12).
Figura 1 . El procedimiento para la preparación de un cocultures organotypic de la corteza cerebral y tálamo. (A) vista superior de un cerebro de rata neonatal. El primer corte se hace paralelo a la línea media (1). Entonces, 300 - 500 μm de espesor secciones coronales se cortan de la corteza visual y somatosensorial primaria (2). Por último, haga un parasagittal para obtener las láminas corticales (3). (B) una representación esquemática de un cocultivo organotypic del tálamo y corteza cerebral. Rebanadas corticales de rata día postnatal 2 y talámicos cuadras embrionario día 15 son morfología en el filtro de membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Un diagrama de instrumentos eléctricos para la electroporación. El estimulador, el aislador y la pipeta de electrodo están conectadas en serie. Para entregar el ADN cargado negativamente, la pipeta del electrodo está conectada a la terminal negativa del seccionador. Las corrientes eléctricas para la electroporación pueden controlarse con el osciloscopio. TH: tálamo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Talamocorticales axones en un cocultivo después de 2 semanas en cultura. (A–F) Coexpression de SYP-EGFP con DsRed en un axón talamocorticales (TC). DsRed plus SYP-EGFP plásmidos fueron introducidos en cultivos de células talámicos en 1 día en vitro (DIV) con electroporación. (A) un cocultivo organotypic de rebanadas corticales y talámicas después 12 div (B) etiquetados A DsRed talámica de la célula se extiende de un axón en el segmento cortical y forma ramas en capas superiores. (C) una imagen amplificada de la región en caja (a). (D-F) muestran la DsRed-etiquetados TC axon (D) y SYP-EGFP puncta (E) en la región en caja de (C). Acumulación discreta de SYP-EGFP fue observada a lo largo de un axón único de TC. TH: tálamo. Barras de escala: (B) 1 mm, (C) 100 μm y (F) 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Proyección de imagen de Time-lapse de un axón talamocorticales expresando SYP-EGFP y DsRed en un cocultivo de organotypic. DsRed además plásmidos SYP-EGFP fueron introducidos en cultivos de células talámicos en 1 DIV con electroporación. Este axón era reflejada diariamente durante 4 días (DIV. 11 a 14 DIV). Barra de escala: 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC11. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación9,18.
Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formación de ramas y sinapsis axón también puede ser analizado por la expresión de proteínas fluorescentes y los genes de interés. Por lo general, más 90% de células expresando la proteína fluorescente son co transfectado con un segundo plásmido cuando la relación molar de las soluciones de plásmido se ajusta a 1:218,19. Sin embargo, la relación óptima puede ser diferente como eficacia de transfección Co y nivel de expresión son variadas entre vectores.
Aunque el protocolo actual es eficiente para los experimentos de lapso de tiempo, hay algunos problemas técnicos. Imagen diaria, un cocultivo se colocó en una etapa microscópica todos los días. Aunque desarrollo axonal no parecen verse afectados seriamente por diario imagen10, cada observación debe completarse en 10 min para minimizar la evaporación de la solución de cultura y cambios en el pH del medio de cultivo. Por otra parte, sería mejor mantener la temperatura, humedad y pH de los cultivos en la fase microscópica12.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
También agradecemos a Gabriel Hand para lectura crítica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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