遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを使用できます、条件の広い範囲の下で発光細胞から長手記録です。ワニ、概日リズム研究のコンテキストで使用される方法を紹介します。
細胞の遺伝子発現のレポーターをルシフェラーゼ ベースは、縦方向の両方の広範な使用とエンドポイントを生物学的活性の試金。概日リズム研究のたとえば、ホタルのルシフェラーゼと時計遺伝子の融合を生じさせる堅牢なリズムで数日間保持細胞生物発光。技術的な制限は、光電子増倍管 (PMT) に関連付けられているまたは発光定量化のため従来の顕微鏡ベースの方法は通常の間にかなり非生理的条件下で細胞や組織が維持されることを要求しています。感度とスループットのトレードオフで録音。ここで、異なる高感度可変ガス ・湿度制御を含む培養条件の広い範囲をサポートする、受け入れる多くのスループットと長期的な生物発光イメージングを可能にする従来の方法の改良を報告します。組織培養プレートと料理。またガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージングこの自動縦ルシフェラーゼ単層細胞またはティッシュ、従来容易に観察することはできません間ルシフェラーゼ発現の空間変動の観測が可能します。メソッド。我々 はワニがルシフェラーゼ活性既存手法と比較した場合の検出の非常に高い柔軟性を実現する方法を強調表示します。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現と蛋白質の活動の記者としての分子細胞生物学研究の一般的な手法となっています。これはホタルのルシフェラーゼの合成と触媒不活性化の速度が約 24 h の概日サイクルにわたって発生する遺伝子発現の変化をレポートに特に適して概において当てはまります。など、ルシフェラーゼは有機体、菌類、植物、ハエ、哺乳類1,2,3、4などの広い範囲にわたって概記者として採用されています。
概日遺伝子発現の in vitroの定量化、光電子増倍管 (PMT) は発光信号を記録する通常使用されます。光電子増倍管を用いた測定柔軟性が限られてしかし、通常、あらかじめ決められた版か皿サイズに制限されています。じゃはまたイメージングのルシフェラーゼ発現のばらつきを示すサンプル情報の損失につながることができる光電子増倍管を使用して監視のサンプルから空間情報を収集することが可能ではないです。また、光電子増倍管と関連する電子工学標準細胞文化のインキュベーターの加湿環境にさらされたときに誤動作しやすいが、光電子増倍管を用いた縦ルシフェラーゼ記録は非加湿インキュベーターで常に実行されます。その結果、細胞培養皿の気密性の高い蒸発による水分の損失を防ぐために密封されなければならないし、文化メディアは 3-したがってバッファーする必要があります (Nmorpholino) propanesulfonic 酸 (モップ) または 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) ではなく、生体内で機能し、哺乳類の組織培養で日常的に使用されているシステムをバッファリング CO2/bicarbonate。
これらの制限の結果として光電子増倍管による生物発光の測定は通常細胞、実験間は保持される条件に制約を配置します。我々 が、標準的な CO2/N2 170 L 培養インキュベーター、水・低温電子-乗算の添加により適応したを使用してこれらの問題を克服するために、また可能な実験条件の範囲を拡大するには曇らない光学およびデジタル制御温度やガスの電荷結合素子 (EMCCD) カメラ。これは縦ルシフェラーゼ イメージング ガスの自動化や Temperature-Optimized レコーダー、ワニと呼ばれています。ワニ生物発光イメージング、両方標準的な組織培養プレートの高速イメージングのための大幅に高められた柔軟性を可能 (最大 6 x 96 または 384-ウェル プレート同時に) およびまた標準培養システム、そのような灌流セルとしてマイクロ流体デバイスで栽培。この楽器も両方 CO2 O2分圧と温度可変制御と加湿条件下で発生するイメージングできます。
以下のプロトコルでは、哺乳類の細胞の培養システム (今後 ‘発光インキュベーター’ というワニを使用して発光記録する方法について説明します。しかし、システム生物発光イメージング、また、いくつかの変更は、他の生物学的システムとコンテキストの数でのイメージングに適してこと、注意すべきであります。
ここで説明されているプロトコルは、哺乳類細胞培養、灌流および静的な条件の下で両方のです。しかし、ワニは簡単に他のモデル システムに適応できます。確かに、それが運動、睡眠とキイロショウジョウバエ暗黒15.の下で維持される周辺遺伝子発現リズムの同時監視するための優れたプラットフォームを提供するために示されて既にいます。ここに記載されている以外のカメラの種類のアプリケーションによっては、適切にする可能性がありますをまた指摘しました。我々 は、適切なフィルターで変更されたバージョンの現在のセットアップされる可能性がありますプリンシパルの蛍光定量を想定します。
ワニできない可能性があります適切な唯一のアプリケーションは、特に高空間分解能は、哺乳類の脊髄スライスにおける PER2::LUC 発現の時空間組織のイメージングなど、必要です視交叉上核やその他の小さな切片。
ワニは、これまでの従来の録音技術によって容易に達成されていない実行する多くの実験できます。生物発光の測定に対する現在の方法と比べると、ワニは、細胞培養ディッシュまたは使用できるスライド、外部メディア条件、感度、およびドメインの両方のタイプの柔軟性の向上を提供します。
これは特に関連して同時に 3 D organoid 文化システムに向けて標準的な 2次元細胞モデルから移動がある場合。など、ワニが多くの幾日および週の条件の広い範囲の下に、生物発光を測定できます適応メソッドを提供すると予想されます。
The authors have nothing to disclose.
我々 は特にマーク ・ ヘンソン、ジェレミー ・ グラハムとジョアン ・ コレイア、このシステムの開発に協力してくださった、ケアン研究を感謝したいです。我々 もありがとうデイヴィッド ウェールズ語とアクヒレシュ ・ レディ (旧浜松市) のピーター ・ ラスキーと同様、設計段階の間に貴重な議論のための原稿に彼の重要な入力デモ カメラとデビッド ・ ウォンのローンの手配します。
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |