Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/56553
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University, 2Neuroscience Laboratories, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.

Abstract

האקסון מסעף סינפסה היווצרות הן תהליכים חיוניים להקמת מעגלים עצביים מדויק. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים thalamocortical (TC) טופס סניפים, הסינפסות בשכבות ספציפיות של קליפת המוח. למרות קורלציה מרחבית ברורה בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות, הקשר הסיבתי בין אותם ממעטים להבין. כדי לטפל בבעיה זו, לאחרונה פיתחנו שיטת הדמיה סימולטני של הסתעפות סינפסה היווצרות של אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures.

פרוטוקול זה מתאר שיטה אשר מורכב של שילוב של organotypic coculture ושל אלקטרופורציה. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח להקל על מניפולציה ג'ין והתבוננות של תהליכים עצב, שימור מבנים אופייניים כגון תצורת למינריות. שני פלסמידים שונים קידוד DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס על ידי טכניקת אלקטרופורציה. שיטה זו אפשרה לנו לדמיין מורפולוגיות עצב בודדים של נוירונים TC ואתרים presynaptic שלהם בו זמנית. השיטה זמינה גם תצפית לטווח ארוך אשר חשף את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

Introduction

התחזית thalamocortical (TC) במוח של יונקים היא מערכת מתאימה לחקור מנגנוני הדרכה האקסון ומיקוד. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים TC לגדול צלחת בקליפת המוח, ואת הטופס סניפים, הסינפסות מעדיפים בתוך שכבה IV של אזורי החישה העיקרי קליפת המוח1,2. גם לאחר הקמתה של חיבורי היסוד, עצב ובשבילים ומסופי סינפטית הם השתקם בהתאם שינויים סביבתיים3,4. עם זאת, איך TC האקסון המורפולוגיה היא שונה באופן דינמי הוא ממעטים להבין. אחת הסיבות העיקריות היא חוסר טכניקה נאותה לבחון שינויים מבניים ברמה תא בודד. למרות ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופ, כגון מיקרוסקופ שני הפוטונים, אפשרו בהתבוננות ישירה של החיים נוירונים בקליפת המוח ויוו, ישנן מגבלות טכניות עדיין עבור לכידת הכוללת TC מסלולים5, 6. לכן, במבחנה שיטות הדמיה חיה של אקסונים TC יספק כלים רבי-עוצמה עבור ניתוח מבנה של האקסון מסעף סינפסה היווצרות.

הקבוצה שלנו בפעם הראשונה הוקמה שיטה התרבות פרוסה סטטי עם קרום חדיר7. באמצעות שיטה זו, פרוסה קורטיקלית חולדה היה cocultured עם בלוק דפנות התלמוס חושית, חיבורים TC פרופריה ספציפי היו recapitulated הזה7,cocultures organotypic8. תיוג דליל עם החלבון הניאון עוד מותר לנו להתבונן סניף היווצרות9,10,11וצמיחה של האקסון TC. לאחרונה, פיתחנו שיטה עבור הדמיה סימולטני של הסתעפות, סינפסה היווצרות אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures12. להמחיש TC אקסונים ואתרים presynaptic בו זמנית, DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס מאת אלקטרופורציה של coculture organotypic. השיטה הנוכחית מקלה על ניתוח מורפולוגי של אקסונים TC ומאפשר התבוננות ארוכת טווח, אשר יכול לשמש כדי להראות את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לקווים המנחים שנקבעו על-ידי הוועדות רווחת של אוניברסיטת אוסקה, יפן Neuroscience החברה.

1. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח

הערה: לקבלת ההליך מפורט, עיין המקורי פרסומים7,8,13. כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים. ספראג-Dawley (SD) עכברים משמשים תרבויות עצביים.

  1. ההכנות של ריאגנטים
    הערה: כרכים ריאגנטים הבאות הן עבור מוח עכברוש אחד.
    1. הכן 10 x תוספת N2 ששונה 13: אינסולין (50 μg/mL), פרוגסטרון (200 ננומטר), הידרוקורטיזון (200 ננומטר), סודיום סלניט (300 ננומטר), transferrin (1 מ"ג/מ"ל), putrescine (1 מ מ), גלוקוז (60 מ"ג/מ"ל)
    2. הכן סרום המכיל תרבות בינוני (10 מ"ל): 85% DMEM/F12, תוספת N2 10 x שונה של 10%, 5% סרום שור עוברית (FBS)
    3. הכן ללא סרום תרבות בינוני (20 מ ל): 90% DMEM/F12, 10% x 10 ששינה N2 תוספת
    4. להכין עכבר זנב קולגן פתרון (0.5 מ"ל). בקיצור, קח במכרז סיבי זנב העכברוש בתנאים סטריליים, דגירה תמיסת חומצה אצטית בן לילה. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את תגובת שיקוע (כמה מ"ג/מ"ל) ולאחסן במקרר13.
  2. הכנת מאכלים תרבות
    1. למקם את הוספה ממברנה של 35 מ מ פטרי.
    2. להוסיף 40-50 μL של עכבר זנב קולגן פתרון למוח, להפיץ את הפתרון קולגן סביב המרכז.
    3. האוויר יבש קרום לחלוטין ב ספסל נקי.
    4. מכניסים 1.5-2 מ"ל של המדיום תרבות סרום המכיל המנה, כך הקרום ספוגה עם המדיום.
    5. מקם את המנה תרבות בתוך אינקובטור (37 ° C, humidified אוויר 95% ו- 5% CO2) לפני ציפוי.
  3. הכנת פרוסות בקליפת המוח
    1. לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.
    2. לנתח את זה. במהירות של יום לאחר הלידה (P) 2 עכברוש בהרדמה כקרח (שקוע בתוך קוביות קרח לכמה דקות).
    3. המקום המוח לתוך 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של הנקס קר מאוזנת תמיסת מלח.
    4. הסר את העניין פיא המוח עם מלקחיים בסדר, חותכים פרוסות בקליפת המוח (300-400 μm עובי) מאזור הקליפה חזותי, המגע עם מספריים המיקרוכירורגית (לפרטים, ראה איור 1).
      הערה: עובי הפרוסות בקליפת המוח מוערך בערך לפי קנה המידה של רשתות תחת מיקרוסקופ דו-עינית.
      הערה: לחלופין, פרוסות בקליפת המוח יכולה להתבצע באמצעות vibratome בתנאים סטריליים.
    5. העברת כמה פרוסות בקליפת המוח על גבי קרום המכסה מול פיפטה פלסטיק חד פעמיות.
    6. להתאים את העמדות של הפרוסות ליד המרכז של תרבות הקדמי עם פיפטה פסטר מלוטשים אש (לפרטים, ראה8,13) ולהסיר עודפי בינוני מהמכסה.
      הערה: להתאים את רמת של המדיום מעט מתחת לפני השטח הפרוסות כך הפרוסות יכול לקבל אספקה מספקת של גז והן בינוני. דבר זה חיוני עבור תא הכדאיות.
    7. לשמור את הפרוסות במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 ° C בסביבת humidified 95% אוויר ו-5% CO2, והתרבות לבד יום אחד לפני בלוק דפנות התלמוס הוא נלקח והניח לידו.
  4. הכנה של דפנות התלמוס בלוקים
    1. לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.
    2. עזים ומתנגד חולדה בהריון (עובריים יום 15) על ידי הזרקת פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) המכיל הרדמה בקרום הבטן.
    3. לנתח כל העובר מן הקרניים הרחם, למקם את העוברים 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס קר.
    4. תחת מיקרוסקופ דו-עינית, מסירים את המוח של העובר כל וחותכים בלוקים דפנות התלמוס המכילים בעיקר את גרעין הברך הצדי, מורכבים ולא לרוחב (כ 0.5 מ מ x 3) ventrobasal7 באמצעות מספריים השתלה (ראה איור 1).
  5. תרבות ולשמור על organotypic cocultures
    1. באמצעות פיפטה של פסטר, מקם את הבלוק דפנות התלמוס לצד המשטח חדרית של הפרוסה קורטיקלית שהונחה ממברנה מסנן.
    2. לשמור את cocultures במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה של אוויר 95% humidified ו- 5% CO2.
    3. להחליף חצי של המדיום עם המדיום תרבות ללא סרום אחרי יומיים בתרבות. לאחר מכן, חילופי המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: הרמה של המדיום צריך להיבדק אחרי ההחלפה בינוני, כפי שזה חשוב להישרדות התא.

2. אלקטרופורציה

כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים.

הערה: לבצע אלקטרופורציה יום לאחר הכנת הבלוקים דפנות התלמוס כדי למנוע ניתוק של אבני.

  1. פלסמידים
    1. להכין תערובת של פלסמידים כדלקמן: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      הערה: לטהר את פלסמידים הן באמצעות ערכת Maxiprep נטולת אנדוטוקסין ו להמיס תמיסת מלח מאוזנת של הנקס.
  2. התקנת ציוד אלקטרופורציה
    צריכים להיות מחוברים כלי הנגינה חשמל כגון ממריץ ו- isolator כפי שמוצג באיור2.
    1. לחבר את ממריץ isolator biphasic.
    2. להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 0.2 מ מ קוטר) הטרמינל השלילי isolator.
    3. להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 1 מ"מ קוטר) בסדרת ועד 100 Ω הנגד על הטרמינל חיובי isolator.
    4. להתחבר המגבר אוסצילוסקופ לפקח אם זרמים חשמליים הם חלף על פני resistor על ידי מדידת המתח עם המגבר.
  3. הכנת פיפטות זכוכית
    הערה: שני סוגים של פיפטות זכוכית משמשים עבור הוצאה של הפתרון פלסמיד ויישום של פולסים חשמליים.
    1. להפוך את פיפטות של נימים זכוכית עם פולר אלקטרודה.
    2. . שבור את הקצה על פיפטה הוצאה (הקוטר טיפ צריך להיות μm 20-50).
    3. טוחנים, לשכלל את קצה פיפטה אלקטרודה עם נייר זכוכית ואחריו (הקוטר הפנימי צריך להיות 50-200 μm) וליטוש אש.
      הערה: קצה האלקטרודה צריך להיות שטוח וחלק, כפי שהוא נוגע ישירות את הרקמה.
  4. הליך של אלקטרופורציה
    1. לחבר את הפליטה, אלקטרודה פיפטות המניפולטורים.
    2. הכנס חוט כסף (0.2 מ מ קוטר) פיפטה אלקטרודה.
    3. לצרף את פיפטה הוצאה מזרק 1 מ"ל עם צינור פלסטיק.
    4. תופסים > 5 μL של פתרון פלסמיד לתוך פיפטה הוצאה על ידי שאיבה במזרק.
    5. לשים את coculture על הבמה אלקטרופורציה ולאחר הכנס האלקטרודה בקוטר 1 מ"מ המדיום תרבות.
    6. מניחים את פיפטה הוצאה על explant דפנות התלמוס.
    7. לדחוף את המזרק באופן ידני לאחר הטיפ נוגע השטח של הרחוב דפנות התלמוס.
      הערה: על 0.5 μL של פלסמיד פתרון משמש בדרך כלל עבור כל בלוק אחד דפנות התלמוס.
    8. למקם את פיפטה אלקטרודה על הבלוק דפנות התלמוס מיד לאחר משיכת פיפטה הוצאה.
    9. מספקים פולסים חשמליים (μA 50-400, 3 עד 5 רכבות של פולסים מרובע 200 משך ms 1 ב 200 הרץ). נטר את משרעת ומספר רכבות על אוסצילוסקופ.
      הערה: משרעת של זרמים חשמליים תלוי הקוטר הפנימי של פיפטה אלקטרודה13.
    10. . משכי את פיפטה אלקטרודה וחוזרים המנה החממה.
  5. התבוננות מיקרוסקופית
    1. לשים את הצלחת תרבות שלב מיקרוסקופיים של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מצויד עם שתי קבוצות מסנן עבור EGFP (עירור, 488 ננומטר; פליטה, 515 ננומטר) ו DsRed (עירור, 514 ננומטר; פליטה, 565 ננומטר).
    2. קח תמונות של 10-25 סעיפים אופטי בגדלים מיקרומטר-שלב 1-7 עם 20 רב-לעבוד X עדשת מרחק אובייקטיבי. בחר בנפרד ניתן להבחנה אקסונים שכותרתו המבטאות הן DsRed והן SYP-EGFP.
      הערה: האזור הנצפה הינו כ 0.7 x 0.7 מ מ (המקביל 1024 x 1024 פיקסלים, כלומר, 0.68 μm לפיקסל).
    3. לכידת תמונות כל 24 שעות ביממה עבור הדמיה מדי יום. להשלים בתוך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וחוזרים התרבויות החממה. לדימות לשגות קצר-מרווח הזמן, לשמור על התרבות כדורים תרבות, השומרת על שהסביבה של humidified 95% אוויר ו-5% CO2 ב 37 º C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הניסוי המתואר כאן שואף לחשוף את הקשר בין TC האקסון מסעף סינפסה היווצרות. במקביל להמחיש מסלולים עצב, מיקומי אתרי presynaptic, אחד או כמה דפנות התלמוס בתאים organotypic cocultures היו transfected עם פלסמידים 2 קידוד SYP-EGFP ו DsRed באמצעות אלקטרופורציה. במהלך השבוע השני בתרבות, בבירור עם תווית אקסונים TC בנפרד ניתן להבחנה על-ידי DsRed (איור 3). רק האקסונים אשר הציג DsRed ו- SYP-EGFP נבחרו להשגחה. אקסונים TC שכותרתו פלשו הפרוסה קורטיקלית ויצרו סניפים בעיקר בשכבות העליונות, המציין כי אקסונים דפנות התלמוס ב organotypic cocultures סניפים טופס עם ירידה לפרטים למינריות הדומה שמצאה ויוו7, 8,10,14,15,16,17. באותו זמן, punctate מצבורים של SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) יכול להיות שנצפו לאורך אקסונים TC התווית על-ידי DsRed (D-3Fאיור 3). מאז puncta SYP-EGFP אלה היו בעיקר colocalized עם אותות immunopositive VGLUT2, אשר מהווה סמן presynaptic של תאים דפנות התלמוס, ועל PSD95, אשר מהווה סמן postsynaptic כללי, זה סביר להניח כי SYP-EGFP puncta בעיקר מייצגים presynaptic אתרים על אקסונים TC12.

הדמיה בצילום מואץ של אקסונים TC נוסף הראה את האקסון מסעף סינפסה היווצרות נוירונים דפנות התלמוס היו דינאמי עם תוספת ולמניעת (איור 4)12. יתר על כן, במרבית הסניפים נמצאו מגיחים SYP-EGFP puncta, המציין כי אתרי presynaptic לעורר הסניפי (לפרטים, ראה12).

Figure 1
איור 1 . נוהל הכנת cocultures organotypic של תלמוס, קליפת המוח. (א) מהנוף העליון של מוח עכברוש neonatal. החתך הראשון מתבצע במקביל האמצע (1). לאחר מכן, 300 - סעיפים הילתית 500-μm-עבה מנותקים מן הראשית החזותית ואת המגע קליפת המוח (2) לבסוף, להפוך את parasagittal לחתוך כדי להשיג את הפרוסות בקליפת המוח (3). (B) A ייצוג סכמטי של coculture organotypic של תלמוס, קליפת המוח. פרוסות קורטיקלית של עכברוש כמחנכת יום 2 וקוביות דפנות התלמוס מיום עובריים 15 cocultured ממברנה מסנן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . תרשים כללי של מכשירי חשמל אלקטרופורציה. ממריץ את isolator, את פיפטה אלקטרודה מחוברים בסדרה. כדי לספק DNA טעונים שלילית, פיפטה אלקטרודה מחוברת למסוף שלילית של isolator. ניתן לנטר את זרמים חשמליים עבור אלקטרופורציה עם אוסצילוסקופ. TH: תלמוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . אקסונים Thalamocortical ב coculture לאחר שבועיים בתרבות. (A–F) Coexpression של SYP-EGFP עם DsRed ב האקסון thalamocortical (TC). פלסמידים DsRed פלוס SYP-EGFP הוכנסו לתוך תאים בתרבית דפנות התלמוס-1 יום במבחנה (DIV) באמצעות אלקטרופורציה. (א) coculture organotypic של פרוסות דפנות התלמוס, בקליפת המוח לאחר 12 חטיבת (B) התווית על-ידי A DsRed דפנות התלמוס תא מרחיב של האקסון לתוך הפרוסה בקליפת המוח ויוצרת ענפים בשכבות העליונות. (ג) תמונה מוגדלת של האזור מסגרת (א). (D-F) מראים את התווית על-ידי DsRed TC האקסון (D) ו- SYP-EGFP puncta (ה) באזור מסגרת (C). הצטברות דיסקרטית של SYP-EGFP נצפתה לאורך האקסון יחיד TC. Th: תלמוס. גודל ברים: (B) 1 מ מ, (ג) 100 מיקרומטר, ו- (נ) 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . הדמיה בצילום מואץ של האקסון thalamocortical ביטוי SYP-EGFP, DsRed coculture organotypic. DsRed פלוס פלסמידים SYP-EGFP הוכנסו לתוך תאים בתרבית דפנות התלמוס ב 1 DIV באמצעות אלקטרופורציה. האקסון הזו צולמה ביום במשך 4 ימים (11 DIV 14 DIV). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי הוא גם כלי רב עוצמה כדי ללמוד היבטים התפתחותיים של גידול אקסונים אחר מאשר של ה TC הקרנה11. למשל, שילוב של תרבות פרוסה קורטיקלית, הטכניקה אלקטרופורציה מאפשר להמחיש מורפולוגיה עצב בודדים של נוירונים בקליפת המוח, לטווח ארוך תצפית9,18.

על-ידי שימוש בפרוטוקול הנוכחי, התפקידים של גנים מעניינים במבנה מסתעף, סינפסה האקסון יכול גם להיות נותחו על ידי שותף ביטוי של חלבונים פלורסנט, הגנים ריבית. בדרך כלל, מעל 90% של תאים מבטאים חלבון פלואורסצנטי הם שיתוף transfected עם פלסמיד השנייה כאשר היחס טוחנת של הפתרונות פלסמיד מותאם 1:218,19. עם זאת, היחס האופטימלי עשויים להיות שונים כבעלי יכולת שיתוף תרביות תאים, רמת ביטוי מגוונים בין וקטורים.

בפרוטוקול הנוכחי אמנם יעילה עבור ניסויים זמן לשגות, יש כמה בעיות טכניות. עבור הדמיה יומי, coculture הונח על הבמה מיקרוסקופיים כל יום. למרות התפתחות עצב לא נראה להיות מושפעת ברצינות הדמיה יומי10, כל תצפית צריכה להסתיים בתוך 10 דקות כדי למזער את אידוי של תרבות פתרון, שינויים ב- pH של המדיום תרבות. לחלופין, עדיף לשמור על טמפרטורה, לחות, ה-pH של התרבויות על הבמה מיקרוסקופיים12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים גם גבריאל היד לקריאה ביקורתית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries		 192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries		 16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).

Tags

מדעי המוח גיליון 133 התרבות פרוסה קליפת המוח תלמוס synaptogenesis arborization עצב פיתוח קורטיקלית הדמיה בצילום מואץ
ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsumoto, N., Yamamoto, N.… More

Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter