Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas – und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.
Luciferase-basierte Reporter der zellulären Genexpression sind weit verbreitet für beide längs- und Endpunkt assays biologischer Aktivität. In der zirkadianen Rhythmen Forschung entstehen z. B. Uhr gen Fusionen mit Firefly Luciferase robuste Rhythmen in zellulären Biolumineszenz, die über viele Tage hinweg beibehalten. Technische Einschränkungen verbunden mit Photomultiplier Tubes (PMT) oder konventionellen Mikroskopie-basierte Methoden zur Quantifizierung der Biolumineszenz haben in der Regel gefordert, dass Zellen und Gewebe ganz physiologischen Bedingungen während beibehalten werden Aufnahme mit einem Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Durchsatz. Hier berichten wir über eine Verfeinerung der vorherigen Methoden, die ermöglicht langfristige Biolumineszenz Bildgebung mit hoher Empfindlichkeit und Durchsatz die unterstützt eine breite Palette von Kulturbedingungen, einschließlich variabler Gas und Feuchtigkeitskontrolle, und akzeptiert, dass viele verschiedene Gewebekultur und Geschirr. Diese automatisierte längs Luciferase imaging-Gas – und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) auch ermöglicht die Beobachtung von räumlichen Variationen in Luciferase Ausdruck über eine Zelle Monolage oder Gewebe, das leicht durch herkömmliche beobachtet werden können Methoden. Wir heben hervor, wie der ALLIGATOR erheblich erhöhte Flexibilität für die Erkennung der Luciferase-Aktivität im Vergleich mit bisherigen Verfahren bietet.
Die Verwendung von Luciferases als Reporter der Genexpression und Proteinaktivität ist eine populäre Technik in der molekularen und zellulären Biologie Forschung geworden. Dies gilt im circadianen Bereich, wo die Kinetik der Firefly Luciferase Synthese und katalytische Inaktivierung sind besonders gut geeignet zur Berichterstattung der longitudinalen Veränderungen der Genexpression, die über die ca. 24 h circadiane Zyklus auftreten. Als solche wird Luciferase als circadiane Reporter in verschiedensten Organismen, einschließlich Pilze, Pflanzen, fliegen und Säugetiere1,2,3,4eingesetzt.
Wenn zirkadiane Gene Expression in Vitrozu quantifizieren, ist ein Photomultiplier Schlauch (PMT) verbreitet die biolumineszente Signal aufzeichnen. PMT-basierten Messungen haben jedoch eingeschränkt in der Regel auf einer vorher festgelegten Platte oder Schüssel Größe beschränkt. Es ist auch nicht möglich, alle räumlichen Informationen zu sammeln, aus Proben mit einem PMT, die führen kann zu einem Verlust von Informationen beim Proben abbilden, die räumliche Variation in Luciferase Ausdruck zeigen überwacht. Darüber hinaus wie die PMT und zugehörigen Elektronik anfällig für Fehlfunktionen bei der feuchte Umgebung eine Standardzelle Kultur Inkubator ausgesetzt sind, erfolgt längs Luciferase-Aufnahme mit PMTs stets in Inkubatoren nicht befeuchtet. In der Folge Zelle Kultur Gerichte müssen dicht sein Luft-um Feuchtigkeitsverlust durch Verdunstung zu verhindern und die Nährmedien müssen daher mit 3 – gepuffert werden (N– Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) oder 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), anstatt die CO2/bicarbonate Pufferung System, das funktioniert in Vivo und wird routinemäßig in Säugetieren Gewebekultur verwendet.
Aufgrund dieser Beschränkungen schränkt Messung der Biolumineszenz von PMTs in der Regel engen auf die Bedingungen, unter denen Zellen während der Experimente gewahrt sind. Um diese Probleme zu überwinden, und auch zur Erhöhung der Reichweite der experimentellen Bedingungen, verwenden wir einen standard CO2/n2 170 L Gewebekultur-Inkubator, der durch die Zugabe von einem Wasser-gekühlten Elektron-Multiplikation angepasst wurde – Coupled Ladegerät (EMCCD) Kamera mit Antibeschlag-Optik und die digitale Steuerung von Temperatur und Gas. Dies ist eine automatisierte längs Luciferase Imaging Gas- und Temperature-Optimized Recorder oder ALLIGATOR bezeichnet worden. Der ALLIGATOR ermöglicht eine wesentlich höhere Flexibilität der Biolumineszenz imaging, sowohl für Hochdurchsatz-Bildgebung der standard Gewebekultur Platten (bis zu 6 X 96 oder 384-Well-Platten gleichzeitig) und auch für nicht standardmäßige Gewebekultur-Systeme, so als perfundierten Zellen in mikrofluidischen Geräte angebaut. Dieses Instrument ermöglicht auch imaging zu feuchte Bedingungen und Variable Steuerung der CO2 und O2 Partialdruck sowie Temperatur auftreten.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode für die Biolumineszenz Aufzeichnung von Säugetierzellen und Gewebekultur Systeme mit einem ALLIGATOR (im folgenden als “Biolumineszenz Inkubator” bezeichnet). Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass das System gut geeignet zur Biolumineszenz Bildgebung und auch mit einigen Änderungen, Leuchtstofflampen, imaging, in einer Reihe von anderen biologischen Systemen und Kontexte wäre.
Das hier beschriebene Protokoll ist für Säugetier-Zellkultur, beide perfundierten und statischen Bedingungen. Der ALLIGATOR kann jedoch leicht auf andere Modellsysteme angepasst. In der Tat hat sich bereits gezeigt, eine hervorragende Plattform bieten für die gleichzeitige Überwachung der Fortbewegung, Schlaf und peripheren gen Ausdruck Rhythmen in Drosophila Melanogaster unter ständige Dunkelheit15. aufrechterhalten Es wird darauf hingewiesen, dass je nach Anwendung, Kamera-Typen als die hier erwähnten geeignet sein können. Wir uns vorstellen, dass mit den entsprechenden Filtern, eine modifizierte Version des aktuellen Setups im Prinzip für die Fluoreszenz-Quantifizierung verwendet werden könnte.
Die einzigen Anwendungen, für die der ALLIGATOR möglicherweise nicht geeignet, sind diejenigen, für die besonders hoher räumlicher Auflösung erforderlich, z. B. Bildgebung der räumlich-zeitliche Organisation der PER2::LUC Ausdruck in den Säugetieren organotypischen Scheiben suprachiasmatischen Kern, oder andere kleine Gewebe-Scheiben.
Der ALLIGATOR ermöglicht viele Experimente durchgeführt werden, die bisher nicht durch konventionelle Aufnahmetechniken leicht erreichbar gewesen. Im Vergleich mit aktuellen Methoden zur Messung der Biolumineszenz, bietet der ALLIGATOR mehr Flexibilität bei der sowohl die Art der Zelle Kulturschale oder Folie, die verwendet werden kann, die externen Medien Bedingungen, Empfindlichkeit und Processivity.
Dies gilt insbesondere in einer Zeit wenn es eine Abkehr von der standard 2D Kultur Zellmodelle in Richtung 3D organoide und Flow-Kultur-Systeme ist. Als solche wird davon ausgegangen, dass der ALLIGATOR eine anpassungsfähige Methode zur Verfügung stellt, mit der Biolumineszenz über viele Tage und Wochen unter den unterschiedlichsten Bedingungen gemessen werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchte Cairn-Forschung danken für die Arbeit mit uns dieses System vor allem Mark Henson, Jeremy Graham und Joao Correia zu entwickeln. Wir danken auch David Welsh und Akhilesh Reddy für wertvolle Diskussion während der Entwurfsphase, sowie Peter Laskey (früher von Hamamatsu) für die Vermittlung des Darlehens eines Demo-Kamera und David Wong für seine kritische Eingabe des Manuskriptes.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |