لوسيفراس المشفرة وراثيا مراسل غير الغازية شعبية للتعبير الجيني. استخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح) يتيح تسجيل طولية من الخلايا طرحه تحت طائفة واسعة من الظروف. هنا نعرض كيف يمكن استخدام التمساح في سياق البحوث إيقاعات سيركاديان.
على أساس لوسيفراس الصحفيين للتعبير الجيني الخلوية في الاستخدام الواسع النطاق لكلا طولية وفحوصات نقطة النهاية للنشاط البيولوجي. في إيقاعات circadian للبحث، على سبيل المثال، اندماج الجينات على مدار الساعة مع لوسيفراس اليراع تثير إيقاعات قوية في الإضاءة الحيوية الخلوية التي تستمر على مدى عدة أيام. القيود التقنية المرتبطة بأنابيب ضوئي (PMT) أو الأساليب التقليدية المستندة إلى الفحص المجهري لتحديد مقدار الإضاءة الحيوية عادة طالبوا بالإبقاء على الخلايا والأنسجة تحت ظروف غير الفسيولوجية تماما خلال تسجيل، مع الموازنة بين الحساسية والإنتاجية. هنا، نحن تقرير صقل أساليب مسبق يسمح التصوير بالإضاءة الحيوية طويلة الأمد مع حساسية عالية والإنتاجية التي تدعم طائفة واسعة من الظروف الثقافة، بما في ذلك الغاز متغير ومراقبة الرطوبة، وأن يقبل كثير مختلفة لوحات زراعة الأنسجة والاطباق. لوسيفراس طولية الآلي هذا التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح) كما يسمح بملاحظة التغيرات المكانية في التعبير لوسيفراس عبر الخلية أحادي الطبقة أو الأنسجة، والتي لا يسهل أن يراعيها التقليدية أساليب. نسلط الضوء على كيفية التمساح يوفر إلى حد كبير زيادة المرونة للكشف عن النشاط لوسيفراس بالمقارنة مع الأساليب القائمة.
وقد أصبح استخدام لوسيفيراسيس كالصحفيين للتعبير الجيني ونشاط البروتين تقنية شعبية في بحوث البيولوجيا الجزيئية والخلوية. وهذا صحيح في ميدان الإيقاعية، وبشكل خاص يناسب للإبلاغ عن التغيرات الطولية في التعبير الجيني التي تحدث على مدى دورة الإيقاعية ح حوالي 24 فيها حركية اليراع لوسيفراس التوليف والمنظمة الحفاز. على هذا النحو، لوسيفراس يعمل كمراسل الإيقاعية عبر طائفة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الفطريات والنباتات، والذباب، والثدييات1،2،،من34.
عند التحديد الكمي للجينات الإيقاعية التعبير في المختبر، أنبوب ضوئي (PMT) يستخدم عادة لتسجيل إشارة طرحه. القياسات PMT محدودة المرونة ولكن عادة ما تقتصر على حجم لوحة أو صحن سلفا. ليس من الممكن أيضا جمع المعلومات المكانية أي من عينات مراقبة استخدام PMT، الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان المعلومات عند تصوير العينات التي تظهر التباين المكاني في التعبير لوسيفراس. PMT والإلكترونيات المرتبطة بها هي المعرضة لعطل عند التعرض لبيئة حاضنة الثقافة خلية قياسية هوميديفيد، وعلاوة على ذلك، يتم دائماً تنفيذ تسجيل لوسيفراس طولية باستخدام بمتس في حاضنات غير هوميديفيد. ونتيجة لذلك، يجب أن تكون مختومة خلية ثقافة الأطباق الغلق لمنع فقدان الرطوبة من خلال التبخر ووسائط الثقافة يجب ولذلك يجب تخزينها مؤقتاً مع 3-حمض بروبانيسولفونيك (N-morpholino) (والمماسح) أو (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس)، بدلاً من/bicarbonate2شركة التخزين المؤقت للنظام الذي يعمل في فيفو ، وتستخدم بشكل روتيني في زراعة أنسجة الثدييات.
ونتيجة لهذه القيود، أماكن قياس الإضاءة الحيوية التي بمتس عادة فرض قيود مشددة على الشروط التي يتم الاحتفاظ الخلايا أثناء التجارب. للتغلب على هذه المشاكل، وأيضا لزيادة نطاق الظروف التجريبية الممكنة، نحن نستخدم معيار CO2/N2 ل 170 زراعة الأنسجة حاضنة التي تكيفت بإضافة المياه المبردة إلكترون-ضرب كاميرا جهاز اقتران (امككد) مع بصريات المضادة الضباب والتحكم الرقمي لمستويات درجة الحرارة والغاز. هذا وقد أطلق عليها الآلي الغاز التصوير لوسيفراس طولية ومسجل تيمبيراتوريوبتيميزيد، أو التمساح. التمساح يسمح بالمرونة إلى حد كبير زيادة التصوير طرحه، سواء بالنسبة للتصوير الفائق من لوحات قياسية زراعة الأنسجة (ألواح ما يصل إلى 6 س 96-أو 384-جيدا في نفس الوقت) وأيضا لأنظمة زراعة الأنسجة غير قياسي، مثل ك perfused خلايا تزرع في أجهزة موائع جزيئية. كما يسمح هذا الصك للتصوير تحدث تحت ظروف هوميديفيد ومع التحكم المتغير CO2 والضغط الجزئي2 س فضلا عن درجة الحرارة.
البروتوكول أدناه وصف أسلوب لتسجيل طرحه لخلايا الثدييات ونظم زراعة الأنسجة باستخدام التمساح (يشار إليها من الآن فصاعدا ‘حاضنة الإضاءة الحيوية’). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النظام سيكون مناسبة تماما للتصوير بطرحه، وأيضا، مع بعض التعديل، فلوري التصوير، في عدد من النظم البيولوجية وسياقات أخرى.
بروتوكول الموصوفة هنا للثقافة خلية الثدييات، وكلاهما تحت ظروف perfused وثابتة. ومع ذلك، يمكن بسهولة أن التمساح تكييف الأنظمة النموذجية الأخرى. والواقع أن الفعل قد ثبت أن توفر منبرا ممتازا للرصد المتزامن للحركة والنوم وايقاعات تعبير الجينات المحيطية في melanogaster المورفولوجية الإبقاء تحت الظلام المستمر15. من الملاحظ أيضا أن، اعتماداً على التطبيق، أنواع الكاميرا غير تلك المذكورة هنا قد تكون مناسبة. أننا نتصور أن مع عوامل التصفية المناسبة، نسخة معدلة من الإعداد الحالي في رأس مال يمكن للتقدير الكمي الأسفار.
فقط التطبيقات التي التمساح قد لا يكون مناسباً هي تلك التي لا سيما عالية الدقة المكانية المطلوبة، مثل تصوير المنظمة الزمانية المكانية للتعبير PER2::LUC شرائح أورجانوتيبيك من الثدييات نواة suprachiasmatic، أو شرائح النسيج الصغيرة الأخرى.
التمساح تمكن العديد من التجارب التي يمكن القيام بها حتى الآن لم تكن سهولة يمكن تحقيقه بأساليب تسجيل التقليدية. بالمقارنة مع الأساليب الحالية لقياس الإضاءة الحيوية، التمساح يوفر المزيد من المرونة في كل نوع من خلية ثقافة طبق أو الشريحة التي يمكن استخدامها، وظروف وسائل الإعلام الخارجية، وحساسية، و [بروسسيفيتي].
ولهذا أهمية خاصة في وقت عندما يكون هناك الابتعاد عن نماذج ثقافة الخلية 2D القياسية نحو نظم الثقافة أورجانويد وتدفق 3D. على هذا النحو، فمن المتوقع أن التمساح سوف يوفر طريقة التكيف التي يمكن قياس الإضاءة الحيوية على مدى عدة أيام وأسابيع تحت طائفة واسعة من الظروف.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر “البحث العلامة” للعمل معنا لتطوير هذا النظام، وبخاصة مارك هانسون، جيريمي غراهام وكورييا جواو. ونشكر أيضا ديفيد ويلش وريدي فيجو لمناقشة قيمة أثناء مرحلة التصميم، فضلا عن بيتر لاسكيي (سابقا من هاماماتسو) لترتيب القرض لعرض الكاميرا وديفيد وونغ له مدخلاً حاسما للمخطوطة.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |