Summary
I manuskript beskriver vi användning av en jäst-baserade fluorescens reporter analysen identifiera cellulära komponenter inblandade i människohandel och döda processer av den cytotoxiska en delenhet av den växt giftet ricin (RTA).
Abstract
Bakteriell och anläggning A / B gifter utnyttja de naturliga människohandel vägarna i eukaryota celler att nå deras intracellulära hanteringspaketobjekt i cytosolen och slutligen döda. Sådan A / B gifter består vanligen av en enzymatiskt aktiva Asubunit (e.g., ricin toxin en (RTA)) och en eller flera cell bindande Bsubunit(s), som är ansvarig för toxin bindning till specifika cell surface receptorer. Vår nuvarande kunskap om hur A / B gifter klarar av att effektivt berusande celler hjälpte forskare för att förstå grundläggande cellulära mekanismer, som endocytos och intracellulära protein sortering i högre eukaryota celler. Från en medicinsk synvinkel är det också viktigt att identifiera de stora toxin handelsvägarna att hitta adekvat behandlingslösningar för patienter eller för att så småningom utveckla terapeutiska toxin-baserade tillämpningar för cancerbehandling.
Sedan genome-wide analyser av A / B toxin människohandel däggdjursceller är komplexa, tidskrävande och dyrt, flera studier på A / B toxin transport har utförts i jäst modell organismen Saccharomyces cerevisiae. Trots att mindre komplex, grundläggande cellulära processer i jäst och högre eukaryota celler kan är liknande och mycket ofta resultat som erhållits i jäst överföras till däggdjur situationen.
Här beskriver vi en snabb och lätt att använda reporter analys för att analysera intracellulära människohandel RTA i jäst. En viktig fördel med nya analysen finns möjlighet att undersöka inte bara RTA retro-translokation från endoplasmatiska retiklet (ER) i cytosolen, men snarare endocytos och retrograd toxin transport från plasmamembranet in i ER. Analysen gör användningen av en reporter plasmid som gör indirekt mätning av RTA toxicitet genom fluorescens utsläpp av grönt fluorescerande protein (GFP) efter i vivo översättning. Eftersom RTA förhindrar effektivt inledandet av proteinbiosynthesisen genom 28S rRNA depurination, möjliggör denna analys identifiering av värd cellproteiner involverade i intracellulära RTA transport genom påvisande av förändringar i fluorescens utsläpp.
Introduction
Patienter som lider av infektioner av toxin producerande bakterier utgör en allvarlig medicinska och ekonomiska börda för varje social hälso-och sjukvårdssystemet, särskilt sedan effektiva terapeutiska behandlingar är fortfarande till stor del saknade. Att utveckla nya terapeutiska strategier, de komplexa berusning mekanismerna av medicinskt relevanta A / B gifter såsom kolera toxin, Shigatoxin eller ricin måste förstås fullt på molekylär nivå baserat på romanen kraftfulla analyser som måste genomföras.
Under senare år har flera studier försökt att analysera A / B toxin transport i jäst och däggdjurs-celler med hjälp av tidskrävande och kostsam metoder såsom radioaktivt toxin märkning1,2 samt siRNA-baserad screening närmar sig3. I vissa fall har toxin människohandel varit visualiseras i vivo genom fluorescensmikroskopi efter kemiska eller genetiska koppling av enskilda toxin subunits med fluorophores, kvantprickar eller fluorescerande proteiner4,5. Tyvärr leda sådana ändringar ofta till inaktiv eller förändrad naturliga egenskaper av gifter. En annan elegant sätt att indirekt svara på en mängd olika vetenskapliga frågor är användningen av reporter system baserade på enzymer såsom Lindholm, luciferas, eller fluorescerande proteiner (t.ex. god Jordbrukarsed eller Discosoma sp. röd fluorescerande protein () dsRed)).
I detta manuskript beskrivs ett enkelt protokoll som identifierar cellulära komponenter som krävs för intracellulär transport av extracellularly tillämpad RTA i S. cerevisiae. Därmed fungerar en fluorescens-reporter plasmid som innehåller en N-terminal ER-import signal följt av GFP som en protein biosyntes sensor, som indirekt mäter RTA-medierad protein översättning hämning av GFP fluorescens utsläpp efter i vivo översättning6. I fall att RTA endocytos eller -intracellulära handel negativt (eller positivt) påverkas i en särskild jäst radering mutant jämfört med vildtyp, kan detta upptäckas genom en ökning (eller minskning) i GFP fluorescens utsläpp6.
Hittills har var alla metoder analysera RTA transport i jästceller begränsade till ER-till-cytosol retro-translokation processen för RTA. I ett sådant system för konstgjorda uttrycks RTA som innehåller en ER importera signal från en inducerbara arrangören vilket resulterar i en självmordsbenägen fenotyp1,7. Även om cellen bindande B-subenheten av ricin saknas jämväl i den experimentella inställning som beskrivs i detta manuskript och, således, fullt representerar inte det naturliga läget av ricin holotoxin berusning8, toxin transport från plasma membran genom Golgi apparaten till ER kan vara nära härmade med denna roman analys. Intressant, indikerar de preliminära resultat som uppnåtts i pilotstudien att människohandel vägar används av RTA avslöjar slående likheter med berusning rutten av ricin holotoxin.
Sammanfattningsvis kan den beskrivna metoden användas för att bestämma den särskilda rollen som valda cellproteiner i RTA endocytos och handel med jäst. Detta experiment kan dessutom anpassas enkelt till andra Ribosomen inactivating toxiner produceras och utsöndras från olika jäst och bakteriearter som zymocin eller Shigatoxin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: En översikt över allmänna experimentella arbetsflödet avbildas i figur 1.
Varning: RTA är mycket giftiga för människor. Säkerhet lab tillstånd S2 (biosäkerhet nivå 2 motsvarande) behövs. Vänligen Använd skyddshandskar under hela experimentet.
1. heterologa uttryck för hans-taggade RTA i Escherichia coli
- Omvandla E. coli celler med uttrycket plasmiden pET24-RTA(hans) 6 eller på tom vektor pET24a(+) använder standard elektroporation protokoll9,10. Celler som innehåller tomma plasmiden utgöra en negativ kontroll.
- Efter urval av positiva kloner på kanamycin-innehållande (100 µg/mL) LB tallrikar, Inokulera cellerna som innehåller RTA uttryck plasmiden eller tom vektorn i 5 mL LBkan medium (LB medium med 100 µg/mL kanamycin) och inkubera vid 37 ° C och 220 rpm för 24 h.
- Tillägg 1 L LBkan medium med 5 mL före kultur och inkubera cellerna vid 37 ° C och 220 rpm tills cellerna har nått en OD600 av 0,8-1,0 (cirka 3-4 h). Därefter minska kultur temperatur till 28 ° C och förbereda en 1 M av isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) stamlösning i H2O.
- Inducera RTA uttryck för den E. coli genom att lägga IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM.
- Efter 3,5 timmar vid 28 ° C och 220 rpm, skörd celler genom centrifugering vid 10 000 x g- och 4 ° C i 10 minuter tvätta pelleten två gånger med 5 mL av bindande buffert (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol och 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) på 10.000 x g och 4 ° C i 10 min och resuspendera pelleten i 5 mL bindande buffert.
Obs: Protokoll kan pausas i detta skede och celler kan förvaras vid 80 ° C i flera dagar.
2. rening av hans-taggade RTA via affinitetskromatografi
- Sonikera celler på is med följande protokoll: 15 s puls (20 µm), 30 s paus. Upprepa fem gånger.
- Centrifugera cell lysate på 21 000 x g och 4 ° C i 15 min och filtrera supernatanten med en steril spruta filtersystem (0,2 µm porstorlek).
Obs: Cell pellets av framgångsrikt sonicated prover visar tydliga gränser. - Använda en automatiserad reningssystem utrustad med en 5 mL Ni2 +-baserat affinitet kolumn för att rena hans-taggade RTA fraktionen från den sterila-filtrerad E. coli supernatant. I allmänhet använder en eluering hastighet av 1 mL/min och kyla i hela reningssystem för att förhindra icke-effektiv toxin bindande och förlust av toxin verksamhet.
Obs: Parametrar för effektiv RTA rening anges i tabell 1. Se även Becker et al. för ytterligare information9.- Kort, temperera kolumnen affinitet med 20 mL bindande buffert att ta bort lagring bufferten. Använd sterila-filtrerad supernatanten på kolumnen affinitet med hjälp av en spruta.
- Tvätta kolonnen med 25-35 mL bindande buffert att ta bort de obundna proteinerna från kolumnen. Utför tvätt steg tills UV absorbansen vid 280 nm ligger nära det ursprungliga UV-värdet.
- Eluera bunden RTA fraktion i 20-35 mL eluering buffert (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) och hålla provet på is (figur 2A och figur 2B).
Obs: Eluering av RTA fraktionen är märkt av en ökning av UV-absorption. Observera att enbart samla denna fraktion för att förhindra kontaminering med ospecifik bundna proteiner. - Använda 20 µL av eluerade prover för att utföra Coomassie blå färgning11 eller Western blot analys12,13 (valfritt). Använd primära anti hans antikroppar (1:1, 000) och sekundära anti-mouse-IgG-HRP (1:10 000) att upptäcka RTA och kontrollera provets renhet (figur 3).
- Avsalta eluerade RTA bråkdel på en 5 mL avsaltning kolumn och låt jämvikta provet i 0,8 M sorbitol.
- Byt ut kolumnen affinitet av reningssystemet av kolumnen avsaltning och först jämvikta kolonnen med 20 mL 0,8 M sorbitol.
- Gäller den eluerade RTA-fraktionen kolonnen via en spruta. Tvätta kolonnen med 100 mL 0,8 M sorbitol och eluera den desalted RTA-fraktionen i en 15 mL tub så snart de UV-absorptionen börjar öka (figur 2 c).
- Lagra det eluerade RTA bråket vid 4 ° C.
Obs: Stoppa direkt RTA bråkdel provtagning när konduktans ökar för att undvika salt kontaminering. Parametrar för avsaltning förfarandet anges i tabell 1.
- Koncentrera sig eluerade RTA bråkdel vid 10 000 x g och 4 ° C i 30-180 min hjälp en 10 kDa cut-off spin kolumn till en slutlig volym av 1-2 mL och lagra prov vid 4 ° C i 3-4 veckor.
Försiktighet: Får ej frysas provet sedan frysa leder till en fullständig förlust av RTA aktivitet. - Bestämma proteinkoncentration med en konventionell protein fastställande kit. Proteinkoncentration bör vara i intervallet 1-1,5 mg/mL.
Obs: RTA tenderar att fällningen om protein koncentrationen är för hög (> 5 mg/mL).
3. jäst omvandling och cellväggen borttagning
- Omvandla vildtyp eller valda jäst radering mutanter med GFP reporter plasmiden pRS315-K28SP- GFP6 använder standard litium acetat omvandling metoder14. Inkubera cellerna på leucin avhopp (d/o) glukos tallrikar (2% glukos, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfat, 0.17% jäst kväve bas (YNB) och 0.087% d/o mix utan leucin) vid 30 ° C i 2-3 dagar för positiva klon urval.
- Plocka 3 annan jäst kloner från varje platta och Inokulera klonerna i 100 mL av leucin d/o raffinos medium (2% raffinos, 0,5% ammoniumsulfat, 0.17% YNB och 0.087% d/o blanda utan leucin) vid 220 rpm och 30 ° C till OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 celler/mL).
Obs: Celltillväxt av de olika jäststammar radering är olika. Övervaka OD600 via en spektrofotometer. - För att beräkna OD600 värden, Späd prover till OD600 = 0.1-0.3 (1:5 till 1:10 utspädningar) och mäta OD600 i en spektrofotometer. Som referens, Använd H2O kompletteras med motsvarande belopp av leucin d/o raffionose medium.
- Efter efterbehandling steg 3.5, blanda 4 µL av spheroplasted 50 mL kultur med 496 µL spheroplasting buffert (cirka 2 × 106 spheroplasts) och Centrifugera i 10 min vid 400 x g.
- Återsuspendera pelleten i 10 mL H2O destillerat, vortex prov för 30 s och platta ut 10 µL av provet på leucin d/o glukos tallrikar (2% glukos, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfat, 0.17% YNB och 0.087% d/o mix utan leucin).
- Inkubera cellerna i 3 dagar vid 30 ° C. Räknas det totala antalet odlade cell kolonier på plattan. För utvärdering av data, använda endast prover med effektivitet högre än 98% (totalt kolonin mobilnummer < 40 kolonier/platta).
4. god Jordbrukarsed Reporter Assay mätning i 96 brunnar
- Utsäde ut de jäst cell spheroplasts erhålls i steg 3,7 till 96 brunnar (200 µL per brunn).
- Lägga till 70 µL stabiliserad leucin d/o raffinos medium som innehåller negativa kontrollen (eluatet av en Ni2 +-affinitet renat cell lysate från IPTG-inducerad E. coli -celler som uttrycker den tom vektorn) eller renade RTA i RTA koncentration av 5 µM ( motsvarande 160 g/L RTA) i varje brunn.
- Tillsätt omedelbart 30 µL stabiliserad galaktos lösning (30% galaktos, 0,8 M sorbitol) för att inducera GFP uttryck och därefter starta mätningen.
Obs: Utför minst 3 tekniska replikat per experiment och 3 biologiska replikerar per jäst stam. - Efter avslutad Provberedning (steg 4.1-4.3), sätta plattan med 96 brunnar i en fluorescens läsare och starta mätningen. Använda filtret 475/509 nm inställd krävs för god Jordbrukarsed fluorescens upptäckt. Utföra mätningar vid 30 ° C, 120 rpm, och med en skakning diameter av 1 mm över en tidsramen av 20 h (mäta med 10 min intervall).
Obs: GFP filtrera uppsättningen är normalt tillgänglig i alla läsare system. Temperatur, tidsfönster, mäta intervaller och RTA koncentration kan justeras för egna behov. Representativa resultat visas i figur 4. - Valfritt: Använd ytterligare interna kontroller i mätningen för kvalitetskontroll. Förbereda en negativ kontroll genom att lägga till 30 µL stabiliserad leucin d/o raffinos medium istället för 30% galaktos (ingen god Jordbrukarsed induktion). Lägg dessutom till 70 µL 0,8 M sorbitol stabiliserad G418 lösning (300 µg/mL). Den protein översättning hämmaren G418 fungerar som positiv kontroll för protein hämning eftersom den förhindrar GFP uttryck i jäst.
- Beräkna relativ god Jordbrukarsed fluorescens i procent för 20 h tidpunkten enligt följande ekvation (se figur 4A):
där NC är den negativa kontrollen
- Alternativt, bestämma den relativa GFP fluorescensen för varje mätpunkt (i detta fall 10 min, se även steg 4,4) med hjälp av ekvationen ovan. Som visas i figur 4B, skapa ett diagram genom att läska GFP fluorescens stödnivåerna (y-axeln) över tid (x-axeln).
där NC är den negativa kontrollen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det allmänna arbetsflödet för det protokoll som beskrivs i detta manuskript illustreras i figur 1, grovt sammanfatta de enda steg för framgångsrika RTA rening och efterföljande GFP reporter assay experimentet. En mer detaljerad beskrivning av varje enskilt steg kan hittas i protokollet. Figur 2 illustrerar det förväntade resultatet av en framgångsrik RTA rening genom affinitetskromatografi (figur 2A) och Tom vector kontroll (figur 2B). Figur 2 c visar ett representativt resultat av avsaltning experiment illustrerar perfekt separation av protein peak (blå) och salt-elueras peak (brun). En effektiv RTA rening presenteras i form av en Coomassie-färgade SDS-gel i figur 3. Figur 4 sammanfattar slutligen vissa ursprungliga resultat som erhålls med denna enkla och robusta GFP-baserade reporter analys metod6. Figur 4A illustrerar att etablerade GFP reporter analysen kan producera tillförlitliga resultat och schematiskt skildrar GFP reporter plasmiden används i denna studie. I diagrammet jämförs den relativa GFP fluorescensen av jäst spheroplasts RTA-behandlade och obehandlade villkor med varandra. Som förväntat, visar icke-inducerad samt G418-behandlade celler nästan ingen GFP fluorescens. I icke-behandlade och negativ kontroll-behandlas (tom vektor) celler, GFP uttryck påverkas inte och signifikanta skillnader mellan båda exemplaren observerades inte. Däremot leder RTA behandling till den förväntade GFP fluorescens reduktionen medieras av dess Ribosomen hämmande aktivitet. I figur 4Bvisas en tid-kurvan för RTA-inducerad GFP fluorescens hämning. Denna typ av presentation av data innehåller ytterligare information om timingen av GFP uttryck (90 min efter galaktos induktion) och startpunkten för translationell hämning av RTA (210 min efter applicering vildtyp celler). Förseningen i RTA-medierad fluorescens minskningen troligen avspeglar upptag kinetik och intracellulär transport av RTA till cytosolen. Figur 4 c visar den relativa GFP fluorescensen erhålls från valda jäst mutanter efter en 20 h RTA-behandling och jämfört med RTA-behandling och jämfört med RTA-behandlade vildtyp celler. ERAD komponenterna Hrd1p och Der1p valdes som lämplig positiva kontroller eftersom tidigare studier redan visat att båda proteiner är involverade i ER-till-cytosol retrotranslocation av RTA i jäst1. Därför visa både mutanter den förväntade ökningen i GFP fluorescens i jämförelse med vildtyp celler. Däremot är relativ god Jordbrukarsed fluorescens värden i Δyos9 och Δnup120 celler inte signifikant. Det har redan beskrivits att varken en brist av ER kvalitetskontroll lektin Yos9p eller en brist i nukleära pore proteinet Nup20p påverkar RTA toxicitet och transport1. En lista över parametrarna specifik affinitet för kromatografi och avsaltning kan hittas i tabell 1.
Figur 1: Generella arbetsflödet RTA rening och GFP-baserade reporter assay. RTA rening (vänster) börjar med transformering av E. coli med uttrycket eller tom vektor följt av odling och IPTG-inducerad RTA uttryck. Efter cell lysis och sterila-filtrering, supernatanten renas via Ni2 + affinitetskromatografi och prov renhet verifieras via Coomassie färgning eller Western blot. Innan de eluerade RTA fraktionerna är redo att använda i GFP reporter assay experimentet, fraktioner måste avsaltat och koncentrerad och proteinkoncentration måste bestämmas. GFP reporter assay experimentet (höger) börjar med omvandlingen av vildtyp och/eller valda jäst radering mutanter med den GFP uttryck konstruktion. Efter odling avlägsnas cellväggen genom enzymatisk behandling att tillåta RTA i vivo upptag. Sedan, GFP fluorescens av jäst cell spheroplasts mäts toxin-behandlade och obehandlade villkor över tid i en fluorescens läsare (475/509 nm). Slutligen, relativ god Jordbrukarsed fluorescens bestäms med hjälp av den ekvation som visas i steg 4,6 och visas som illustreras i figur 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa affinitetskromatografi och avsaltning resultaten av E. coli celler som innehåller pET-RTA(hans) 6 eller den tomma smittospridare. (A) typiska rening graf E. coli cell lysate prov uttrycker RTA(hans) 6 från vektor pET24-RTA(hans) 6. Blå kurva representerar den UV-absorptionen vid 280 nm orsakas av de aromatiska ringarna av aminosyror Trp, Tyr och Cys och serverar som protein indikator. Under kolumnen lastning upptäcks obundna proteiner i genomströmmande (0-10 mL). Efter bort obundna proteiner genom tvättning med bindande buffert, eluering buffert koncentrationen ökas från 0 till 100% (röd kurva) och bundna proteiner är omedelbart elueras från kolonnen. Toppen av den blå kurvan mellan 25 och 30 mL representerar fraktionen av bundna hans-taggade RTA (svart låda). (B) typiska rening grafen av en E. coli lysat från celler som uttrycker tom vector kontroll. Samma rening protokoll som i (A). Som visas i den svarta lådan, är inga proteiner elueras från kolonnen i den negativa kontrollen. (C) Desalting diagram E. coli pET24-RTA(hans) 6 prov efter affinitet rening. Diagrammet visar separering av den RTA protein fraktionen (topp 280 nm absorption mellan 20-30 mL) och den salt fraktionen (ökande konduktans peak efter 30 mL).Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: representant Western analys av olika prover före och efter affinitet rening. 20 µL cell lysate (körfält 2-4) eller renat provet (körfält 5-7) av RTA varianterna (bara omodifierade RTA användes i denna studie) analyseras av SDS-PAGE och Coomassie blå färgning. Lane 1, protein stege; Lane 2, omodifierade RTA; Lane 3, RTAHDEL; Lane 4, RTAKDEL; Lane 5, omodifierade RTA; Lane 6, RTAHDEL; Lane 7, RTAKDEL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat erhålls genom reporter analysen för RTA-behandlade vildtyp och valda jäst radering mutanter. (A) relativ god Jordbrukarsed fluorescens av vildtyp jäst spheroplasts som innehåller de reporter plasmiden pRS315-K28SP- GFP (höger) under inducerad (3% galaktos, GFPind.) och icke-inducerad (2% raffinos, GFPrepr.) villkor efter 20 h GFP induktion. Relativ god Jordbrukarsed fluorescens analyserades också i närvaro av RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) eller den negativa kontrollen (NC). Den protein översättning hämmaren G418 fungerar som positiv kontroll och förhindrar GFP uttryck i jäst. Medelvärden och standardavvikelse (SD) indikeras. (B) relativ god Jordbrukarsed fluorescens från (A) visas som tid kursen över 20 h. Detta diagram ger ytterligare information om timingen av GFP uttryck och översättning hämning av RTA; beteendet kurvan återspeglar indirekt kineticsen av RTA upptag och intracellulär transport till cytosolen. (C) representativa resultat av valda jäst mutanter defekt i cellulära proteiner som är kända för att vara inblandade (Hrd1p och Der1p) eller inte deltar (Yos9p och Nup120p) i RTA människohandel jäst1,6. Den streckade linjen representerar en tröskel av betydelse som baseras på fluorescens utsläpp erhålls genom den positiva kontroll stammar (se referens6för vidare förklaring). Medelvärden och standardavvikelse (SD) indikeras. Siffran ändrades från Becker et al. 6 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Affinitet chromotography parameter | ||
| Mäta parametrar | UV (280 nm), eluering buffert koncentration, konduktans | |
| Inställningar | Variabel/enhet | Värde |
| Flödeshastighet | mL/min | 1 |
| Maximala kolonninloppet | MPa | 0,35 |
| Våglängd | nm | 280 nm |
| Bindande buffert | Pump position | A |
| Eluering buffert | Pump position | B |
| Start koncentration eluering buffert | % | 0 |
| Systemet volym ersättning | mL | 10 |
| Kolumnen Jämviktstiden | mL | 20 |
| Prov injektion över superloop/spruta | mL | cell lysate volym |
| Tvätt steg | mL | 20-35 |
| Eluering steg | mL | 20-35 |
| Koncentration eluering buffert under eluering | % | 100 |
| Omkalibrering av kolonnen med 20% EtOH | mL | 50 |
| Avsaltning parameter | ||
| Mäta parametrar | UV (280 nm), konduktans | |
| Inställningar | Variabel/enhet | Värde |
| Flödeshastighet | mL/min | 4 |
| Maximala kolonninloppet | MPa | 0,35 |
| Våglängd | nm | 280 nm |
| Bindande buffert | Pump position | A |
| Eluering buffert | Pump position | B |
| Start koncentration eluering buffert | % | 0 |
| Systemet volym ersättning | mL | 10 |
| Kolumnen Jämviktstiden | mL | 20 |
| Prov injektion över superloop/spruta | mL | cell lysate volym |
| Avsaltning buffert injektion (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Omkalibrering av kolonnen med 20% EtOH | mL | 50 |
Tabell 1: parametrar som används för kolumnbaserade affinitet rening och avsaltning. Lista över alla relevant kolumninställningar (t.ex., flöde, eluering buffert koncentration, Jämviktstiden och tvätt steg varaktighet) och uppmätta parametrar (t.ex., konduktans eller UV-absorption).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När du utför det ovanstående protokollet, rekommenderar vi följande förslag att uppnå ett framgångsrikt resultat av experiment.
För heterologa proteinuttryck är det viktigt att inte överskrida IPTG koncentrationen av 1 mM. IPTG koncentrationer > 1 mM hämmar arrangören-inducerad RTA uttryck och leda till lägre toxin avkastning. Dessutom bör celler inte odlas vid högre temperaturer än 28 ° C att förhindra inkludering kroppen bildandet, ineffektiva vikning och toxin inaktivering. RTA uttryck vid lägre temperatur (t.ex., 20-28 ° C) är möjligt och också leder till produktion av biologiskt aktiva toxinet. Dock ytterligare temperatur minskning avsevärt förbättras inte RTA aktivitet/vikning och resulterar i en lägre totala toxin avkastning jämfört med 28 ° C (inga data anges).
Rening parametrarna för affinitetskromatografi (tabell 1) är optimerade för användning av en automatiserad reningssystem utrustad med 5 mL Ni2 + affinitet kolumn och bör anpassas till andra hemgjorda eller kommersiell kolumn system om RTA renhet och avkastning är optimalt. Vid optimala RTA renhet (indikeras av uppkomsten av ytterligare proteiner i Coomassie-färgade SDS-geler), en ökning av Imidazol koncentrationen av bindande bufferten normalt minskar ospecifik bindning av positivt laddade proteiner till det kolumn, därigenom öka övergripande RTA renhet. Vid optimala RTA avkastning, införandet av ytterligare placera mätkolven steg (4-8 pulser), längre inkubation gånger (5 h) eller större kulturvolymer (> 1 L) kan bidra till att förbättra den övergripande toxin avkastningen. Dock finns det också möjlighet att framgångsrikt rena RTA via spin kolumn baserat system (inga data anges) om ett automatiserat system inte är tillgänglig i labbet.
Under avsaltning steg är det viktigt att skippa provtagningsförfarandet så snart konduktans börjar stiga. Kontaminering med salt, särskilt Imidazol, påverkar det protein koncentrationsmätning, vilket resulterar i Felaktiga RTA koncentration bestämning som direkt påverkar RTA innehållet används i GFP reporter analysen.
Det är viktigt att lagra renat RTA vid 4 ° C och slippa frysa. Frysta prover visar en minskad aktivitet av RTA i XTT-baserade cell vitality analyser på HeLa cells (inga data anges). Renat prover kan hållas i cirka 3-4 veckor innan deras biologiska aktivitet minskas kontinuerligt. Kickkoncentrationer RTA (≥5 mg/mL) efter spin kolumn koncentrationen är dessutom kritisk eftersom RTA visar en tendens att utskiljas i 0,8 M sorbitol.
En nackdel med metoden är det faktum att RTA tas normalt inte upp av intakt jästceller. För att uppnå tillförlitliga resultat, behöver jästcellvägg avlägsnas helt genom enzymatisk behandling. Därför är det viktigt att kontrollera spheroplast bildandet effektiviteten i varje jästsort genom de metoder som beskrivs i steg 3,4-3.5. Vid optimala spheroplast förberedelse, bör den inkubationstid och lytisk enzym koncentration optimerad och övervakas via fas kontrast mikroskopi. Overdigestion (ghost bildande) kan förebyggas genom att minska lytisk enzym koncentration eller inkubation tid medan den motsatta strategin behövs vid otillräcklig matsmältningen. Data från stammar med otillräcklig cellväggen borttagning bör undantas från data utvärderingen.
Det bör också nämnas att den experimentella setup inte helt efterlikna naturliga berusning processen med ricin. Den cell bindande B subuniten av ricin (RTB) saknas vilket är normalt ansvariga för effektiv toxin bindning till galaktos rester på cellytan av däggdjursceller15. Teoretiskt, denna begränsning kan övervinnas genom att utföra experimentet med renat ricin holotoxin som innehåller dess A- och B-subenheten. Jästceller äger dock inte galaktos rester på deras cellytan som kunde medla bindningen av RTB8; Detta faktum förklarar också varför intakt jästceller inte är känsliga mot ricin. Det är således oklart om RTB skulle agera som cellen bindande komponent i jäst modellen. Intressant, visat tidigare studier redan att RTA ska kunna nå cytosolen av däggdjursceller utan dess cell bindande B subenhet16. För att förstå detta fenomen, beslutade vi att använda endast RTA i experimentell setup för att identifiera cellulära komponenter i jäst som underlättar toxin handel från plasmamembranet till cytosolen. Överraskande, visar komponenterna som är inblandade i RTA människohandel jäst slående likheter med de komponenter som krävs för effektiv ricin holotoxin transport i däggdjursceller6. Baserat på dessa resultat kan det vara spekulerade att RTB spelar en mindre roll i intracellulära ricin transport än tidigare tänkt och är bara viktigt för den inledande kontakten på däggdjursceller ytan.
Däremot siRNA-baserade system i däggdjursceller perfekt återspeglar naturligt toxin situation, men är tidskrävande och dyra3. Vidare användning av jäst radering mutanter bär den viktig fördelen som mutanter visar en fullständig knock-out av proteinet av intresse, medan siRNA-baserade system generellt leder till en minskning av protein nivån. I vissa fall kan restprotein nivåer vara tillräcklig för toxin transport där ingen förändrad fenotyp observeras och, således, medverkan av specifika protein är inte synlig i siRNA-baserade system.
Även om endast icke-väsentliga radering jäststammar användes i ursprungliga studera6, temperatur-känsliga stammar samt minskad överflöd av mRNA störning (DAmP) samling stammar17 (nedsatt uttryck nivå av väsentliga proteiner) är jämväl lämplig för denna typ av metod i framtiden. I allmänhet, rollen av viktiga proteiner inte kan undersökas med denna analys på grund av deras bristande lönsamhet, representerar därför en begränsning av assay systemet.
Dock representerar nya reporter analysen en elegant och alternativa strategi till befintliga metoder som försöker analysera RTA transport i modell organismen S. cerevisiae. De befintliga studierna används intracellulära plasmid-driven RTA uttryck system och är begränsade till analysen av det retro-translokationen från ER in i det cytosol1,7. Framgångsrikt genomförande av extracellulära RTA programmet nu öppnar möjligheten att inte bara studera ER retrotranslocation utan också att indirekt analysera RTA transport från PM men Golgi till ER.Som cellfunktioner och lokalisering av majoriteten av jäst gener upptäcks nuförtiden och tillgängliga i databaser, kandidat proteinerna kan fördelas direkt till särskilda fack eller transportera vägar.
Sammantaget representerar metoden infördes reporter assay en lätt och robust metod att identifiera kandidat proteinerna som är inblandade i intracellulära handel med gifter eller toxin subenheter (t.ex., RTA) som blockerar proteinet översättning i vivo. Relativt låga standardavvikelser (1-10%) samt hög reproducerbarhet i den ursprungliga studien bekräftar dessa påståenden. På grund av formatet plattan med 96 brunnar är en snabb genomgång av olika jäst mutanter möjligt inom en dag efter toxin rening.
I framtiden finns det möjlighet att använda metoden för high-throughput screening av jäst radering bibliotek. I den nuvarande setup är tillämpad RTA koncentrationen (5 µM) kunna minska den relativa GFP fluorescensen till 50%. Under dessa förhållanden erbjuder metoden för att identifiera radering mutanter med negativa (ökad GFP fluorescens) och positiva (minskad GFP fluorescens) effekter på RTA transport. För hög genomströmning filmvisningar är en starkare skillnaden mellan behandlade och obehandlade prover ibland fördelaktigt. Genom att använda högre RTA koncentrationer eller öka intervallet åtgärd (t.ex., 48 h), bör en ännu mer uttalad block av GFP uttryck uppnås.
Det ska understrykas att denna metod inte är bara begränsad för att analysera processen berusning av extracellulära tillämpad RTA i jäst, men det finns också möjlighet att analysera ER import av RTA genom att uttrycka RTA via en plasmid i denna GFP reporter stam (data inte visas). Dessutom kan metoden screening jämväl anpassas för att studera intracellulära transport vägar i andra Proteinbiosynthesis hämmande proteiner såsom zymocin18 i framtiden. I motsats till väl karakteriserade dödande funktionsläget av zymocin, är relativt lite känt om människohandel vägar ansvarar för effektiv toxin transport in i cytosolen19,20. Zymocin representerar därmed en optimal kandidat för framtidsstudier som zymocin tas givetvis upp av jästceller. Således, avlägsnande av cellväggen kan utelämnas vilket förbättrar den totala prestandan för god Jordbrukarsed reporter analysen (med avseende på tid och kostnader). Med hjälp av denna kraftfulla reporter analys vore det möjligt att dissekera den intracellulära transport Administrationsvägen av zymocin i jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Delar av denna studie var vänligt stöds av ett bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
