1. siembra y arrastre de la temperatura de las células Nota: Este protocolo ha sido rigurosamente probado usando fibroblastos de ratón primaria e inmortalizado expresando la de proteína de fusión PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)4. Ajustes pueden necesitar que se hagan experimentos con otras líneas celulares. Antes de comenzar el cultivo celular, colocar en un baño de agua de 37 ° C para calentar el siguiente: tampón fosfato salino PBS (PBS) (pH 7.4), suplementado con ácido etilendiaminotetracético de 0,68 mM, pH 7.2 (PBS + EDTA), medios de cultivo celular adecuado, por ejemplo, Medium (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL y solución al 0.25% tripsina. Diluir con solución de PBS + EDTA con tripsina 1:3 y volver al baño de agua. Tomar un matraz de 125 cm2 de células de expresión de luciferasa que son 70-90% confluente. Aspire los medios de comunicación. Añadir 10 mL PBS precalentada. Aspire el PBS. Añadir 2,5 mL con tripsina-EDTA y regrese el frasco a una incubadora de 37 ° C durante 5 minutos. Eliminar las células de la incubadora y ver bajo un microscopio. Una vez que la mayoría de las células ha desprendido de la parte inferior del frasco, continúe al siguiente paso. Si la mayoría de las células permanece adherida a la parte inferior del frasco, devuélvalo a la incubadora hasta que mayoría de las células en suspensión. Añadir 7,5 mL de medio de cultivo celular estándar más en el matraz. Opcionalmente, extraiga 1 mL de esta para otro paso de las células, según sea necesario. Contar la densidad de las células restantes utilizando un hemocitómetro y trypan blue. Diluir las células más lejos, como apropiado para esa línea celular.Nota: Para los experimentos siguientes, PERIOD2::LUC fibroblastos fueron sembrados entre 6 x 103 células/cm2 y 1 x 104 células/cm2 en placas de 96 pocillos, platos de 35 mm o transparencias de canal. Células de semilla en el cultivo de tejidos platos o placas que se utilizarán para la grabación.Nota: Recomienda utilizar negro echado a un lado, con fondo claro las placas ya que esto permite cultura salud evaluarse antes de comienzan a grabaciones, reduciendo interferencia entre pozos durante la grabación. Donde bioluminiscencia niveles son extremadamente bajos, platos/placas blancas debe utilizarse para maximizar la detección de luz, aunque por favor tenga en cuenta que la fosforescencia puede conducir a mayor señal de fondo que persiste por varias horas. Devolver las placas en la incubadora y permiten monocapas llegar a la confluencia del 100% (aproximadamente 7 días).Nota: Una vez confluentes, líneas de células que inhiben el contacto pueden mantenerse hasta tres semanas antes de la experimentación siempre que los medios de comunicación se actualizan regularmente (cada 5-7 días). Una vez confluentes, sincronizar ritmos celulares usando ciclos de temperatura aplicada (12 h a 32 ° C, 12 h a 37 ° C) durante un mínimo de 72 h inmediatamente antes de la experimentación5,6 (utilizando una incubadora ciclo previamente programada, controlado por un ordenador conectado a la incubadora a través de un puerto serie RS-232).Nota: El número de ciclos de temperatura necesaria para la sincronización de los ritmos celulares puede variar entre las líneas de las células y por lo tanto deban ser optimizados para otras líneas celulares. Estimulación farmacológica aguda con forskolin o dexametasona se ha utilizado anteriormente para sincronizar ritmos celular7,8. 2. NS21 preparación Nota: NS21 es un suplemento libre de suero para el mantenimiento de cultivos de células neuronales y otros. Es un refinamiento de un suplemento similar conocido como B27, que está comercialmente disponible y puede ser utilizado como un reemplazo de suero durante el circadiano bioluminiscencia grabaciones9. Cualquier suplemento puede utilizarse indistintamente en los medios de grabación de los protocolos experimentales que se describen a continuación. Es bastante factible y rentable para hacer NS21 interno, como en Chen et al. 10y como se describe aquí. Equilibrar todos los componentes descritos en la tabla 1 a temperatura ambiente durante 1 h antes de empezar. Disuelva el albúmina bovina 50 g en medio basal de 324 mL (por ejemplo, neurobasal) en hielo. Revolver la mezcla lo menos posible. Añadir todos los otros componentes, como mínimo revolviendo después de cada componente pero todavía asegurándose la mezcla completa. Pretenden disolver todos los componentes de 90 min de empezar. Alícuota de la mezcla final y almacenar a-20 ° C hasta que se. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.Nota: La mezcla es demasiado viscosa para filtrar en esta etapa, pero será estéril filtrado diluyendo con los medios de comunicación antes de agregar a las células. 3. registro preparación de medios de comunicación Nota: Una ventaja principal de la incubadora de bioluminiscencia sobre otros equipos para la grabación longitudinal bioluminiscencia es que, en virtud de ser capaz de humectar la incubadora y variar la presión parcial de O2 y CO2, es posible utilizar una gama más amplia de las condiciones de los medios de comunicación de bioluminescence de grabación, incluyendo las condiciones que más estrechamente aproximan el fisiológico nicho ocupado por células diferentes tipos en vivo. A continuación se describe la formulación de grabación de medios adaptados de Hastings et al. 9, que hemos utilizado rutinariamente con fibroblastos cultivados y otros tipos de células. La primera es para condiciones de cultivo cerrado (sin intercambio de gases), y la segunda es para condiciones fisiológicamente relevantes y puede usarse bajo condiciones humidificadas con 5% CO2.Muchas otras variaciones son posibles y convenientes, dependiendo de la aplicación exacta y tipo de la célula. Preparación de medios de glucosa alta tamponado con MOPSNota: Archivo de solución (1 L): polvo DMEM (8,3 g/L), glucosa de 5 mg/mL de bicarbonato de sodio, de 0,35 mg/mL, Lampazos de 0.02 M, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100. Disolver 8,3 g DMEM polvo en 900 mL de agua ultrapura en una probeta de 1000 mL y agitar durante 30 minutos hasta que se disuelvan todas las partículas. Añadir 50 mL de solución de glucosa (100 g/L), 20 mL de mopas (1 M, pH 7.6), 10 mL de 100 x solución de pluma/strep y revuelva por un 10 min más. Agregue una solución de bicarbonato de sodio de 7.5% 4,7 mL y agitar durante un minuto 5 más. Ajustar el pH de los medios de comunicación a 7,6 (si a temperatura ambiente) o 7.4 (37 ° C) con HCl/NaOH. Añadir agua ultrapura para producir un volumen final de 1000 mL. Esterilizar por filtración a través de un 0,22 μm filtro y almacenar a 4 ° C hasta que se. Antes de la experimentación, suplemento de un volumen apropiado de solución madre con 10% de suero, 2 mM L-Alanil-L-glutamina, luciferin NS21 el 2% y 1 mM para hacer una bolsa de trabajo. Pasar esta población a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Medir la osmolalidad de los medios de comunicación utilizando un osmómetro. Encienda el osmómetro. Calibrar el osmómetro, primero con agua ultrapura. Añadir 50 μl de agua a la parte inferior de un recipiente de medición. Asegúrese de que hay no hay burbujas en el líquido. Enganche el vaso sobre la sonda. Pulse ‘Cero’ y baje con cuidado el brazo de osmómetro al punto más bajo. Espere hasta que la lectura es completa y verde ‘resultado’ se enciende antes de levantar el brazo y retirar el buque. Repita el procedimiento para calibrar el osmómetro a 300 mOsmol/kg usando el estándar de calibración de 50 μl. Presione ‘Cal’ antes de bajar el brazo. Medir la osmolalidad de la muestra mediante la adición de 50 μl de los medios de comunicación a la parte inferior de un buque y medida como la anterior medición. Pulse ‘muestra’ antes de bajar el brazo del osmómetro. Ajustar la osmolalidad a 350 mOsmol ClNa 5 M. HCO3-tampón preparación de medios (media de perfusión) glucosa bajaNota: Archivo de solución (1 L): polvo DMEM (8,3 g/L), 3,7 mg/mL bicarbonato de sodio, glucosa 1 mg/mL, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL. Disolver 8,3 g DMEM polvo en 900 mL de agua ultrapura en una probeta de 1000 mL y agitar durante 30 minutos hasta que se disuelvan todas las partículas. Añadir 50 mL de solución de glucosa (100 g/L), 10 mL de solución de pluma/strep x 100 y agitar durante un minuto 10 más. Agregue una solución de bicarbonato de sodio de 7.5% 49,4 mL y agitar durante un minuto 5 más. Ajustar el pH de los medios de comunicación a 7,6 (a temperatura ambiente) o 7.4 (37 ° C) con HCl/NaOH. Añadir agua ultrapura para dar un volumen final de 1000 mL. Pasar la solución a través de un 0,22 μm filtro estéril y conservar a 4 ° C hasta su uso. Antes de la experimentación, suplemento de un volumen apropiado de solución con 2% de suero, 2 mM L-Alanil-L-glutamina, 2% NS21 y luciferin de 1 mM para hacer una bolsa de trabajo. Pasar esta población a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Medir y ajustar la osmolalidad a 350 mOsmol ClNa 5 M, en cuanto a los medios de comunicación tamponado con MOPS. Nota: Luciferin concentración debe determinarse empíricamente para cada tipo de célula y el contexto. Para más información véase Feeney et al. 11 suero y NS21 (o B27 si usa) las concentraciones pueden variar dependiendo de la aplicación. Sin embargo, aconsejamos que, a menos que empíricamente probados para demostrar lo contrario, suero y NS21 suplemento alternativo libre de suero) puede usar (o, como estos promueven apego y supervivencia celular. En líneas celulares que no tienen contacto con inhibir así, puede ser necesario reducir la concentración sérica en los medios de grabación para evitar confusión efectos de proliferación, que es promovido también por el suero. 4. grabación Antes de comenzar la grabación, coloque el stock de medios de trabajo adecuados (del paso 3.1 o 3.2 según el experimento) en un baño de agua de 37 ° C para calentar. Mientras que los medios de comunicación se está calentando, enfoque la cámara en la incubadora de la bioluminiscencia. Desenroscar el filtro de densidad neutra agua impermeable, caliente y reservar. Configure el software para grabar un video con una tasa de adquisición alto. Haga clic en “adquisición | Configuración de la adquisición”. Establecer ‘Tiempo de exposición’ en 0,2 s y tiempo de ciclo cinético de 0.3 segundos. Asegúrese de que ganancia EM está apagada. Cerrar la ventana de ‘Configuración de adquisición’ y haga clic en el icono “tomar video”. Usando el cilindro de enfoque, gire el lente de la cámara hasta artículos en el estante a la altura para ser grabada claramente en foco en el video. Parar el vídeo haciendo clic en el icono ‘stop video’. Atornille el filtro de densidad neutra climatizada en posición; no hacerlo resultará en daños a la cámara EM-CCD o empaña el objetivo debido a la condensación. Establezca O2, CO2y temperatura en las condiciones experimentales deseadas usando el panel de control en el frente de la incubadora de la bioluminiscencia.Nota: En caso de perfusión cultivo celular proceda directamente a la sección 5 en esta etapa. Eliminar las células de la incubadora de cultivo de tejidos y aspirado de los medios de comunicación. Sustituir los medios de comunicación con stock de trabajo. Si la incubadora de la bioluminiscencia no humidificado durante el experimento, luego selle los platos y placas con un sello de gas impermeable.Si la incubadora bioluminiscencia debe ser humidificado, entonces no es estrictamente necesario sellar platos, aunque es preferible para platos con un volumen pequeño, tales como placas de 96 pozos, utilizando un sello permeables al gas, como una pequeña cantidad de evaporación posible de lo contrario el sello todavía ocurren incluso en incubadoras humidificados.Nota: La humidificación se logra llenando la bandeja de agua en la base de la incubadora. Transferir las células a la incubadora de bioluminiscencia, cierre la puerta de la incubadora y segura incubadora cubren en su lugar para formar un sello hermético a la luz. Seleccione los parámetros de grabación apropiados para la aplicación. Haga clic en “adquisición | Configuración de la adquisición”. En el panel de ‘Configuración de la cámara’, establece: ‘Modo de adquisición’ para ‘Cinética’; ‘Tiempo de exposición a deseado tiempo de exposición, en segundos (ver nota más abajo); ‘Acumulaciones’ 1; ‘Longitud de serie cinética’ al número de ciclos de adquisición deseada; ‘Tiempo de ciclo cinético’ intervalo imagen deseada (Asegúrese de que esta es mayor que el tiempo de exposición); Cambio de velocidad a 4,33 µsecs; ‘Ganar’ a 1; y em ganar ‘ la nivel (ver nota más abajo) En el panel de ‘Guardado’, defina el tipo de archivo .sif o .tif. Proporcionar un nombre de archivo y apropiado guardar ubicación. En el panel de ‘Cola’, defina el tipo de archivo a BMP. Proporcionar un nombre de archivo y apropiado guardar ubicación. Cierre la ventana de configuración de la adquisición. Iniciar la grabación haciendo clic en el botón ‘tome señal’.Nota: Como la incubadora de la bioluminiscencia puede ser utilizada para un gran número de diferentes células y tipos de tejidos, los cuales tendrán diferentes niveles de bioluminiscencia, el tiempo de exposición necesario para recoger una señal bioluminiscente adecuada variará entre experimentos. También es posible variar la ganancia (EM) multiplicación de electrones de la imagen con el fin de aumentar la magnitud de la señal recogida. Para nuevas aplicaciones de brillo desconocido, sugerimos en primer lugar tomar una sola imagen con un tiempo de exposición relativamente corto (alrededor de 10 minutos) sin aumento de EM y posteriormente ajustar el tiempo de exposición y EM aumento hasta que las condiciones de grabación deseado han sido alcanzado. En la mayoría de los casos, una señal promedio de 10-20% de la intensidad máxima posible píxeles de la cámara es un buen nivel para apuntar para. Una vez que se ha alcanzado un conjunto de parámetros de grabación, iniciar longitudinal adquisición de imágenes, como se describe anteriormente. 5. perfusión cultivo de tejidos (opcional) Nota: Como se describe en la introducción, la incubadora de la bioluminiscencia es adecuada para la proyección de imagen de los sistemas de cultivo de tejidos no estándar. Esto se ejemplifica en el desarrollo de un sistema de cultivo celular perfundidos. Semilla de las células en un canal se desliza con conectores tipo Luer con una profundidad de canal de 0,6 o 0,8 mm, en DMEM con 10% FBS y pluma/strep, tal como se describe en la sección 1. Hacer los medios de perfusión como se describe en el paso 3.2. Antes de la grabación, preparar la tubería para el sistema de perfusión requiere con 1 mm de diámetro interno (I.D.) Tubería de ETFE y tubo de silicona de 1 mm de diámetro interior, codo, hombre y mujer accesorios Luer, como se muestra en la figura 2A.Nota: La mayoría de la longitud de la tubería es tubería de ETFE, con secciones de 2 cm de tubo de silicona para conectar la tubería de ETFE los accesorios Luer, que posteriormente en las correderas de canal. Esterilizar el tubo por lavado con etanol al 70%, seguido de PBS estéril. Eliminar los cultivos celulares en portaobjetos de canal de la incubadora. Aspire los medios de comunicación y reemplazar con medios de perfusión previamente calentado. Llene una jeringa de 20 mL con los medios de comunicación con la perfusión. Conecte la tubería al buffer de diapositiva (ver figura 2) pero no a la diapositiva que contiene el celular y al ras del tubo y deslice con medios de perfusión (3-5 mL). Conectar la diapositiva que contiene la célula y eliminar todo el sistema con un 1 mL adicional de medios de comunicación para eliminar las posibles burbujas de aire. Transferencia de todo el sistema a la incubadora de la bioluminiscencia. Ajuste las jeringas llenas de medios a la jeringa de la bomba sin desconectar el tubo y enjuague 1 mL más de los medios de comunicación a través de todo el sistema usando la bomba para asegurar allí son ningunas burbujas de aire en el sistema. Establecer el diámetro de la bomba para la jeringa que se utiliza.Nota: Para las jeringas de 20 mL utilizadas aquí, el diámetro es de 19,13 mm. Fijar el caudal de la bomba a 50 μl/h y empieza funcionando. Asegúrese de que no hay burbujas en la tubería antes del comienzo de la grabación, ni diapositivas ya estas influenciará la expresión de luciferasa cuando pasan a través de la monocapa celular. Si es necesario, enjuague más medios de comunicación a través de las células para lograrlo. Cerrar la puerta de la incubadora de bioluminiscencia y continuar como en el paso 4.7 para comenzar a grabar. 6. el tratamiento durante la grabación Nota: A veces es deseable para el tratamiento de la mitad de las células a través de una grabación, ya sea con agentes hormonales o farmacológicos. En tales casos, es imprescindible que las células se tratan con cuidado para evitar la oscilación celular de reajuste durante el tratamiento. Por esta razón, es de especial importancia que las células se mantienen a una temperatura constante, ya que es un gran cue arrastra para celular circadiano5,6. Preparar todos los componentes del tratamiento antes de detener la grabación. Preparar una almohadilla química isotérmica a 37 ° C. Detener la grabación del dispositivo, retire los platos a tratar y colocar sobre la almohadilla de calor isotérmica. Tratar a las culturas como necesarios y retorno a la incubadora de la bioluminiscencia en la misma posición que antes. Vuelva a iniciar la grabación. 7. Análisis Nota: La incubadora de bioluminiscencia produce datos en forma de una serie de imágenes individuales.Utilizamos principalmente Fiji12 para manejar estas imágenes y luego exportar los datos de intensidad de píxeles promedio para cada región de interés (ROI) para su posterior análisis. Abra la pila imagen en Fiji y ajustar el brillo y el contraste haciendo clic en “imagen | Ajustar | Brillo/contraste”y el ajuste de las barras de desplazamiento hasta imágenes dentro de un rango apropiado para la visualización de la señal bioluminiscente. Seleccionar áreas de interés mediante el administrador de retorno de la inversión en “analizar | Herramientas | ROI Manager”. Señal promedio de exportación del área seleccionada haciendo clic en “Administrador de ROI | Más | Cualquier”. Copiar los datos en el software de análisis. Ajustar manualmente la base de tiempo de datos para el intervalo de tiempo de la proyección de imagen (es decir, 15, 30 o 60 min intervalos, descritos como 0.25, 0.5, 1 h) en lugar del número de la imagen proporcionada por Fiji.Nota: El análisis adicional puede ahora realizarse, como determinación del período. Para esto, la siguiente ecuación se utiliza para realizar análisis de regresión no lineal: donde y es la señal, x el tiempo correspondiente, m es la pendiente de la línea de tendencia, c es el intercepto y de la línea de tendencia, amplitud es la altura del pico de la onda por encima de la línea de tendencia, k es la constante de decaimiento o la tasa de amortiguación (tal que 1k es el Half-Life), la fase es el cambio en x de la onda coseno, y el período es el tiempo tomado para que un ciclo completo producir13. Valor de R2 se utiliza como indicador de la bondad de ajuste. También son posibles otros métodos de análisis. Las primeras 24 h de la adquisición deben ser excluida del análisis, como celular bioluminesence puede presentar cambios transitorios, no circadiano durante este tiempo. Este es el resultado de una respuesta aguda a cambio de los medios de comunicación.