आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग luciferase जीन अभिव्यक्ति की एक लोकप्रिय गैर इनवेसिव रिपोर्टर है । एक स्वचालित अनुदैर्ध्य luciferase इमेजिंग गैस का उपयोग करें-और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर (मगरमच्छ) शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत bioluminescent कोशिकाओं से अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है । यहां हम बताते है कि कैसे मगरमच्छ circadian लय अनुसंधान के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Luciferase-सेलुलर जीन अभिव्यक्ति के पत्रकारों आधारित दोनों अनुदैर्ध्य और अंत में जैविक गतिविधियों की बात परख के लिए व्यापक उपयोग में हैं । circadian लय अनुसंधान में, उदाहरण के लिए, जुगनू luciferase के साथ घड़ी जीन संलयन सेलुलर bioluminescence में मजबूत लय को जंम दे कि कई दिनों से अधिक रहती है । photomultiplier ट्यूबों (पीएमटी) या bioluminescence ठहराव के लिए पारंपरिक सूक्ष्म आधारित तरीकों के साथ जुड़े तकनीकी सीमाओं आमतौर पर मांग की है कि कोशिकाओं और ऊतकों के दौरान काफी गैर शारीरिक स्थितियों के तहत बनाए रखा जा एक व्यापार के साथ रिकॉर्डिंग, संवेदनशीलता और प्रवाह के बीच बंद । यहां, हम पहले तरीकों की एक परिशोधन की रिपोर्ट है कि उच्च संवेदनशीलता और प्रवाह जो संस्कृति की स्थिति का एक व्यापक रेंज का समर्थन करता है के साथ दीर्घकालिक bioluminescence इमेजिंग की अनुमति देता है, चर गैस और आर्द्रता नियंत्रण सहित, और है कि कई अलग स्वीकार टिशू कल्चर प्लेट्स और डिश । यह स्वचालित अनुदैर्ध्य luciferase इमेजिंग गैस-और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर (मगरमच्छ) भी luciferase अभिव्यक्ति में एक सेल monolayer या ऊतक है, जो आसानी से पारंपरिक द्वारा मनाया नहीं जा सकता भर में स्थानिक रूपांतरों के अवलोकन की अनुमति देता है विधियों. हम पर प्रकाश डाला कैसे मगरमच्छ luciferase गतिविधि का पता लगाने के लिए काफी वृद्धि हुई लचीलापन प्रदान करता है जब मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में ।
जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिविधि के संवाददाताओं के रूप में luciferases का उपयोग आणविक और सेलुलर जीवविज्ञान अनुसंधान में एक लोकप्रिय तकनीक बन गया है. यह circadian क्षेत्र में सच है, जहां जुगनू luciferase संश्लेषण और उत्प्रेरक निष्क्रियण के कैनेटीक्स विशेष रूप से अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति में अनुदैर्ध्य परिवर्तन है कि लगभग 24 एच circadian चक्र पर हो रिपोर्टिंग के लिए अनुकूल हैं । जैसे, luciferase कवक, पौधों, मक्खियों सहित जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक circadian रिपोर्टर के रूप में कार्यरत है, और स्तनधारी1,2,3,4।
जब विट्रो मेंcircadian जीन अभिव्यक्ति बढ़ाता है, एक photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) सामांयतः bioluminescent संकेत रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । PMT-आधारित माप सीमित लचीलापन है, हालांकि, आमतौर पर एक पूर्व निर्धारित प्लेट या डिश आकार करने के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा. यह भी एक PMT का उपयोग कर निगरानी नमूनों से किसी भी स्थानिक जानकारी एकत्र करने के लिए संभव नहीं है, जो luciferase अभिव्यक्ति में स्थानिक भिन्नता दिखाने इमेजिंग नमूने जब जानकारी की हानि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, के रूप में पीएमटी और जुड़े इलेक्ट्रॉनिक्स खराबी जब एक मानक सेल संस्कृति मशीन के humidified वातावरण को उजागर, अनुदैर्ध्य luciferase PMTs का उपयोग कर रिकॉर्डिंग हमेशा गैर में किया जाता है-humidified परिणाम में, सेल संस्कृति व्यंजन हवा बंद किया जाना चाहिए-वाष्पीकरण के माध्यम से नमी घटाने को रोकने के लिए तंग और संस्कृति मीडिया इसलिए 3 के साथ बफर होना चाहिए-(N-morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) या 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) के बजाय कं2/bicarbonate बफ़रिंग प्रणाली है कि vivo में कार्य करता है और स्तनधारी ऊतक संस्कृति में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है ।
इन सीमाओं का एक परिणाम के रूप में, PMTs द्वारा bioluminescence के माप आमतौर पर शर्तों के तहत जो कोशिकाओं प्रयोगों के दौरान बनाए रखा है पर तंग प्रतिबंध रखता है । इन समस्याओं को दूर करने के लिए, और भी संभव प्रयोगात्मक शर्तों की सीमा बढ़ाने के लिए, हम एक मानक सह2/N2 १७० एल ऊतक संस्कृति मशीन है कि एक पानी ठंडा इलेक्ट्रॉन के अलावा द्वारा अनुकूलित किया गया है का उपयोग करें-गुणा आरोप-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा विरोधी धुंध प्रकाशिकी और तापमान और गैस के स्तर के डिजिटल नियंत्रण के साथ । यह एक स्वचालित अनुदैर्ध्य Luciferase इमेजिंग गैस और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर, या मगरमच्छ करार दिया गया है । मगरमच्छ bioluminescent इमेजिंग की काफी वृद्धि हुई लचीलेपन के लिए अनुमति देता है, दोनों मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों के उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए (अप करने के लिए 6 x ९६-या ३८४ अच्छी तरह से एक साथ प्लेटें) और भी गैर के लिए मानक ऊतक संस्कृति प्रणालियों, ऐसे के रूप में perfused कोशिकाओं microfluidic उपकरणों में उगाया । इस उपकरण भी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है humidified शर्तों के तहत होने के लिए और दोनों सह के चर नियंत्रण के साथ2 और हे2 आंशिक दबाव के रूप में अच्छी तरह से तापमान ।
नीचे प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल और ऊतक संस्कृति प्रणालियों के bioluminescent रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन एक मगरमच्छ का उपयोग कर (इसके बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए ‘ bioluminescence मशीन ‘) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि प्रणाली अच्छी तरह से bioluminescent इमेजिंग के लिए अनुकूल होगा और भी, कुछ संशोधन के साथ, फ्लोरोसेंट इमेजिंग, अंय जैविक प्रणालियों और संदर्भों की एक संख्या में ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्तनधारी सेल संस्कृति, दोनों perfused और स्थैतिक शर्तों के तहत के लिए है । हालांकि, मगरमच्छ आसानी से अंय मॉडल प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । दरअसल, यह पहले से ही गतिवान, नींद की एक साथ निगरानी के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, और परिधीय जीन अभिव्यक्ति लय में Drosophila melanogaster निरंतर अंधेरे के तहत बनाए रखा15. यह भी उल्लेख किया है कि, आवेदन पर निर्भर करता है, कैमरा प्रकार है कि यहां वर्णित के अलावा उपयुक्त हो सकता है । हमने कल्पना की थी कि उपयुक्त फ़िल्टर्स के साथ, वर्तमान सेटअप का एक संशोधित संस्करण प्रतिदीप्ति ठहराव के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
केवल अनुप्रयोगों के लिए जो मगरमच्छ उचित नहीं हो सकता है उन है जिसके लिए विशेष रूप से उच्च स्थानिक संकल्प की आवश्यकता है, ऐसे PER2 के spatiotemporal संगठन की इमेजिंग के रूप में:: स्तनधारी के organotypic स्लाइस में ल्यूक अभिव्यक्ति suprachiasmatic नाभिक, या अंय छोटे ऊतक स्लाइस ।
मगरमच्छ कई प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता है कि अब तक पारंपरिक रिकॉर्डिंग तकनीक द्वारा आसानी से प्राप्त नहीं किया गया है । bioluminescence की माप के लिए वर्तमान तरीकों के साथ तुलना में, मगरमच्छ सेल संस्कृति पकवान या स्लाइड है कि इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों के प्रकार में वृद्धि हुई लचीलापन प्रदान करता है, बाहरी मीडिया की स्थिति, संवेदनशीलता, और processivity.
यह एक समय में विशेष रूप से प्रासंगिक है जब वहां एक कदम है 3 डी organoid और प्रवाह संस्कृति प्रणालियों की ओर मानक 2d सेल संस्कृति मॉडल से दूर । जैसे, यह अनुमान है कि मगरमच्छ एक अनुकूलनीय विधि जिसके द्वारा bioluminescence शर्तों की एक व्यापक रेंज के तहत कई दिनों और हफ्तों से अधिक मापा जा सकता है प्रदान करेगा ।
The authors have nothing to disclose.
हम इस प्रणाली को विकसित करने के लिए हमारे साथ काम करने के लिए, विशेष रूप से मार्क हेनसन, जेरेमी ग्राहम और Joao Correia में केयर्न रिसर्च का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी डेविड वेल्श और अखिलेश रेड्डी बहुमूल्य चर्चा के लिए डिजाइन चरण के दौरान धंयवाद, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पीटर Laskey (पूर्व हमामात्सू के) पांडुलिपि के लिए अपने महत्वपूर्ण इनपुट के लिए एक डेमो कैमरा और डेविड वोंग के ऋण की व्यवस्था के लिए ।
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |