Summary

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Published: March 28, 2018
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Summary

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Abstract

Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.

Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

Introduction

La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología de axon de TC es mal entendida. Una de las principales razones es la falta de una adecuada técnica para observar los cambios estructurales a nivel unicelular. Aunque los acontecimientos recientes en microscopía, tales como microscopia de dos fotones, han permitido la observación directa de las neuronas corticales de vivo en vivo, hay limitaciones todavía técnicas para capturar el total TC trayectorias5, 6. por lo tanto, en vitro métodos para la proyección de imagen viva de axones de TC serían proporcionar herramientas poderosas para el análisis estructurales de la formación de ramas y sinapsis axón.

Nuestro grupo por primera vez estableció un método de cultura estática de la rebanada con membrana permeable7. Usando este método, una porción cortical de la rata fue morfología con un bloque sensorial talámico, y conexiones de TC de lámina específica fueron recapituladas en este organotypic cocultures7,8. Etiquetado escasa con una proteína fluorescente más nos permitió observar crecimiento del axon de TC y rama formación9,10,11. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método para la proyección de imagen simultánea de ramificación y formación de sinapsis de axones individuales de TC en el organotypic cocultures12. Para visualizar simultáneamente TC axones y sitios presinápticos, DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por electroporación de la organotypic cocultivo. El método actual facilita el análisis morfológico de los axones de TC y permite la observación a largo plazo, que puede utilizarse para demostrar la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron según las pautas establecidas por los comités de bienestar animal de la Universidad de Osaka y de la sociedad de Neurociencia de Japón. 1. Organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral Nota: Para el procedimiento detallado, consulte las publicaciones originales7,8,13. Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones es…

Representative Results

El experimento descrito aquí tiene como objetivo revelar la relación entre formación de ramas y sinapsis de axones TC. Para visualizar simultáneamente axonales trayectorias y ubicaciones de los sitios presinápticos, sola o algunas células talámicas en organotypic cocultures fueron transfectadas con dos plásmidos codifican SYP-EGFP y DsRed mediante electroporación. Durante la segunda semana de la cultura, axones TC individualmente distinguibles claramente fueron etiquetados por Ds…

Discussion

El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC11. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación9,18.

Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formaci?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

También agradecemos a Gabriel Hand para lectura crítica.

Materials

DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

References

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Cite This Article
Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

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