基因编码荧光是一种受欢迎的非侵入性的转基因记者。使用自动纵向荧光成像气体和温度优化记录仪 (鳄鱼), 使纵向记录从生物发光细胞在广泛的条件。在这里, 我们展示了如何在生理节律研究的背景下使用鳄鱼。
Luciferase-based 记者的细胞基因表达是广泛使用的纵向和 end-point 的生物活性测定。例如, 在昼夜节律研究中, 与萤火虫荧光的时钟基因融合, 在细胞生物发光中产生了强健的节律, 持续了许多天。与光电倍增管 (PMT) 或常规 microscopy-based 方法相关的技术限制通常要求在相当 non-physiological 的条件下维持细胞和组织记录, 在灵敏度和吞吐量之间进行权衡。在这里, 我们报告了以前的方法, 允许长期生物荧光成像高灵敏度和吞吐量, 支持广泛的文化条件, 包括可变气体和湿度控制, 并接受许多不同组织培养皿和盘子。这种自动纵向荧光成像气体和温度优化记录仪 (鳄鱼) 也允许观察空间变化的荧光表达横跨细胞单层或组织, 这是不能轻易地观察到传统方法.我们强调了鳄鱼是如何提供极大的灵活性, 以检测荧光活动与现有的方法相比。
luciferases 作为基因表达和蛋白质活动的记者, 已成为分子和细胞生物学研究的热门技术。在昼夜节律领域是如此, 萤火虫荧光合成和催化失活的动力学特别适合报告在大约 24 h 昼夜周期内发生的基因表达的纵向变化。因此, 荧光被用来作为一个昼夜记者横跨广泛的有机体, 包括真菌, 植物, 苍蝇和哺乳动物1,2,3,4。
当量化的昼夜节律基因表达在体外, 光电倍增管 (PMT) 通常用于记录生物发光信号。PMT-based 测量的灵活性有限, 但通常被限制在预先确定的盘子或盘子的大小。也不可能从使用 PMT 进行监测的样本中收集任何空间信息, 这可能导致在荧光表达式中显示空间变化的图像样本时丢失信息。此外, 由于 PMT 和相关电子产品在标准细胞培养孵化器的湿化环境中容易发生故障, 因此使用并联的纵向荧光记录总是在 non-humidified 恒温箱中进行。因此, 细胞培养皿必须密封密闭, 以防止蒸发水分流失, 因此培养基必须缓冲 3-(N-吗) 磺酸 (拖把) 或 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 而不是 CO2/碳酸氢盐缓冲系统, 功能的在体内和日常使用的哺乳动物组织培养。
由于这些限制, 并联的生物荧光测量通常会对实验期间维持细胞的条件施加严格的限制。为了克服这些问题, 也为了增加可能的实验条件的范围, 我们使用了一个标准 CO2/N 个2 170 L 组织培养孵化器, 它已经适应了添加一个 water-chilled 电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 相机与 anti-mist 光学和数字控制的温度和气体水平。这被称为自动纵向荧光成像气体和温度优化录音机, 或鳄鱼。鳄鱼允许极大地增加生物荧光成像的灵活性, 既用于标准组织培养皿的高通量成像 (同时可达 6 x 96-或 384-井板), 也可用于非标准的组织培养系统, 如作为微流控装置中的灌注细胞。该仪器还允许在湿化条件下进行成像, 并可对 CO2和 O2分压以及温度进行可变控制。
下面的协议描述了一种使用鳄鱼 (从今以后称为 “生物发光孵化器”) 的哺乳动物细胞和组织培养系统的生物发光记录方法。然而, 应该指出的是, 该系统将非常适合生物荧光成像, 并在一些修改, 荧光成像, 在一些其他的生物学系统和环境。
这里所描述的协议是哺乳动物细胞培养, 无论是在灌注和静态条件。然而, 鳄鱼可以很容易地适应其他模型系统。事实上, 它已经被证明是提供一个优秀的平台, 同时监测运动, 睡眠, 和周边基因表达节律在果蝇在恒定的黑暗中保持15.另据指出, 根据申请的不同, 此处提到的相机类型可能是合适的。我们设想, 使用适当的过滤器, 现有设置的修改版本可以在主体中用于荧光定量。
唯一的应用, 鳄鱼可能不适当的是那些特别高的空间分辨率需要, 如成像的时空组织的 PER2::LUC 表达在器官切片的哺乳动物交叉核, 或其他小组织切片。
鳄鱼使许多实验被执行, 到目前为止不容易地是可实现的由常规录音技术。与目前的生物发光测量方法相比, 鳄鱼在细胞培养皿或滑动片中提供了更大的灵活性, 外部介质条件、灵敏度和 processivity。
这是特别相关的时候, 当有一个远离标准的2D 细胞培养模式, 以3D 化和流培养系统。因此, 预计鳄鱼将提供一种可适应的方法, 在广泛的条件下, 生物荧光可以在许多天和数周内测量。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢凯恩的研究工作, 与我们一起开发这个系统, 特别是马克-汉森, 格雷厄姆和 Correia。我们还感谢大卫威尔士和 Akhilesh 在设计阶段有价值的讨论, 以及彼得 Laskey (以前的滨) 安排贷款的演示相机和大卫王为他的关键投入的手稿。
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |