Luciferase geneticamente codificado é um repórter popular não-invasivo da expressão do gene. Uso de um automatizado do longitudinal luciferase gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) de imagem permite gravação longitudinal das células bioluminescentes sob uma ampla gama de condições. Aqui nós mostramos como jacaré pode ser usado no contexto de pesquisa de ritmos circadianos.
Repórteres do luciferase-baseado da expressão gênica celular estão em uso difundido para ambos longitudinal e ensaios de ponto de extremidade de atividade biológica. Na pesquisa de ritmos circadianos, por exemplo, fusões de gene relógio com luciferase de vaga-lume dar origem a ritmos robustos em bioluminescência celular que persistem por muitos dias. Limitações técnicas associadas com tubos fotomultiplicador (PMT) ou os métodos baseados em microscopia convencionais para quantificação de bioluminescência tipicamente exigiram que as células e tecidos ser mantida sob condições bastante não-fisiológicas durante gravação, com um trade-off entre a sensibilidade e a taxa de transferência. Aqui, nós relatamos um refinamento dos métodos anteriores que permite imagens de bioluminescência a longo prazo com alta sensibilidade e taxa de transferência que suporta uma ampla gama de condições de cultura, incluindo gás variável e controle de umidade, e que aceita muitos diferentes placas de cultura de tecido e pratos. Este luciferase longitudinal automatizada de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) também permite a observação das variações espaciais na expressão do luciferase em uma monocamada de células ou tecido, que não pode ser observado prontamente pelo tradicional métodos. Destaca-se como o jacaré fornece uma flexibilidade muito maior para a detecção de atividade de luciferase quando comparado com os métodos existentes.
O uso de luciferases como repórteres da expressão gênica e atividade de proteína tornou-se uma técnica popular em pesquisa da biologia molecular e celular. Isto é verdadeiro no campo circadiano, onde a cinética da síntese de luciferase de vaga-lume e inativação catalítica são particularmente adequados para relatar as mudanças longitudinais na expressão gênica que ocorrem durante o ciclo circadiano h aproximadamente 24. Como tal, luciferase é empregado como um repórter circadiano em uma ampla gama de organismos, incluindo plantas, fungos, moscas e mamíferos1,2,3,4.
Quando quantifying genética circadian expressão em vitro, um tubo fotomultiplicador (PMT) é comumente usado para gravar o sinal bioluminescente. Medições baseadas em PGTO tem flexibilidade limitada no entanto, geralmente sendo restrito para um tamanho de placa ou prato pré-determinado. Também não é possível recolher qualquer informação espacial das amostras monitoradas usando um PGTO, que pode levar a uma perda de informação quando imagens de amostras que mostram a variação espacial na expressão de luciferase. Além disso, como o pgto e electrónicos associados são propensos a mau funcionamento quando expostos ao ambiente de uma incubadora de cultura de célula padrão umidificado, gravação longitudinal do luciferase usando PMTs é sempre executada em incubadoras não-umedecido. Em consequência, pratos de cultura de células devem ser selados estanque para evitar a perda de umidade por evaporação e os meios de cultura, portanto, deve ser tamponado com 3 – ácido (N– Morpholinos) (MOPS) ou 4-(2-hidroxietil) -1- ácido piperazineethanesulfonic (HEPES), ao invés do CO2/bicarbonate buffer sistema que funciona na vivo e é usado rotineiramente em cultura de tecidos de mamíferos.
Como resultado dessas limitações, medição de bioluminescência por PMTs geralmente lugares fortes restrições sobre as condições sob as quais as células são mantidas durante as experiências. Para superar esses problemas e também para aumentar o leque de possíveis condições experimentais, usamos uma padrão CO2/N2 170L tecido cultura incubadora que foi adaptada pela adição de uma água-refrigerados elétron-multiplicando dispositivo de carga acoplada (EMCCD) câmera com antinévoa óptica e controle digital de níveis de temperatura e gasolina. Isto tem sido apelidado um automatizado Longitudinal Luciferase Imaging gás e Temperature-Optimized gravador ou jacaré. O jacaré permite flexibilidade um aumento substancial de imaging bioluminescentes, ambos para a imagem latente da elevado-produção de placas de cultura de tecido padrão (até 6 x 96 ou 384-poços chapas simultaneamente) e também para os sistemas de cultura de tecidos não-padrão, tais como perfundidas células cultivadas em dispositivos microfluídicos. Este instrumento permite também a imagem para ocorrer sob condições umidificadas e com controle variável de CO2 e O2 parcial pressão tanto da temperatura.
O protocolo abaixo descreve um método para a gravação bioluminescente de células de mamíferos e sistemas de cultura de tecidos utilizando um jacaré (doravante referido como ‘incubadora de bioluminescência’). Convém, no entanto, que o sistema seria bem adequado para imagens bioluminescentes e também, com algumas modificações, fluorescente de imagem, em um número de outros contextos e sistemas biológicos.
O protocolo descrito aqui é para cultura de células de mamíferos, tanto em condições estáticas e perfundidas. No entanto, o jacaré pode ser facilmente adaptado para outros sistemas de modelo. Com efeito, já mostrou para fornecer uma excelente plataforma para monitoramento simultâneo de locomoção, sono e ritmos de expressão do gene periférica em Drosophila melanogaster , mantida sob constante escuridão15. É também de notar que, dependendo da aplicação, tipos de câmera diferentes que mencionados aqui podem ser adequados. Prevemos que com os filtros adequados, uma versão modificada da instalação do atual poderia em princípio ser usada para quantificação de fluorescência.
Os aplicativos só por que o jacaré não pode ser apropriado são aqueles para os quais particularmente alta resolução espacial é necessária, como a imagiologia de organização spatiotemporal de expressão PER2::LUC em fatias organotypic dos mamíferos núcleo supraquiasmático, ou outras fatias pequenas de tecido.
O jacaré permite muitas experiências a serem executadas que até então não foram facilmente alcançáveis por técnicas convencionais de gravação. Comparado com os métodos atuais para a medição de bioluminescência, o jacaré fornece maior flexibilidade em ambos o tipo de prato de cultura celular ou slide que pode ser usado, as condições de mídia externa, sensibilidade e processivity.
Isto é particularmente relevante num momento quando há um movimento longe de modelos de cultura padrão celular 2D para 3D organoides e fluxo sistemas de cultura. Como tal, prevê-se que o jacaré irá fornecer um método adaptável pelo qual bioluminescência pode ser medida ao longo de muitos dias e semanas sob uma ampla gama de condições.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer o Cairn pesquisa por trabalhar para desenvolver este sistema, em especial Mark Henson, Jeremy Graham e Joao Correia. Agradecemos também David Welsh e Adriano Reddy para discussão valioso durante a fase de projeto, bem como Peter Laskey (anteriormente de Hamamatsu) para organizar o empréstimo de uma câmera de demo e David Wong para sua entrada crítica ao manuscrito.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |