1. zaaien en temperatuur Entrainment van cellen Opmerking: Dit protocol is grondig getest met behulp van primaire en vereeuwigd muis fibroblasten uiting geven aan de PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) fusion eiwit4. Aanpassingen mogelijk moet worden voorzien in experimenten met behulp van andere cellijnen. Voorafgaand aan het begin van celkweek, plaats het volgende in een waterbad 37 ° C te warm: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4), PBS aangevuld met 0.68 mM ethyleendiamminetetra zuur, pH 7,2 (PBS + EDTA), gewenste cel cultuurmedia, b.v. Dulbecco van bewerkt Eagle’s Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine, 0,25% trypsine oplossing. Verdun trypsine 1:3 met voorverwarmde PBS + EDTA-oplossing en terug te keren naar het waterbad. Neem een 125 cm2 kolf luciferase-uiten cellen die 70-90 zijn % confluent. De media gecombineerd. Voeg toe 10 mL voorverwarmde PBS. De PBS gecombineerd. 2,5 mL voorverwarmde trypsine-EDTA toevoegen en de erlenmeyer terugkeren naar een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder de cellen uit de incubator en weergave onder een microscoop. Zodra de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt van de bodem van de kolf, verder met de volgende stap. Als de meeste cellen gekoppeld aan de onderkant van de kolf blijven, terug naar de incubator totdat de meeste cellen in suspensie zijn. Een verdere 7,5 mL van de standaard cel kweekmedium Voeg aan de maatkolf. U kunt desgewenst verwijderen 1 mL van deze voor verdere passage van de cellen, zoals vereist. Tellen de dichtheid van de resterende cellen met behulp van een hemocytometer en de trypan blauwe. Verdun de cellen verder, voorzover van toepassing voor die cellijn.Opmerking: Voor de experimenten hieronder, werden PERIOD2::LUC fibroblasten overgeënt tussen 6 x 103 cellen/cm2 en 1 x 104 cellen/cm2 in 96-wells-platen, 35 mm gerechten of kanaal dia’s. Zaad-cellen op de weefselkweek gerechten of platen die zal worden gebruikt voor de opname.Opmerking: Gebruik van zwarte dubbelzijdig, duidelijk bodem platen wordt aanbevolen aangezien hierdoor cultuur gezondheid worden beoordeeld voordat de opnamen beginnen terwijl vermindering van de interferentie tussen putten tijdens het opnemen. Waar bioluminescentie niveaus zeer laag zijn, moet witte gerechten/platen worden gebruikt voor het maximaliseren van de detectie van het licht, hoewel alstublieft rekening mee dat fosforescentie tot leiden kan verhoogd achtergrond signaal dat enkele uren of langer aanhoudt. De platen terug te keren naar de incubator en laat monolayers te bereiken 100% samenvloeiing (ongeveer 7 dagen).Opmerking: Zodra confluente, cellijnen die een remmende werking contact kunnen worden gehandhaafd voor maximaal drie weken voorafgaand aan experimenten op voorwaarde dat de media wordt regelmatig vernieuwd (elke 5-7 dagen). Zodra confluente, synchroniseren cellulaire ritmes met behulp van de toegepaste temperatuur cycli (12 h bij 32 ° C, 12 h bij 37 ° C) gedurende ten minste 72 uur vóór experimenten5,6 (met behulp van een voorgeprogrammeerde fietsen incubator, bestuurd door een computer verbonden met de incubator via een seriële poort voor RS-232).Opmerking: Het aantal cycli van temperatuur vereist voor de synchronisatie van cellulaire ritmes kan variëren tussen cellen lijnen en wellicht daarom worden geoptimaliseerd voor andere cellijnen. Acute farmacologische stimulatie via forskolin of dexamethason heeft ook eerder is gebruikt voor het synchroniseren van cellulaire ritmes7,8. 2. NS21 voorbereiding Opmerking: NS21 is een serumvrij supplement voor het onderhoud van neuronale en andere celculturen. Het is een verfijning van vergelijkbare bijvoederen B27, die commercieel beschikbaar is en kan worden gebruikt als een vervanging van het serum tijdens circadiane bioluminescentie opnames9genoemd. Beide supplement kan onderling verwisselbaar worden gebruikt in de opnamemedia voor de experimentele protocollen die hieronder worden beschreven. Het is heel haalbaar en kosteneffectief te maken NS21 in-house, zoals Chen et al. in 10, en zoals hier is beschreven. Equilibreer alle onderdelen beschreven in tabel 1 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur voor aanvang. Los 50 g boviene albumine in 324 mL Basaal medium (bijvoorbeeld, neurobasal) op het ijs. Roer het mengsel zo weinig mogelijk. Alle andere onderdelen, roeren minimaal na elk onderdeel, maar nog steeds zorgen homogenisatie van het mengsel toe te voegen. Doel te ontbinden van alle componenten binnen 90 min te starten. Aliquot het uiteindelijke mengsel en opslag bij-20 ° C totdat vereist. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen-ontdooien cycli.Opmerking: Het mengsel is al te visceus filteren in dit stadium, maar zal worden steriele gefilterd wanneer verdund met media voordat u deze toevoegt aan de cellen. 3. opname Media voorbereiding Opmerking: Een primaire voordeel van de Bioluminescentie incubator ten opzichte van andere apparatuur voor het opnemen van de longitudinale bioluminescentie is dat, op grond van kunnend humidify de incubator en variëren van de partiële druk van O2 en CO2, het kunt u gebruik maken van een bredere waaier van media voorwaarden voor opname bioluminescentie — met inbegrip van voorwaarden die meer nauw bij benadering de fysiologische niche bezet door andere cel typt in vivo. Hieronder beschrijven wij de formulering van de opnamemedia van Hastings et al. aangepast 9, die we regelmatig met gekweekte fibroblasten en andere celtypes gebruikt hebben. De eerste is voor verzegelde kweekomstandigheden (zonder gasuitwisseling), en de tweede is fysiologisch relevante voorwaarden en bevochtigde omstandigheden met 5% CO2moet worden gebruikt.Veel andere varianten zijn zowel mogelijk en wenselijk is, afhankelijk van de exacte toepassing en celtype. Hoge glucose MOPS-gebufferd media voorbereidingOpmerking: Stockoplossing (1 L): DMEM poeder (8.3 g/L), 0.35 mg/mL natriumbicarbonaat,, 5 mg/mL glucose, 0,02 M WIPES, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine. Los 8.3 g DMEM poeder in 900 mL ultrazuiver water in een maatcylinder van 1000 mL en roer gedurende 30 minuten totdat alle deeltjes zijn opgelost. Voeg 50 mL glucose-oplossing (100 g/L), 20 mL MOPS (1 M, pH 7,6) 10 mL voor 100 x pen/strep oplossing, en roer gedurende een verdere 10 min. Voeg 4,7 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en roer voor een verdere 5 min. Breng de pH van de media op 7.6 (als het bij kamertemperatuur) of 7.4 (37 ° C) met HCl/NaOH. Ultrazuiver water tot een eindvolume van 1000 mL toevoegen. Steriliseren door filtratie door een 0,22 µm filter en bewaren bij 4 ° C totdat vereist. Voorafgaand aan experimenten, een aanvulling op een juiste volume van de stockoplossing met 10% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 2% NS21 en 1 mM luciferine om een werkende voorraad. Deze voorraad passeren door een 0,22 µm steriele filter. De osmolaliteit van de maatregel van de media met behulp van een osmometer. Inschakelen van de osmometer. Kalibreren van het osmometer, eerst met ultrazuiver water. Voeg 50 µL water naar de bodem van een meetinstrument vaartuig. Zorg ervoor er geen luchtbellen in de vloeistof. Clip van het schip over de sonde. Druk op ‘Nul’ en zorgvuldig lager de osmometer arm naar het laagste punt. Wacht tot lezing voltooid is en groene ‘resultaat’ licht brandt voordat het verhogen van de arm en het verwijderen van het vaartuig. Herhaal deze stappen om te kalibreren van het osmometer tot 300 mOsmol/kg met 50 µL ijkstandaard. Druk op ‘Cal’ vóór het verlagen van de arm. Meet de osmolaliteit van het monster door 50 µL van media toe te voegen aan de onderkant van een meetinstrument vaartuig en maatregel zoals hierboven. Druk op ‘samplen’ vóór het verlagen van de osmometer-arm. Pas de osmolaliteit aan 350 mOsmol met 5 M NaCl. HCO3-gebufferd lage glucose media (perfusie medium) voorbereidingOpmerking: Stockoplossing (1 L): DMEM poeder (8.3 g/L), 3.7 mg/mL natriumbicarbonaat, 1 mg/mL glucose, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine. Los 8.3 g DMEM poeder in 900 mL ultrazuiver water in een maatcylinder van 1000 mL en roer gedurende 30 minuten totdat alle deeltjes zijn opgelost. Voeg 50 mL glucose oplossing (100 g/L), 10 mL 100 x pen/strep oplossing en roer gedurende een verdere 10 min. Voeg 49.4 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en roer voor een verdere 5 min. Breng de pH van de media op 7.6 (op kamertemperatuur) of 7.4 (37 ° C) met HCl/NaOH. Voeg ultrazuiver water geven een eindvolume van 1000 mL. Laat de oplossing door een 0,22 µm steriele filter en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Voorafgaand aan experimenten, een aanvulling op een juiste volume van de stockoplossing met 2% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 2% NS21 en 1 mM luciferine om een werkende voorraad. Deze voorraad passeren door een 0,22 µm steriele filter. Meten en aanpassen van de osmolaliteit aan 350 mOsmol met 5 M NaCl, wat betreft de MOPS-gebufferd media. Opmerking: Luciferine concentratie moet empirisch bepaald worden voor elk celtype en context. Voor meer informatie zie Feeney et al. 11 serum en NS21 (of B27 als gebruikt) concentraties kunnen gevarieerd worden afhankelijk van de toepassing. Echter raden wij dat, tenzij empirisch getest om aan te geven anders, serum en NS21 (of alternatieve serumvrij supplement) worden gebruikt, zoals deze bevordering van overleving van de cel en bijlage. In cellijnen die Contacteer niet remmen goed, kan het nodig zijn om te lager de serumconcentratie in de opnamemedia ter voorkoming van storende effecten van de proliferatie, die ook wordt bevorderd door serum. 4. opname Voorafgaand aan het begin van de opname, plaats u de passende werken media voorraad (uit stap 3.1 of 3.2 afhankelijk van het experiment) in een waterbad 37 ° C te warm. Terwijl de media is opwarming van de aarde, richten de camera in de Bioluminescentie incubator. Schroef het water-ondoordringbaar, verwarmde neutrale-opaciteitsfilter en zet opzij. De software voor het registreren van een video met een hoge acquisitie-tarief instellen Klik op “acquisitie | Overname Setup”. ‘Belichtingstijd’ instelt op 0,2 s en kinetische cyclustijd naar 0,3 seconden. Zorg ervoor dat EM winst is uitgeschakeld. Sluit het venster ‘Overname-instellingen’ en klik op het pictogram “take video”. Met behulp van de focus cilinder, draai de cameralens totdat items op de plank op de hoogte worden geregistreerd duidelijk in beeld in de video zijn. De video stoppen door te klikken op het pictogram ‘stop video’. Schroef de verwarmde neutrale-opaciteitsfilter terug op zijn plaats; niet te doen zal resulteren in schade aan de EM-CCD-camera en/of vernevelen van de doelstelling als gevolg van condensatie. O2, CO2en temperatuur instellen door de gewenste experimentele omstandigheden via het bedieningspaneel aan de voorzijde van de Bioluminescentie incubator.Opmerking: Als het uitvoeren van perfused celkweek gaan rechtstreeks naar de sectie 5 in dit stadium. De cellen uit de weefselkweek incubator en aspirate uit de media verwijderen. Vervang de media met voorverwarmde werken voorraad. Als de Bioluminescentie incubator is niet te worden bevochtigde tijdens het experiment, dan zegel de gerechten en de platen met een gas-ondoordringbare zegel.Als de Bioluminescentie incubator wil worden bevochtigde, is het niet strikt noodzakelijk is om het zegel van de gerechten, hoewel het de voorkeur verdient voor het afdichten van gerechten met een klein volume, zoals 96-wells-platen, met behulp van een gas-permeabele zegel, als een kleine hoeveelheid verdamping kan anders nog steeds optreden zelfs in bevochtigde incubators.Opmerking: Bevochtiging wordt bereikt door het invullen van het Dienblad van het water aan de voet van de incubator. De cellen aan de Bioluminescentie incubator, sluit de deur van de incubator en veilige incubator in plaats aan formulier een licht-goede afdichting dekken overdragen. Selecteer de opnameparameters geschikt is voor de toepassing. Klik op “acquisitie | Overname Setup”. Stel in het deelvenster ‘Camera Setup’: ‘Acquisitie-modus’ naar ‘Kinetische’; ‘Belichtingstijd’ te wensen over blootstellingstijd, in seconden (zie hieronder nota); ‘Accumulations’ naar 1; ‘Kinetic serie lengte’ aantal overname cycli gewenst; ‘Kinetische cyclustijd’ naar het gewenste interval op imaging (ervoor zorgen dat dit meer is dan de blootstellingstijd); ‘Snelheid ‘naar verschuiven 4.33 µsecs; ‘Krijgen’ tot 1; en ‘EM krijgen ‘ naar het gewenste niveau (zie hieronder nota) In het deelvenster ‘Autosave’ ingesteld u het bestandstype op sif of .tif. Een bestandsnaam opgeven en passende locatie op te slaan. Stel in het deelvenster ‘Spooling’ het bestandstype voor tiff. Een bestandsnaam opgeven en passende locatie op te slaan. Sluit het venster overname-instellingen. Beginnen met opnemen door te klikken op de knop ‘Neem signaal’.Opmerking: Als de Bioluminescentie incubator kan worden gebruikt voor een groot aantal verschillende cel en weefselsoorten, die allemaal verschillende niveaus van bioluminescentie hebben zullen, de blootstellingstijd die nodig is voor het verzamelen van een passend bioluminescente lichtsignaal zal variëren tussen experimenten. Het is ook mogelijk om te variëren van de elektron-vermenigvuldigen (EM) winst van imaging teneinde de omvang van het signaal verzameld. Voor nieuwe toepassingen van onbekende helderheid raden we eerst een enkele afbeelding met een relatief korte belichtingstijd (ongeveer 10 min) zonder EM winst nemen en vervolgens aan te passen zowel belichtingstijd en EM krijgen totdat de gewenste opname-voorwaarden bereikt. In de meeste gevallen is een gemiddelde signaal van 10-20% van de maximale mogelijke pixel intensiteit voor de camera een goed niveau te streven naar. Zodra een passende set van opnameparameters heeft bereikt, beginnen longitudinale verwerving van beelden, zoals hierboven beschreven. 5. geperfundeerd weefselkweek (optioneel) Opmerking: Zoals beschreven in de inleiding, de Bioluminescentie incubator is geschikt voor beeldvorming van genormaliseerde weefselkweek systemen. Dit wordt geïllustreerd in de ontwikkeling van een systeem voor geperfundeerd celkweek. Zaad de cellen op één kanaal dia’s met Luer connectoren met een diepte van het kanaal van 0,6 of 0,8 mm, in DMEM met 10% FBS en pen/strep, zoals beschreven in sectie 1. Maken de perfusie-media zoals beschreven in stap 3.2. Voorafgaand aan de opname, het bereiden van buizen voor de vereiste perfusie-systeem met behulp van 1 mm binnendiameter (I.D.) ETFE buis en 1 mm I.D. silicone slangen, elleboog, mannelijke en vrouwelijke Luer hulpstukken daarvoor, zoals weergegeven in figuur 2A.Opmerking: De meerderheid van de lengte van de slang is ETFE buis, met 2 cm secties van Siliconen slang gebruikt de ETFE-buizen verbinden met de Luer-armaturen, die vervolgens in de kanaal-dia’s koppelen. Het steriliseren van de buis door te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door steriel PBS. Verwijder de celculturen in kanaal dia’s uit de incubator. De media gecombineerd en vervangen met voorverwarmde perfusie media. Vul een 20 mL spuit met de voorverwarmde perfusie-media. Sluit de slang aan de buffer schuif (Zie Figuur 2) maar niet naar de cel-bevattende dia, en spoel de buizen en dia met perfusie media (3-5 mL). Sluit de cel-bevattende dia en spoelen van het hele systeem met nogmaals 1 mL van media om eventuele luchtbellen te verwijderen. Het hele systeem naar de Bioluminescentie incubator overbrengen. Fit de media gevulde injectiespuiten aan de injectiespuit pompen zonder loskoppelen van de slang en spoel nogmaals 1 mL media via het hele systeem met behulp van de pomp om ervoor te zorgen er zijn geen luchtbellen in het systeem. De diameter wordt aangezet door de pomp aan die van de spuit wordt gebruikt.Opmerking: Voor de 20 mL spuiten hier gebruikt, de diameter is 19.13 mm. Het debiet van de pomp ingesteld op 50 µL/h en beginnen draaien. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in alle dia’s of de buis vóór het begin van de opname, zoals dit invloed op luciferase expressie hebben zal als ze in de cel enkelgelaagde passeren. Indien nodig, spoel verder media over de cellen om dit te bereiken. Sluit de Bioluminescentie incubator deur en blijven zoals in stap 4.7 om te beginnen met opnemen. 6. behandeling tijdens het opnemen Opmerking: Soms is het wenselijk voor de behandeling van de cellen een opname, halverwege het worden met farmacologische en hormonale agenten. In dergelijke gevallen is het noodzakelijk dat de cellen worden behandeld met zorg om te voorkomen dat de cellulaire trilling van het resetten tijdens de behandeling. Om deze reden is het van bijzonder belang dat de cellen worden gehandhaafd op een constante temperatuur, zoals dit een grote entraining cue voor cellulaire circadiane ritmen5,6 is. Alle onderdelen van de behandeling voor het stoppen van de opname voor te bereiden. Bereiden van een chemische isothermische pad bij 37 ° C. Stop de opname apparaat, verwijdert u de gerechten om te worden behandeld en plaats op de isothermische warmte pad. Trakteer de culturen als vereist en terug te keren op de Bioluminescentie incubator op dezelfde locatie als vóór. Opnieuw beginnen met opnemen. 7. analyse Opmerking: De Bioluminescentie incubator produceert gegevens in de vorm van een reeks van individuele beelden.We gebruiken voornamelijk Fiji12 voor het beheer van deze beelden en Exporteer gemiddelde intensiteit pixelgegevens voor elke regio-of-interest (ROI) voor verdere analyse. Open de afbeeldingsstapel in Fiji en de helderheid en het contrast aanpassen door te klikken op “afbeelding | Aanpassen | Helderheid/Contrast”en de glijdende balken aan te passen totdat beelden binnen een geschikt bereik zijn voor het bekijken van de bioluminescente signaal. Selecteer gebieden van belang gebruikend de manager van de ROI beschikbaar onder “Analyze | Tools | ROI-Manager”. De gemiddelde signaal uitvoer voor het geselecteerde gebied door te klikken op “ROI manager | Meer | Multimeasure”. De resulterende gegevens kopiëren naar analysesoftware. Handmatig aanpassen de basis van de tijd van gegevens aan het tijdsinterval van beeldvorming, (dat wil zeggen, 15, 30 of 60 minuten intervallen, beschreven als 0,25, 0,5 of 1 h) in plaats van de beeldnummer geboden door Fiji.Opmerking: Nadere analyse kan nu worden uitgevoerd, zoals bepaling van de periode. Hiervoor wordt de volgende vergelijking gebruikt voor het uitvoeren van niet-lineaire regressie-analyse: waar y is het signaal, x de bijbehorende tijd, m is het verloop van de trendlijn c is het y-snijpunt van de trendlijn, Amplitude is de hoogte van de piek van de golfvorm boven de trendlijn, k is de verval-constante of percentage demping (zodanig dat 1 /k is de halfwaardetijd), fase is de verschuiving in de x van de cosinus Golf en de periode is de tijd die nodig is voor een volledige cyclus13optreden. R2 -waarde wordt gebruikt als een indicator van goedheid-van-fit. Andere analysemethoden zijn ook mogelijk. De eerste 24 h van de overname moet worden uitgesloten van de analyses, cellulaire bioluminesence kan tijdelijk, niet-circadiane veranderingen vertonen gedurende deze tijd. Dit is het resultaat van een acute reactie op media wijzigen.