1. semina e trascinamenti di temperatura delle cellule Nota: Questo protocollo è stato rigorosamente testato usando i fibroblasti primari e immortalata del mouse che esprimono la proteina di fusione PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)4. Modifiche potrebbero essere necessario prevedere gli esperimenti usando altre linee cellulari. Prima di iniziare la coltura cellulare, inserire quanto segue in un bagno di acqua di 37 ° C per riscaldare: tampone fosfato salino (PBS) (pH 7.4), PBS, completati con l’acido etilendiamminotetracetico 0.68 mM, pH 7,2 (PBS + EDTA), terreni di coltura di cella appropriata, ad esempio, Medium (DMEM dell’Aquila per volta di Dulbecco) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina e 0,25% soluzione di tripsina. Rapporto di diluizione 1:3 di tripsina con soluzione PBS + EDTA pre-riscaldato e tornare a bagno d’acqua. Prendere un pallone da2 cm 125 di luciferasi-esprimendo le cellule che sono 70-90% confluenti. Aspirare i media. Aggiungere 10 mL di PBS preriscaldata. Aspirare il PBS. Aggiungere 2,5 mL pre-riscaldato tripsina-EDTA e tornare il matraccio in un incubatore a 37 ° C per 5 min. Rimuovere le cellule dall’incubatore e vista al microscopio. Una volta che la maggioranza delle cellule è staccate dal fondo del matraccio, continuare al passaggio successivo. Se la maggior parte delle cellule rimangono attaccata al fondo del matraccio, restituirlo nell’incubatore fino a quando la maggior parte delle cellule sono in sospensione. Aggiungere altri 7,5 mL di mezzo di coltura cellulare standard al pallone. Facoltativamente, rimuovere 1 mL di questo ulteriore passaggio delle cellule, come richiesto. Contare la densità delle cellule rimanenti utilizzando un emocitometro e blu di trypan. Diluire le cellule più ulteriormente, come appropriato per tale linea cellulare.Nota: Per gli esperimenti qui sotto, PERIOD2::LUC fibroblasti sono stati seminati tra 6 x 103 cellule/cm2 e 1 x 104 cellule/cm2 in piastre da 96 pozzetti, piatti di 35mm o diapositive di canale. Cellule di seme sulla coltura di tessuti piatti o piastre che verranno utilizzati per la registrazione.Nota: Neri bifacciale, con fondo chiaro piastre si consiglia come questo permette cultura salute essere valutati prima di iniziano le registrazioni mentre riducendo l’interferenza tra pozzetti durante la registrazione. Dove sono estremamente bassi livelli di bioluminescenza, piatti/piatti bianchi dovrebbe essere utilizzati per ottimizzare il rilevamento della luce, anche se per favore nota che la fosforescenza può portare a aumentato segnale di fondo che persiste per diverse ore. Riporre le piastre nell’incubatore e consentire gli strati monomolecolari raggiungere 100% confluenza (circa 7 giorni).Nota: Una volta confluenti, linee cellulari che inibiscono il contatto possono essere mantenute per fino a tre settimane prima della sperimentazione purché i media viene aggiornato regolarmente (ogni 5-7 giorni). Una volta confluenti, sincronizzare cellulari ritmi utilizzando cicli di temperatura applicata (12 h a 32 ° C, 12 ore a 37 ° C) per un minimo di 72 ore immediatamente prima della sperimentazione5,6 (utilizzando un incubatore ciclismo pre-programmato, controllata da un computer connesso nell’incubatore attraverso una porta seriale RS-232).Nota: Il numero di cicli di temperatura necessari per la sincronizzazione dei ritmi cellulari può variare tra le linee di cellule e pertanto potrebbe essere necessario essere ottimizzato per altre linee cellulari. Stimolo farmacologico acuto usando forskolin o desametasone inoltre è stato utilizzato in precedenza per sincronizzare il cellulare ritmi7,8. 2. NS21 preparazione Nota: NS21 è un integratore privo di siero per la manutenzione delle colture delle cellule di un neurone e altri. È un perfezionamento di un simile integratore noto come B27, che è commercialmente disponibile e può essere utilizzato come sostituto del siero durante circadiano bioluminescenza registrazioni9. Qualsiasi supplemento possa essere utilizzato indifferentemente nei supporti di registrazione per i protocolli sperimentali descritti di seguito. È abbastanza fattibile e conveniente per rendere NS21 in-House, come Chen et al. 10e come descritto qui. Equilibrare tutti i componenti descritti nella tabella 1 a temperatura ambiente per 1 h prima di iniziare. Sciogliere il albumina bovina 50g in sostanza basale 324 mL (ad es., neurobasal) sul ghiaccio. Mescolare il meno possibile. Aggiungere tutti gli altri componenti, mescolando minimamente dopo ogni componente ma ancora assicurandosi di miscelare. Mirano a sciogliere tutti i componenti all’interno di 90 min di avviamento. Aliquotare la miscela finale e conservare a-20 ° C fino a quando richiesto. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.Nota: La miscela è troppo viscosa per filtrare in questa fase, ma sarà sterile filtrata quando diluito con media prima di aggiungerlo alle cellule. 3. registrazione Media preparazione Nota: Dei principali vantaggi dell’incubatore bioluminescenza sopra altre apparecchiature per la registrazione longitudinale bioluminescenza è che, in virtù di essere in grado di umidificare l’incubatrice e variare le pressioni parziali di CO2e O2 , è possibile utilizzare una vasta gamma di condizioni di supporto per registrazione bioluminescenza — comprese le condizioni che più strettamente approssimano la nicchia fisiologica occupata dalla cella diversa tipi in vivo. Qui di seguito descriviamo la formulazione di registrazione multimediale adattato da Hastings et al. 9, che abbiamo usato ordinariamente con colture di fibroblasti e altri tipi di cellule. Il primo è per condizioni di coltura sigillati (senza scambio di gas), e il secondo è per condizioni fisiologicamente rilevanti e dovrebbe essere usato in condizioni umidificate con 5% CO2.Molte altre variazioni sono sia possibile e opportuno, a seconda dell’esatta applicazione e il tipo delle cellule. Preparazione di terreni di tampone MOPS alto glucosioNota: Stock soluzione (1 L): polvere di DMEM (8,3 g/L), glucosio 5 mg/mL di 0,35 mg/mL il bicarbonato di sodio, , 0,02 M MOPS, 100 U/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina. Sciogliere la polvere DMEM 8,3 g in 900 mL di acqua ultrapura in un cilindro graduato 1.000 mL e mescolare per 30 min fino a quando tutte le particelle sono dissolti. Aggiungere 50 mL di soluzione di glucosio (100 g/L), 20 mL di MOPS (1 M, pH 7.6), 10 mL di soluzione di penna/strep: 100x e mescolare per ulteriori 10 minuti. Aggiungere la soluzione di bicarbonato di sodio 7,5% 4,7 mL e mescolare per ulteriori 5 minuti. Regolare il pH di media a 7,6 (se a temperatura ambiente) o 7.4 (37 ° C) con HCl/NaOH. Aggiungere acqua ultrapura per produrre un volume finale di 1.000 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un 0,22 µm filtro e conservare a 4 ° C fino a quando richiesto. Prima della sperimentazione, integrare un appropriato volume della soluzione di riserva con 10% siero, 2mm L-alanil-L-Glutammina, luciferina 2% NS21 e 1 mM per fare un lavoro di magazzino. Passare questo stock attraverso un filtro sterile da 0,22 µm. Misurare il osmolality del supporto utilizzando un Osmometro. Accendere l’Osmometro. Calibrare l’Osmometro, prima con acqua ultrapura. Aggiungere 50 µ l acqua per il fondo di un recipiente di misura. Assicurarsi che non vi siano nessun bolle nel liquido. Agganciare la nave sopra la sonda. Premere ‘Zero’ e abbassate il braccio Osmometro al punto più basso. Attendere fino a quando la lettura è completa e verde ‘risultato’ spia sia accesa prima di sollevamento del braccio e rimuovere il recipiente. Ripetere la procedura per calibrare l’Osmometro a 300 mOsmol/kg utilizzando standard di calibrazione 50 µ l. Premere ‘Cal’ prima di abbassare il braccio. Misurare il osmolality campione aggiungendo 50 µ l di media sul fondo di un recipiente di misura ed misura come sopra. Premere ‘esempio’ prima di abbassare il braccio di Osmometro. Regolare il osmolality di 350 mOsmol utilizzando 5 M NaCl. HCO3-tamponata preparazione media (medium di perfusione) glucosio bassoNota: Stock soluzione (1 L): polvere di DMEM (8,3 g/L), 3,7 mg/mL bicarbonato di sodio, glucosio 1 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Sciogliere la polvere DMEM 8,3 g in 900 mL di acqua ultrapura in un cilindro graduato 1.000 mL e mescolare per 30 min fino a quando tutte le particelle sono dissolti. Aggiungere 50 mL di soluzione di glucosio (100 g/L), 10 mL di soluzione di penna/strep x 100 e mescolare per ulteriori 10 minuti. Aggiungere mL 49,4 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio e mescolate per ulteriori 5 minuti. Regolare il pH di media a 7,6 (a temperatura ambiente) o 7.4 (37 ° C) con HCl/NaOH. Aggiungere acqua ultrapura per dare un volume finale di 1.000 mL. Filtrare la soluzione attraverso un 0,22 µm filtro sterile e conservare a 4 ° C fino all’utilizzo. Prima della sperimentazione, integrare un appropriato volume della soluzione di riserva con 2% di siero 2 mM L-alanil-L-Glutammina, 2% NS21 e luciferina di 1 mM per fare un lavoro di magazzino. Passare questo stock attraverso un filtro sterile da 0,22 µm. Misurare e regolare il osmolality di 350 mOsmol utilizzando 5 M di NaCl, per quanto riguarda il media tampone MOPS. Nota: Luciferina concentrazione deve essere determinata empiricamente per ogni tipo di cellula e il contesto. Per ulteriori informazioni vedere Feeney et al. Concentrazioni di 11 siero e NS21 (o B27 se usato) possono essere variate a seconda dell’applicazione. Tuttavia, si consiglia che, se non empiricamente testati per dimostrare il contrario, siero e NS21 (o alternativo privo di siero supplemento) essere usato, come questi promuovono allegato e sopravvivenza delle cellule. In linee cellulari che non siano a contatto inibiscono bene, può essere necessario abbassare la concentrazione nel siero nei supporti di registrazione per prevenire gli effetti confondenti di proliferazione, che è promosso anche dal siero. 4. registrazione Prima di iniziare la registrazione, è possibile posizionare lo stock di media di lavoro appropriato (dal punto 3.1 o 3.2 a seconda dell’esperimento) in un bagno di acqua di 37 ° C per riscaldare. Mentre i media si sta riscaldando, mettere a fuoco la fotocamera nell’incubatrice bioluminescenza. Svitare il filtro a densità neutra impermeabile all’acqua, riscaldata e mettere da parte. Impostare il software per registrare un video con una velocità di acquisizione elevata. Fare clic su “acquisizione | Setup di acquisizione”. Impostare ‘Tempo di esposizione’ a 0,2 s e tempo di ciclo cinetica a 0,3 secondi. Assicurarsi che il guadagno di EM è spento. Chiudere la finestra ‘Acquisizione Setup’ e fare clic sull’icona di “prendere il video”. Utilizzando il cilindro di messa a fuoco, ruotare l’obiettivo della fotocamera fino a elementi sullo scaffale all’altezza da registrare sono chiaramente a fuoco nel video. Interrompere il video cliccando sull’icona ‘stop video’. Avvitare il filtro a densità neutra riscaldata in posizione; in caso contrario si tradurrà in danni per l’EM-CCD telecamera e/o appannamento dell’obiettivo a causa della condensa. Impostare O2, CO2e temperatura desiderata delle condizioni sperimentali utilizzando il pannello di controllo sulla parte anteriore dell’incubatore di bioluminescenza.Nota: Se si esegue irrorato coltura cellulare procedere direttamente alla sezione 5 in questa fase. Rimuovere le celle dalla coltura del tessuto incubatore e aspirato disattivare il supporto. Sostituire il supporto con stock di lavoro pre-riscaldato. Se l’incubatrice di bioluminescenza è di non essere umidificati durante l’esperimento, quindi sigillare i piatti e le piastre con una guarnizione impermeabile a gas.Se l’incubatrice di bioluminescenza è quello di essere umidificati, allora esso non è strettamente necessario sigillare piatti, anche se è preferibile per sigillare piatti con un piccolo volume, ad esempio piastre da 96 pozzetti, utilizzando una guarnizione gas-permeabili, come una piccola quantità di evaporazione può altrimenti ancora si verificano anche in incubatrice umidificate.Nota: L’umidificazione avviene riempiendo la vaschetta dell’acqua alla base dell’incubatore. Trasferire le cellule nell’incubatore di bioluminescenza, Chiudi la porta incubatore e incubatore di sicuro coprire in luogo per formare un sigillo a tenuta di luce. Selezionare i parametri di registrazione appropriati per l’applicazione. Fare clic su “acquisizione | Setup di acquisizione”. Nel pannello ‘Configurazione delle telecamere’, impostare: ‘Modalità di acquisizione’ a ‘Cinetica’; ‘Tempo di esposizione’ al tempo di esposizione, desiderato in secondi (Vedi nota sotto); ‘Accumulazioni’ a 1; ‘Lunghezza di serie kinetic’ al numero di cicli di acquisizione desiderato; ‘Tempo di ciclo cinetico’ intervallo imaging desiderato (assicurarsi che questo sia maggiore del tempo di esposizione); ‘Shift velocità’ a 4,33 µsecs; ‘Gain’ a 1; e li guadagno ‘ per il desiderato livello (Vedi nota sotto) Nel pannello ‘Autosave’, impostare il tipo di file sif o. TIF. Fornire un nome di file e salvataggio posizione del caso. Nel pannello ‘Spooling’, impostare il tipo di file da tiff. Fornire un nome di file e salvataggio posizione del caso. Chiudere la finestra di setup di acquisizione. Avviare la registrazione facendo clic sul pulsante ‘prendere segnale’.Nota: Come l’incubatore di bioluminescenza può essere utilizzato per un gran numero di cellulari diversi e tipi di tessuto, ognuno dei quali avrà diversi livelli di bioluminescenza, il tempo di esposizione necessario per raccogliere un appropriato segnale bioluminescente varierà tra esperimenti. È anche possibile variare il guadagno (EM) moltiplicazione di elettrone di imaging al fine di aumentare l’ampiezza del segnale raccolto. Per le nuove applicazioni di luminosità sconosciuto, ti consigliamo prima prendendo una singola immagine con un tempo di esposizione relativamente breve (circa 10 min) senza guadagno di EM e successivamente regolando sia tempo di esposizione ed EM guadagno finché non sono state le condizioni di registrazione desiderata raggiunto. Nella maggior parte dei casi, un segnale medio di 10-20% dell’intensità massima possibile del pixel per la macchina fotografica è un buon livello di puntare per. Una volta raggiunta un set di parametri di registrazione appropriato, è necessario avviare longitudinale acquisizione delle immagini, come descritto sopra. 5. irrorato coltura tissutale (opzionale) Nota: Come descritto nell’introduzione, l’incubatore di bioluminescenza è adatto per l’imaging dei sistemi di coltura del tessuto non standard. Questo è esemplificato nello sviluppo di un sistema di coltura cellulare irrorato. Seme le cellule sul singolo canale scorre con connettori Luer con una profondità di canale di 0,6 o 0,8 mm, in DMEM con 10% FBS e pen/strep, come descritto nella sezione 1. Fai il media di aspersione come descritto al punto 3.2. Prima della registrazione, preparare tubi per il sistema di perfusione richiesto utilizzando 1 mm di diametro interno (I.D.) Tubazione di ETFE e tubazione del silicone di 1 mm di diametro, raccordi Luer gomito, maschio e femmina, come mostrato nella Figura 2A.Nota: La maggior parte della lunghezza del tubo è tubazione di ETFE, con sezioni di 2 cm di tubo in silicone utilizzato per collegare i tubi di ETFE ai raccordi Luer, che successivamente si collegano nelle slitte del canale. Sterilizzare il tubo mediante flussaggio con etanolo al 70%, seguita da PBS sterile. Rimuovere le colture cellulari in diapositive canale dall’incubatrice. Aspirare i media e sostituire con i media di perfusione pre-riscaldato. Riempire una siringa da 20 mL con il supporto di perfusione pre-riscaldato. Collegare il tubo al buffer piastrina (Vedi Figura 2) ma non alla diapositiva che contiene delle cellule e sciacquare il tubo e far scorrere con media di aspersione (3-5 mL). Collegare la diapositiva che contiene cellule e lavare l’intero sistema con un ulteriore 1 mL di media per rimuovere eventuali bolle d’aria. Trasferire l’intero sistema nell’incubatore di bioluminescenza. Misura le siringhe piene di media alla siringa senza scollegare dal tubo della pompa e svuotare un ulteriore 1 mL di media attraverso l’intero sistema utilizzando la pompa per garantire non ci sono bolle d’aria nel sistema. Impostare il diametro della pompa a quella della siringa viene utilizzata.Nota: Per le siringhe da 20 mL usate qui, il diametro è 19,13 mm. Impostare la portata della pompa a 50 µ l/h e avviare l’esecuzione. Assicurarsi che non ci sono bolle in diapositive o tubazione prima dell’inizio della registrazione, come queste influenzeranno la espressione di luciferase quando passano attraverso il monostrato cellulare. Se necessario, sciacquare ulteriormente media attraverso le cellule per raggiungere questo obiettivo. Chiudere lo sportello dell’incubatore bioluminescenza e continuare come al punto 4.7 per iniziare la registrazione. 6. trattamento durante la registrazione Nota: A volte è auspicabile per il trattamento di midway di cellule attraverso una registrazione, sia con agenti farmacologici o ormonali. In tali casi, è imperativo che le cellule sono maneggiate con cura per evitare l’oscillazione cellulare dalla reimpostazione durante il trattamento. Per questo motivo, è di particolare importanza che le cellule siano mantenute a temperatura costante, come questo è un grande spunto spingimento per cellulare ritmi circadiani5,6. Preparare tutti i componenti del trattamento prima dell’arresto della registrazione. Preparare un pad chimico isotermo a 37 ° C. Interrompere la registrazione del dispositivo, rimuovere i piatti per essere trattati e posizionare sul termoforo isotermica. Trattare le culture come richiesto e ritorno per l’incubatore di bioluminescenza nella stessa posizione come prima. Ri-avviare la registrazione. 7. analisi Nota: L’incubatore di bioluminescenza produce dati sotto forma di una serie di singole immagini.Abbiamo principalmente utilizzare Fiji12 per gestire queste immagini e quindi esportare i dati di intensità media pixel per ogni area di interesse (ROI) per ulteriori analisi. Aprire lo stack di immagine in Fiji e regolare la luminosità e il contrasto facendo clic su “immagine | Regolare | Luminosità/contrasto”e le barre di scorrimento di regolazione fino a quando le immagini sono entro limiti appropriati per la visualizzazione del segnale bioluminescente. Selezionare le aree di interesse utilizzando il gestore di ROI disponibile sotto “Analyze | Strumenti | ROI Manager”. Esportazione di segnale medio per l’area selezionata facendo clic su “gestione ROI | Più | Multilaterali”. Copiare i dati risultanti nel software di analisi. Regolare manualmente l’orario di base di dati per l’intervallo di tempo di formazione immagine, (cioè, 15, 30 o 60 min intervalli, designati come 0,25, 0,5 o 1 h), anziché il numero di immagine fornito da Fiji.Nota: Ulteriore analisi può ora essere eseguita, ad esempio determinazione del periodo. Per questo, la seguente equazione viene utilizzata per eseguire l’analisi di regressione non lineare: dove y è il segnale, x il tempo corrispondente, m è la pendenza della linea di tendenza, c è l’intercetta su y della linea di tendenza, l’ampiezza è l’altezza del picco della forma d’onda sopra la linea di tendenza, k è la costante di decadimento o tasso di smorzamento (tale che 1 /k è l’Half-Life), fase è lo spostamento in x dell’onda coseno e il periodo è il tempo impiegato per un ciclo completo di13. R2 valore viene utilizzato come un indicatore della bontà di adattamento. Sono possibili anche altri metodi di analisi. Le prime 24 ore dell’acquisizione dovrebbe essere esclusi dall’analisi, come bioluminesence cellulare può esibire cambiamenti transitori, non circadiano durante questo tempo. Questo è il risultato di una risposta acuta al cambiamento di media.