Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.
Axée sur la luciférase reporters de l’expression génique cellulaire sont largement utilisées depuis longitudinales et des analyses de point d’arrêt de l’activité biologique. Dans la recherche de rythmes circadiens, par exemple, fusions de gènes d’horloge avec luciférase firefly donnent lieu aux rythmes robustes bioluminescence cellulaire qui persistent pendant plusieurs jours. Limitations techniques associées aux tubes photomultiplicateurs (PMT) ou des méthodes classiques axées sur la microscopie pour la quantification de la bioluminescence ont généralement exigé que les cellules et les tissus soit maintenu dans des conditions tout à fait non physiologiques au cours de enregistrement, avec un compromis entre sensibilité et le débit. Nous rapportons ici un raffinement des méthodes antérieures qui permet à long terme d’imagerie de bioluminescence haute sensibilité et un débit qui prend en charge un large éventail de conditions de culture, y compris les gaz variable et régulateur d’humidité, et qui accepte plusieurs différents plaques de culture de tissus et de plats. Cette luciférase longitudinale automatisé imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) également permet l’observation des variations spatiales dans l’expression de la luciférase à travers une monocouche de cellules ou de tissus, qui ne peuvent être facilement observés par traditionnel Méthodes. Nous mettons en évidence comment l’ALLIGATOR fournit beaucoup plus de flexibilité pour la détection de l’activité de la luciférase en comparaison avec les méthodes existantes.
L’utilisation de luciférases comme reporters de l’expression génique et l’activité de la protéine est devenue une technique populaire en recherche en biologie moléculaire et cellulaire. Cela est vrai dans le domaine circadien, où la cinétique de la synthèse de luciférase firefly et inactivation catalytique sont particulièrement bien adaptés pour avoir signalé les changements longitudinaux dans l’expression des gènes qui se produisent pendant environ 24 h cycle circadien. Par conséquent, luciférase travaille comme journaliste circadienne dans un large éventail d’organismes, y compris les champignons, les plantes, les mouches et les mammifères1,2,3,4.
Lors de la quantification circadienne gene expression in vitro, un tube photomultiplicateur (PMT) est couramment utilisé pour enregistrer le signal de bioluminescent. Mesures PMT ont peu de flexibilité cependant, habituellement étant limité à une taille prédéterminée d’assiette ou un plat. Il n’est également pas possible de recueillir toute information spatiale des échantillons contrôlés à l’aide d’un PMT, qui peut conduire à une perte d’information lors de l’imagerie des exemples qui montrent la variation spatiale dans l’expression de la luciférase. En outre, comme le PMT et électroniques associés ont tendance à mal fonctionner lorsqu’il est exposé à l’environnement humidifié d’un incubateur de culture cellulaire standard, enregistrement de luciférase longitudinales à l’aide de PMT est toujours effectuée dans des incubateurs non humidifié. En conséquence, les récipients de culture cellulaire doivent être scellés hermétiquement pour empêcher la perte d’humidité par évaporation et les milieux de culture doit donc être mis en mémoire tampon avec 3 – sulfonique (N– morpholino) (MOPS) ou 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES), plutôt que le CO2/bicarbonate mise en mémoire tampon de système qui fonctionne en vivo et est utilisé couramment en culture de tissus chez les mammifères.
En raison de ces limitations, mesure de la bioluminescence par PMTs met généralement des restrictions sévères sur les conditions dans lesquelles les cellules sont maintenues au cours d’expériences. Pour surmonter ces problèmes et aussi pour augmenter la portée des conditions expérimentales possibles, nous utilisons un standard CO2/N2 170 L vitroplants incubateur qui a été adapté par l’ajout d’un eau réfrigérée électron-multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD) appareil photo avec optique anti-buée et contrôle numérique des niveaux de température et de gaz. Il a été surnommé un automatique longitudinale luciférase Imaging gaz et Temperature-Optimized enregistreur ou ALLIGATOR. L’ALLIGATOR permet une flexibilité une augmentation substantielle de bioluminescent imaging, tant pour l’imagerie des plaques de culture de tissus standard haut-débit (jusqu’à 6 x 96 ou 384 puits plaques en même temps) et aussi pour les systèmes de culture de tissus non standard, ces comme les cellules perfusés en Dispositifs microfluidiques. Cet instrument permet également d’imagerie pour se produire dans des conditions humidifiées et avec contrôle variable de CO2 et O2 partielle pression tant que la température.
Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour l’enregistrement bioluminescente de cellules de mammifères et de systèmes de culture de tissus à l’aide d’un ALLIGATOR (ci-après dénommé « incubateur de bioluminescence »). Toutefois, il est à noter que le système serait bien adapté à l’imagerie bioluminescente et aussi, avec quelques modifications, imagerie, dans un certain nombre d’autres systèmes biologiques et des contextes fluorescente.
Le protocole décrit ici est pour la culture de cellules de mammifères, aussi bien dans des conditions statiques et perfusées. Toutefois, l’ALLIGATOR peut être facilement adaptée à d’autres systèmes de modèle. En effet, il a déjà été démontré pour fournir une excellente plate-forme pour une surveillance simultanée de locomotion, de sommeil et rythmes d’expression de gène périphériques chez Drosophila melanogaster , maintenus dans l’obscurité totale15. On notera également que, selon l’application, les types d’appareil photo autre que celui mentionné ici peuvent être appropriés. Nous envisageons qu’avec les filtres appropriés, une version modifiée de la configuration actuelle pourrait en principe être utilisée pour la quantification de la fluorescence.
Seules les applications pour lesquelles l’ALLIGATOR pourrait ne pas convenir sont celles pour lesquelles particulièrement haute résolution spatiale est nécessaire, comme l’imagerie d’organisation spatio-temporelle de l’expression PER2::LUC en tranches organotypique des mammifères noyau suprachiasmatique, ou autres petites tranches.
L’ALLIGATOR permet de nombreuses expériences à réaliser qui jusqu’ici n’ont pas été facile du faire par des techniques d’enregistrement classiques. Par rapport aux méthodes actuelles de mesure de la bioluminescence, l’ALLIGATOR fournit une plus grande souplesse à la fois le type de boîte de Petri de cellule ou diapositive qui peut être utilisé, les conditions du milieu externe, sensibilité et processivité.
Cela est particulièrement vrai à la fois lorsqu’il y a un éloignement des modèles de culture cellulaire 2D standard vers des systèmes de culture organoïde et flux 3D. Par conséquent, il est prévu que l’ALLIGATOR fournira une méthode adaptable par laquelle, bioluminescence peut être mesurée pendant plusieurs jours et des semaines sous un large éventail de conditions.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Cairn recherche pour travailler avec nous pour développer ce système, en particulier Mark Henson, Jeremy Graham et Joao Correia. Nous remercions également David Welsh et Reddy Akhilesh discussion précieuse pendant la phase de conception, ainsi que Peter Laskey (anciennement de Hamamatsu) pour organiser le prêt d’un appareil de démo et David Wong pour son apport critique du manuscrit.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |