Генетически закодированный Люцифераза является популярным неинвазивные репортер экспрессии генов. Использование автоматизированных продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил) позволяет продольная запись от биолюминесцентных клетки под широкий спектр условий. Здесь мы покажем, как крокодил может использоваться в контексте исследований циркадные ритмы.
На основе Люцифераза Репортеры экспрессии клеточных генов широко используются для обеих продольных и концевой assays биологической активности. В исследованиях циркадные ритмы например, Будильник гена сплавливания с Светлячок Люцифераза давать надежные ритмы в клеточных биолюминесценции, которые сохраняются в течение многих дней. Технические ограничения, связанные с фотоэлектронный умножитель трубы (ПЛТ) или обычные методы, основанные на микроскопии, для количественной оценки биолюминесценции обычно потребовали сохранить клетки и ткани в довольно физиологических условиях во время запись, с компромисс между чувствительностью и пропускную способность. Здесь мы приводим уточнение предыдущих методов, позволяющий долгосрочные биолюминесценции изображений с высокой чувствительностью и пропускную способность, которая поддерживает широкий спектр условий культуры, в том числе переменной газа и контроля влажности, и который принимает много различных Культура ткани тарелки и блюда. Этот автоматизированный продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил) также позволяет наблюдать пространственные вариации в выражении Люцифераза через монослоя клеток или ткани, которая не может легко наблюдать традиционный методы. Мы подчеркиваем, как АЛЛИГАТОР обеспечивает значительно повышенную гибкость для обнаружения Люцифераза активности по сравнению с существующими методами.
Использование luciferases как журналисты экспрессии генов и белков деятельности стало популярным методом молекулярной и клеточной биологии исследований. Это верно в суточный области, где кинетика Светлячок Люцифераза синтеза и каталитического инактивации особенно хорошо подходят для продольной изменения в экспрессии генов, которые могут произойти в течение приблизительно 24 h суточного цикла отчетности. Таким образом Люцифераза работал репортером суточного в широком спектре организмов, в том числе грибов, растений, мух и млекопитающие-1,–2,–3,–4.
При количественной оценке суточного ген выражение в пробирке, трубу фотоэлектронный умножитель (ПЛТ) обычно используется для записи биолюминесцентных сигнала. PMT-основе измерений имеют ограниченный гибкость однако обычно ограничивается размером заранее тарелку или на блюдо. Также невозможно собрать любой пространственной информации от образцов, контролируется с помощью ПЛТ, который может привести к потере информации при визуализации образцы, которые демонстрируют пространственной вариации в Люцифераза выражение. Кроме того как ПЛТ и электроника подвержены сбоям при контакте с увлажненной среде инкубатор культуры стандартной ячейки, продольные Люцифераза записи с помощью ПМЦ всегда выполняется в инкубаторы не увлажняется. В результате, клетки культуры блюда должны быть закрыты герметичным, чтобы предотвратить потерю влаги через испарение и средства массовой информации культуры поэтому должно помещаться в буфер с 3 – propanesulfonic кислоты (N– Морфолино) (МОПЫ) или 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) -1- piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), вместо того, чтобы /bicarbonate CO2, буферизацию системы, которая функционирует в естественных условиях и обычно используется в млекопитающих культуры ткани.
В результате этих ограничений измерения биолюминесценции в ПМЦ обычно ставит жесткие ограничения на условия, при которых клетки поддерживаются во время экспериментов. Для преодоления этих проблем, а также увеличить спектр возможных экспериментальных условиях, мы используем стандартный CO2/n2 170 L культуры ткани инкубатор, который был адаптирован путем добавления воды охлажденные электрон умножения зарядовой (EMCCD) Камера с оптикой анти туман и цифровой контроль температуры и газа уровнях. Это уже окрестили автоматизированной продольная газ Люцифераза Imaging и Temperature-Optimized рекордер или АЛЛИГАТОР. АЛЛИГАТОР позволяет существенно увеличить гибкость биолюминесцентных изображений, оба для высокой пропускной способности воображения стандартных тканевой культуры пластин (до 6 x 96 – или 384-ну тарелок одновременно) и также для нестандартных культуры ткани систем, такие как перфузии клеток, выращиваемых в microfluidic приборы. Этот инструмент также позволяет для изображений происходит в увлажненные условиях и с переменной управления CO2 и O2 парциальное давление, а также температура.
Ниже протокол описывает метод для биолюминесцентных записи mammalian клеток и тканевой культуры систем с использованием АЛЛИГАТОРА (далее «биолюминесценции инкубатор»). Следует отметить, однако, что эта система будет хорошо подходит биолюминесцентных изображений, а также, с некоторыми изменениями, флуоресцентных изображений, в ряде других биологических систем и контекстов.
Протокол, описанные здесь является для культуры mammalian клетки, оба перфузии и статических условиях. Однако АЛЛИГАТОР может быть легко адаптирована к другим системам модель. Действительно это уже было показано обеспечивают отличную платформу для одновременный мониторинг передвижения, сна и периферийных ген выражение ритмы в Drosophila melanogaster под постоянной темноты15. Он также отметил, что, в зависимости от приложения, типы камер помимо упомянутых здесь могут быть уместными. Мы предполагаем, что с соответствующими фильтрами, модифицированную версию текущей настройки могут в принципе использоваться для флуоресценции количественной оценки.
Только приложения, для которых АЛЛИГАТОР может оказаться нецелесообразным являются те, для которых требуется особенно высокое пространственное разрешение, например изображений пространственно-временных Организации выражения PER2::LUC в organotypic ломтики млекопитающих Супрахиазмальное ядро, или других небольших тканей срезы.
АЛЛИГАТОР позволяет выполняться много экспериментов, которые до сих пор не были легко достижимо путем записи обычных методов. По сравнению с текущими методами для измерения биолюминесценции, АЛЛИГАТОР обеспечивает повышенную гибкость в тип клеток культуры блюдо или слайд, который может быть использован, условий внешних средств массовой информации, чувствительность и processivity.
Это особенно актуально в то время, когда есть отход от стандартные 2D клетки культуры моделей на 3D систем культуры органоид и потока. Таким образом предполагается, что АЛЛИГАТОР обеспечит адаптации метод, по которому биолюминесценции может быть измерена в течение многих дней и недель под широкий спектр условий.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Cairn исследований для работы с нами в разработке этой системы, в частности Марк Хенсон, Джереми Грэм и Жуан Коррейя. Мы также благодарим Дэвид Уэлш и Редди Акхилеш за ценные обсуждения во время проектирования, а также Питер Лаский (ранее из Хамамацу) за организацию кредита демо камеры и Дэвид Вонг для его критический вклад рукопись.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |