Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.
Luciferase tabanlı gazetecilere hücresel gen ifadesinin boyuna her ikisi için yaygın kullanılmayan ve biyolojik aktivitesini son nokta deneyleri. Sirkadiyen ritim araştırmada, örneğin, saat gen füzyon ile ateş böceği luciferase neden için sağlam ritimler birçok gün içinde kalıcı hücresel bioluminescence içinde olmaktadır. Teknik sınırlamalar photomultiplier tüp (PMT) ile ilişkili veya geleneksel mikroskobu tabanlı yöntemler bioluminescence miktar için genellikle hücre ve dokuların sırasında oldukça fizyolojik koşullarda muhafaza edilmesi talep var. kayıt, duyarlılık ve işlem hacmi arasında bir denge ile. Burada, uzun vadeli bioluminescence görüntüleme yüksek hassasiyet ve hangi kültür koşullar, değişken gaz ve nem kontrolü de dahil olmak üzere geniş bir dizi çekmek ve bu birçok kabul eden işlem hacmi ile farklı sağlar bir arıtma önceki yöntemlerden raporu doku kültürü tabak ve yemekler. Bu otomatik boyuna luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) ayrıca Imaging mekansal varyasyon gözlem luciferase ifadede hücre monolayer veya kolayca geleneksel tarafından gözlenen cant doku üzerinden sağlar yöntemleri. Biz nasıl timsah varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında luciferase aktivite tespiti için büyük ölçüde artan esneklik sağlar vurgulayın.
Luciferases gazetecilere gen ekspresyonu ve protein etkinliği olarak kullanımı moleküler ve hücre biyolojisi araştırmalarında popüler bir teknik haline gelmiştir. Bu ateş böceği luciferase sentezi ve katalitik inactivation Kinetik nerede üzerinden yaklaşık 24 s sirkadiyen döngüsü meydana gen ekspresyonu boyuna değişimler raporlama için özellikle uygundur sirkadiyen alanında geçerlidir. Bu nedenle, luciferase Mantarlar, bitkiler, sinekler ve memeliler1,2,3,4da dahil geniş bir aralığında sirkadiyen muhabir olarak istihdam edilmektedir.
Sirkadiyen gen ifade vitromiktarının, bir photomultiplier tüp (PMT) yaygın olarak kollarındaki sinyal kaydetmek için kullanılır. Devresel_ödeme tabanlı ölçümleri esneklik ancak, genellikle önceden belirlenmiş bir tabak ya da çanak boyutu sınırlı sınırlı olabilir. Ayrıca luciferase ifadede mekansal varyasyon gösteren örnekleri Imaging bilgi kaybına yol açabilir bir Devresel ödeme kullanarak izlenen örnekleri kayma herhangi bir bilgi toplamak mümkün değildir. Ayrıca, devresel_ödeme ve ilişkili elektronik oksijen Standart hücre kültür kuluçka ortamına maruz kaldığında arıza eğilimli olduğundan, boyuna luciferase kayıt PMTs kullanarak her zaman sigara nemlendirilmelidir İnkübatörler içinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, hücre kültürü yemekleri gerekir kapalı hava-buharlaşma yoluyla nem kaybını önlemek için sıkı ve kültür medya bu nedenle 3 – ile tamponlanmış olmalıdır (N– morpholino) propanesulfonic asit (paspas) veya 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), in vivo fonksiyonları ve memeli doku kültüründe rutin olarak kullanılan sistem tampon CO2/bicarbonate yerine.
Bu sınırlamalar bir sonucu olarak PMTs tarafından bioluminescence ölçümü genellikle sıkı kısıtlamalar altında hücreler deneyler sırasında korunur koşulları üzerine yerleştirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için ve aynı zamanda olası deneysel koşullar aralığı artırmak için biz bir su soğutulmuş elektron-çarparak eklenmesi tarafından uyarlanmış bir standart CO2/n2 170 L doku kültürü kuluçka makinesi kullanın Anti-sis optik ve dijital kontrol sıcaklık ve gaz düzeyleri ile şarj kuplajlı cihaz (EMCCD) kamera. Bu bir otomatik boyuna Luciferase gaz görüntüleme ve Temperature-Optimized kaydedici ya da timsah dönüşmüş bulunuyor. Kollarındaki görüntüleme, standart doku kültürü plakaların yüksek üretilen iş görüntüleme için her ikisi de önemli ölçüde artan esneklik için timsah sağlar (6 x 96 – veya 384-da kadar tabaklar aynı anda) ve standart dışı doku kültürü sistemleri, için de böyle derin hücreler olarak mikrosıvısal aygıt içinde büyüdü. Bu araç aynı zamanda oksijen koşullar altında ve değişken kontrolünü hem CO2 O2 kısmi basınç ve sıcaklık ile gerçekleşmesi için görüntüleme için sağlar.
İletişim kuralı aşağıdaki memeli hücre ve doku kültürü sistemleri (bundan böyle ‘bioluminescence kuluçka’ adlandırılır) bir timsah kullanarak kollarındaki kayıt için bir yöntemi açıklar. Bu, ancak, sistem kollarındaki görüntüleme ve aynı zamanda, bazı değişiklik, Floresan, diğer biyolojik sistemleri ve bağlamlarda bir dizi Imaging ile uygun olması gerekmektedir.
Burada açıklanan memeli hücre kültürü, derin ve statik koşullarda her ikisi de iletişim kuralıdır. Ancak, timsah kolayca diğer sistemleri modellemek için adapte edilebilir. Gerçekten, o zaten aynı anda hareket, uyku ve sürekli karanlık15altında. tutulan Drosophila melanogaster periferik gen ifade ritimler izlemek için mükemmel bir platform sağlamaktadır gösterilmiştir Ayrıca uygulamaya bağlı olarak, burada açıklanan dışındaki kamera türleri uygun olabileceğini kaydetti. Biz uygun filtreleriyle, geçerli ayarı değiştirilmiş bir sürümü prensipte Floresans miktar için kullanılan olabileceğini öngörmektedir.
Özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme memeli dilim organotypic PER2::LUC ifadede kronolojik zamanmekansal organizasyon gibi gerekli olduğu için timsah uygun olmayabilir uygulamalar yalnızca bunlar suprachiasmatic çekirdeği, ya da diğer küçük dokusu dilimlerin.
Timsah şimdiye kadar geleneksel kayıt teknikleri tarafından kolayca ulaşılabilir olmamıştır gerçekleştirilecek birçok deney sağlar. Bioluminescence ölçümü için geçerli yöntemleri ile karşılaştırıldığında, timsah her iki tip hücre kültür çanak veya kullanılabilir slayt, dış ortam koşulları, duyarlılık ve processivity düzeyde esneklik sağlar.
Bu özellikle ilgili bir anda ne zaman standart 2D hücre kültür modelleri 3D organoid ve akış kültür sistemleri doğru uzak dur. Bu nedenle, timsah bioluminescence hangi birçok gün ve hafta çok çeşitli koşullar altında üzerinde ölçülebilir uyarlanabilir bir yöntem sağlayacaktır tahmin edilmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Cairn araştırma özellikle Mark Henson, Jeremy Graham ve Joao Correia bu sistemi geliştirmek için bizimle çalışmak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de David Welsh ve bayram Reddy Peter Laskey (eski adı, Hamamatsu) yanı sıra tasarım aşaması sırasında değerli tartışma için kritik onun girişi el yazması için bir demo kamera ve David Wong kredi düzenlenmesi için teşekkür ederim.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |