Summary

Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Biomatériaux dopé avec Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) ont servi d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir des fractures osseuses non syndiqués. Pour surmonter les effets secondaires résultant d’une incontrôlable libération du facteur, nous proposons une nouvelle stratégie au site-immobiliser directement au facteur, créant ainsi des matériaux avec des capacités améliorées d’ostéogéniques.

Abstract

Différentes stratégies thérapeutiques pour le traitement des défauts d’os longs non-guérison ont été intensivement étudiées. Actuellement utilisé traitements présentes plusieurs limites qui ont conduit à l’utilisation des biomatériaux en combinaison avec les facteurs de croissance ostéogéniques, tels que les protéines morphogénétiques osseuses (PGB). Méthodes couramment utilisées, absorption ou encapsulation requièrent des quantités supra-physiologique de BMP2, qui généralement donne un effet de sortie dite éclatement initial qui provoque plusieurs effets secondaires indésirables graves. Une stratégie possible de surmonter ces problèmes serait de façon covalente coupler la protéine à l’échafaud. En outre, couplage doit être effectuée d’une manière spécifique afin de garantir un résultat reproductible produit. Par conséquent, nous avons créé une variante de la BMP2, dans lequel un aminoacide artificiel (propargyle-L-lysine) a été introduit dans la partie mature de la protéine BMP2 par l’expansion de son utilisation de codon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk a été couplé à des perles fonctionnalisés par cycloaddition cuivre azoture-alcyne catalysée (CuAAC). L’activité biologique de la BMP2-K3Plk couplé a été prouvée in vitro et l’activité ostéogénique des perles BMP2-K3Plk-fonctionnalisés a été prouvée dans des essais sur des cellules de base. Les perles fonctionnalisés en contact avec les cellules C2C12 étaient capables d’induire l’expression de la phosphatase alcaline (ALP) localement limitée près du talon. Ainsi, fonctionnalisés échafaudages peuvent être produites par cette technique, qui peut déclencher la différenciation des cellules vers une lignée ostéogénique. En outre, des doses plus faibles de BMP2 sont suffisantes en raison de l’orientation contrôlée du BMP2 couplés dirigée. Avec cette méthode, les PGB est toujours exposés à leurs récepteurs sur la surface de la cellule dans l’orientation appropriée, ce qui n’est pas le cas si les facteurs sont couplés via des techniques de couplage non-dirigée. Le résultat produit est très contrôlable et, ainsi, résultats en matériaux dotés de propriétés homogènes, améliorer leur applicabilité pour la réparation de taille critique OS défauts.

Introduction

Le but ultime de la régénération de génie et d’os tissulaire osseuse est de surmonter les inconvénients et les limites qui se produisent durant les traitements courants des fractures non syndiqués. Auto – ou allo-greffes sont utilisés principalement comme des stratégies de traitement actuelles, même s’ils ont plusieurs inconvénients. La greffe osseuse idéale doit inciter l’ostéogénèse par Ostéoinduction ainsi qu’osteoconduction, ce qui entraîne l’ostéointégration de la prothèse dans l’OS. De nos jours, seulement auto-transplantation est considérée comme le « gold standard » puisqu’elle offre toutes les caractéristiques d’un greffon osseux idéal. Malheureusement, il présente aussi des aspects négatifs importants, tels que la chirurgie long temps et un second site de traumatisme qui généralement entraîne plus de complications (par exemple, la douleur chronique, formations de l’hématome, infections, défauts cosmétiques, etc.). Les greffes allogènes, ont en revanche sous-optimale caractéristiques pour tous les aspects généraux1. Technologies de greffe d’OS alternatifs ont été améliorées dans les dernières années, dans le but de produire des échafaudages ostéo-inducteurs, ostéoconducteur, biocompatible, et biorésorbables. Étant donné que nombreux biomatériaux ne présente pas toutes ces caractéristiques ostéogéniques, différents facteurs de croissance, principalement la BMP2 et la BMP7, ont été incorporés afin d’améliorer le potentiel ostéogénique de l’ échafaudage particulier2.

Comme un critère essentiel, ces vecteurs de facteur de croissance devrait fournir une dose contrôlée de libération au fil du temps afin de faciliter les événements essentiels comme la cellule recrutement et attachement, interposition cellulaire et l’angiogenèse. Cependant, PGB ainsi que d’autres facteurs de croissance ostéogéniques ont été généralement immobilisés façon non covalente3. Techniques de piégeage et d’adsorption nécessitent l’utilisation de quantités supra-physiologique de protéine suite à un communiqué de l’éclatement initial, qui entraîne des inconvénients graves in vivo, affectant généralement les tissus environnants en induisant la prolifération osseuse, 4ostéolyse, gonflement et l’inflammation. Ainsi, le maintien de facteurs de croissance sur le site de livraison pour des périodes plus longues sont possibles par des méthodes d’immobilisation covalente. Chimiquement modifiées BMP2 (succinylé5, acétylés6 ou biotinylé7), ingénierie des hétérodimères8ou BMP2 oligopeptides dérivées9 ont été conçues et utilisées pour surmonter les limitations liées à absorption. Toutefois, la bio-activité de ces constructions n’est pas prévisible puisque l’arrangement potentiellement inhibe la liaison du ligand immobilisé sur les récepteurs cellulaires. Comme indiqué précédemment, il est essentiel que tous les quatre chaînes de récepteurs impliqués dans la formation des complexes activés ligand-récepteur interagissent avec la BMP2 immobilisée afin d’activer pleinement tout en aval de cascades signalisation10.

Pour surmonter les problèmes de l’issue de produits non homogènes avec des limitations en termes de bioactivité, stabilité et la biodisponibilité du facteur “immobilisé”, nous avons conçu une variante BMP capable de se lier par covalence échafaudages de façon dirigée. Cette variante, appelée BMP2-K3Plk, comprend un acide aminé artificiel qui a été présenté par codon génétique expansion11. Cette variante a été liée avec succès pour les échafaudages en utilisant une stratégie de couplage covalent tout en conservant son activité biologique.

Protocol

1. production de la BMP2 variante BMP2-K3Plk Clonage de BMP2-K3Plk par mutagénèse dirigée par PCR 12 Amplifier la BMP2 maturité humaine (hmBMP2) d’un vecteur de p25N-hmBMP2 (voir la Table des matières) avec une amorce vers l’avant (5′ GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3′) et une amorce de marche arrière (5′ CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3′) présentant une (de codon stop ambre TAG) à la position de la lysine première partie matu…

Representative Results

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour atteler par covalence une nouvelle variante de la BMP2, BMP2-K3Plk, à commercialement disponible azoture fonctionnalisé agarose perles (Figure 1). La bioactivité de la variante de BMP2-K3Plk produite a été validée par l’induction de l’expression génique dans les cellules C2C12 phosphatase alcaline (ALP). Le test in vitro montre des niveaux d’expression semblables ALP induites par le typ…

Discussion

Générant des variants protéiques marqués par expansion de codon génétique permet l’introduction de divers acides aminés non naturels analogues, principalement dans la position de la séquence protéique primaire. Dans le cas de PGB comme BMP2, common tags comme une balise 6-Histidine (His) ne peut être introduit N-terminale, depuis la fin de protein´s C-terminal est enterrée au sein de la structure tertiaire protéique et n’est donc pas accessible de l’extérieur. En d’autres positions, la taille de la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Dr M. Rubini (Constance, Allemagne) pour fournir le plasmide codant pyrrolysyl-tRNA et de fournir des pRSFduet-pyrtRNAsynth, codant la correspondante aminoacyl-ARNt synthétase.

Materials

Material
1-Step NBT/BCIP Thermo Fisher 34042 Add solution to cells
3-Azido-7-hydroxycoumarin BaseClick BCFA-047-1 Chemical used for click reaction
Agarose low melting point Biozym 840101 Agarose for ALP assay 
Azide agarose beads Jena Bioscience CLK-1038-2 Beads used for reaction
BamHI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific FD0054 Restriction enzyme
BMP receptor IA (BMPR-IAEC) Produced in our lab
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye Thermo Fisher Scientific 20279 Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE
Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) Alfa Aesar A13986 Chemical used for click reaction
DNA Polymerase and reaction buffer  Kapabiosystems KK2102 KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX Gibco 61965-026 Cell culture media
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich GmbH E5134-1kg Chemical used to stop click reaction
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Carl Roth GmbH 2316.5 Bacteria induction (1mM final concentration) 
NdeI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific ER0581 Restriction enzyme
NHS-activated Texas Red Life technologies T6134 Coupled to receptor
P- Nitrophenyl Phosphate Sigma Aldrich GmbH N4645-1G Alkaline Phosphatase
p25N-hmBMP2  Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel
pET11a-pyrtRNA Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk) Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Gel Purification
Qiagen PCR purification Kit Qiagen 28104 PCR Purification 
Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich GmbH A7631-100G Chemical used for click reaction
T4 DNA Ligase ThermoScientific EL0011 Ligation 
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) BaseClick BCMI-006-100 Chemical used for click reaction
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma Aldrich GmbH X100-1L Triton X 100 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml  Merck KGaA UFSC40001 Concentrating unit
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck KGaA UFC901024 Concentrating centrifugal unit
ÄKTA avant FPLC ÄKTA FPLC machine
Avanti J-26XP Beckman Coulter  393124 Centrifuge for bacterial culture
Bacterial Shaking Incubator Infors HT Shaking incubator for bacterial culture
FluorChem Q system proteinsimple Imaging and analysis system for SDS-PAGE
Fluorescent miscroscope Keyence BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3 (M) Merck KGaA 116882 Ion Exchange Chromatography column material
Greiner CELLSTAR® 96 well plates Sigma M5811-40EA 96 well plates for cell culture (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R ThermoScientific Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor ThermoScientific 75003624 Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining
Microcentrifuge – 5417R Eppendorf Centrifuge
OriginPro 9.1 G  OriginLab software for stastic analysis of ALP assay data
Polysine Slides ThermoScientific 10143265 microscope slides
Rotor JA-10 Beckman Coulter  rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JLA 8.1 Beckman Coulter  rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JA 25.50 Beckman Coulter  rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Tecan infinite M200 multiplate reader Tecan Deutschland GmbH Multiplate reader for ALP assay
Thermocycler – Labcycler Gradient SensoQuest GmbH PCR
TxRed – microscope filter Keyence Filter for fluorescent microscope 
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa Merck KGaA PLBC04310 used with amicon concentrating cell 400ml
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa Merck KGaA PLGC04310 used with amicon concentrating cell 400ml

References

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Cite This Article
Siverino, C., Tabisz, B., Lühmann, T., Meinel, L., Müller, T., Walles, H., Nickel, J. Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry. J. Vis. Exp. (133), e56616, doi:10.3791/56616 (2018).

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