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Biochemistry

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56627
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1
1ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, Department of Animal, Plant and Soil Science, School of Life Science, La Trobe University, 2School of Biological Sciences, Flinders University, 3ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, University of Western Australia

Summary

के रूप में mitochondria केवल संयंत्र सेल का एक छोटा सा प्रतिशत हैं, वे अध्ययन की एक सीमा के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए । Mitochondria homogenization द्वारा संयंत्र अंगों की एक किस्म से अलग किया जा सकता है, विभेदक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा पीछा करने के लिए एक उच्च शुद्ध mitochondrial अंश प्राप्त करते हैं ।

Abstract

Mitochondria पौधों में कई चयापचय रास्ते में शामिल organelles आवश्यक हैं, सबसे विशेष रूप से nicotinamide adenine dinucleotide (नध) और फ्लेविन adenine जैसे कम यौगिकों के ऑक्सीकरण से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन dinucleotide (फॊध2). Arabidopsis थालियाना जीनोम की पूरी एनोटेशन यह सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल संयंत्र मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया है, और इस प्रकार के अंगों की एक किस्म (पत्ती, जड़, या फूल) से mitochondria को शुद्ध करने की आवश्यकता है पूरी तरह से उपकरणों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि अब mitochondrial बायोलॉजी के अध्ययन के लिए Arabidopsis के लिए उपलब्ध हैं । Mitochondria ऊतक के homogenization द्वारा दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, अंतर केंद्रापसारक एक कच्चे mitochondrial गोली है कि आगे सतत कोलाइडयन घनत्व ढाल का उपयोग कर शुद्ध है उत्पादन कदम की एक श्रृंखला के बाद अपकेंद्रित. कोलाइडयन घनत्व सामग्री बाद में कई केंद्रापसारक कदम से हटा दिया है । ताजा पत्ती ऊतक के १०० जी से शुरू, mitochondria के 2-3 मिलीग्राम नियमित रूप से प्राप्त किया जा सकता है । इन mitochondria पर श्वसन प्रयोगों १००-२५० nmol ओ की विशिष्ट दरों प्रदर्शन2 मिनट-1 मिलीग्राम कुल mitochondrial प्रोटीन-1 (नध-निर्भर दर) विभिन्न सब्सट्रेट और अवरोधकों का उपयोग करने की क्षमता के साथ निर्धारित करने के लिए जो सब्सट्रेट ऑक्सीकरण किया जा रहा है और वैकल्पिक और cytochrome टर्मिनल oxidases की क्षमता । यह प्रोटोकॉल सतत कोलाइडयन घनत्व ढाल और शुद्ध संयंत्र mitochondria के एक कुशल श्वसन माप का उपयोग कर Arabidopsis थालियाना पत्तियों से mitochondria की एक अलगाव विधि का वर्णन ।

Introduction

संयंत्र mitochondrial अनुसंधान के इतिहास १०० साल1से अधिक वापस चला जाता है । बरकरार mitochondria पहले 1950 के दशक में विभेदक केंद्रापसारक का उपयोग कर अलग थे । 1980 के दशक में एक कोलाइडयन घनत्व ढाल के आगमन mitochondria परासरणी समायोजन दुख के बिना शुद्ध होने की अनुमति दी । जबकि ढाल शुद्ध mitochondria अधिकांश प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री की संवेदनशीलता के कारण, यहां तक कि अपेक्षाकृत मामूली दूषित पदार्थों का पता लगाया जा सकता है और अनुपयुक्त एक mitochondrial स्थान2असाइन किया गया हो सकता है । मुक्त प्रवाह ट्रो का उपयोग दोनों plastidic और peroxisome संदूषण3दूर कर सकते हैं, लेकिन मुक्त प्रवाह ट्रो एक अति विशिष्ट तकनीक है और अध्ययन के विशाल बहुमत के लिए आवश्यक नहीं है । इसके अलावा, जब एक प्रोटीन के स्थान का निर्धारण यह याद है कि दोहरी या प्रोटीन के कई लक्ष्यीकरण कोशिकाओं में होता है की जरूरत है । १०० से अधिक दोहरी लक्षित प्रोटीन chloroplasts/plastids और mitochondria4के लिए वर्णित हैं, और mitochondria और peroxisomes को लक्षित प्रोटीन की एक संख्या भी जाना जाता है5। इसके अलावा, विशिष्ट उत्तेजनाओं के तहत प्रोटीन का पुन: स्थान, oxidative तनाव उदा , सेल बायोलॉजी6में एक उभरते विषय है । इस प्रकार, प्रोटीन का स्थान अध्ययन करने के लिए जीव विज्ञान के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए, और दृष्टिकोण की एक किस्म का निर्धारण और स्थान की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है2.

Mitochondria आम तौर पर homogenization द्वारा संयंत्र के ऊतकों से अलग कर रहे हैं, एक संतुलन Mitochondria जारी करने के लिए सेल दीवार खोलने तोड़ने के बीच की आवश्यकता है, और Mitochondria को नुकसान नहीं. परंपरागत रूप से, आलू और फूलगोभी के साथ, homogenization गतिविधि बनाए रखने के लिए विभिन्न घटकों के साथ एक बफर में एक तरल निकालने के लिए घरेलू ब्लेंडर/जूसर उपकरण का उपयोग करना शामिल है । मटर के पत्तों से mitochondria का अलगाव, (mitochondrial युवा अंकुर का उपयोग कर अलगाव के लिए एक लोकप्रिय सामग्री (~ 10 दिन पुरानी), पत्तियों सामग्री के रूप में लाइसे कोशिकाओं के लिए एक ब्लेंडर का इस्तेमाल नरम है । की उपलब्धता के साथ Arabidopsis थालियाना T-डीएनए सम्मिलनी नॉक आउट लाइनों, करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए mitochondria शुद्ध करने के लिए सक्षम होने की जरूरत है, पत्ती, जड़ या फूल से mitochondria को अलग करने के लिए तरीकों का विकास आवँयक है ऊतक. कुल मिलाकर अंय पौधों के लिए विकसित तरीके7अच्छी तरह से काम किया, सुविधा के साथ कि सामग्री के पीसने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । Arabidopsis के लिए इस तरीके की एक किस्म में प्राप्त किया जा सकता है (नीचे देखें), और ऊतक प्रकार (जड़ बनाम गोली मार) के बीच अलग है । लगातार ढाल का उपयोग भी विभिंन अंगों या विकास के चरणों से mitochondria के घनत्व के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है मतलब है कि वे अलग से स्थानांतरित कर सकते हैं । इस प्रकार, अधिकतम जुदाई के लिए ढाल का घनत्व सबसे अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है ।

एक बार शुद्ध mitochondria अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन और tRNA के साथ मिलकर प्रयोगों, एंजाइम गतिविधि परख, श्वसन श्रृंखला माप और पश्चिमी दाग विश्लेषण भी शामिल है । पृथक mitochondria भी प्रोटीन बहुतायत के जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लक्षित कई प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) विश्लेषण परिभाषित प्रोटीन के ठहराव के लिए अनुमति देता है, लेकिन महत्वपूर्ण परख विकास की आवश्यकता है । इसके विपरीत, dimethyl द्वारा ठहराव या अन्य आइसोटोप लेबल8, पूरे proteome में अंतर की पहचान करने में एक खोज दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसका उपयोग उपंयास जैविक अंतर्दृष्टि को उजागर करने के लिए किया जा सकता है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल निरंतर कोलाइडयन घनत्व ढाल का उपयोग कर मिट्टी पर उगाया Arabidopsis थालियाना अंगों से बरकरार mitochondria के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है । सामग्री के संग्रह के बाद सभी प्रक्रियाओं बाहर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है ।

1. मध्यम पीसने की तैयारी, बफर, और ढाल समाधान धो

  1. मध्यम पीसने की ३०० मिलीलीटर तैयार (शूंय से ascorbate और cysteine) और २०० मिलीलीटर 2x धोने बफर के प्रति तालिका 1 एक दिन पहले अलगाव के लिए, उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखने के लिए ।
    नोट: एक अंतिम एकाग्रता के लिए सोडियम ascorbate और एल cysteine (मुक्त आधार) जोड़ें १७.८४ mm और २०.३६ mm, क्रमशः, अलगाव की सुबह पर पीसने के माध्यम के लिए । यदि mitochondria पश्चिमी दाग या नीला देशी-polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पृष्ठ) विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, BSA बिना 2x धोने बफर बनाते हैं ।
  2. mitochondrial आइसोलेशन की सुबह (आरेख 1 और तालिका 1) पर ग्रेडिएंट तैयार करें ।
    1. दो चोंच में भारी और हल्का ग्रैडिएंट समाधान करना; प्रत्येक के ३५ मिलीलीटर दो ढाल ट्यूबों के लिए पर्याप्त है ।
    2. जल के साथ ढाल डालने वाला और पीवीसी सिकुड़नेवाला टयूबिंग के चैंबर धो और सुनिश्चित भी सभी टयूबिंग से टयूबिंग के माध्यम से प्रवाह ।
    3. प्लेस 2 केंद्रापसारक ट्यूबों (५० एमएल) पीवीसी सिकुड़नेवाला टयूबिंग ट्यूबों के अंदर के लिए टेप के साथ बर्फ पर एक छोटी सी कोण पर ढाल समाधान सुनिश्चित करने के लिए नीचे ट्यूबों के पक्ष चलाता है ।
    4. भीतरी और बाहरी कक्षों (काले लीवर नीचे) के बीच कनेक्शन बंद करें । भीतरी चैंबर में एक छोटे से हलचल पट्टी के साथ एक चुंबकीय सरगर्मी पर ढाल डालना प्लेस ।
    5. इनर चैंबर (टयूबिंग आउटलेट के साथ चैंबर) में ३५ मिलीलीटर भारी ढाल समाधान डालो । दो केंद्रापसारक ट्यूबों बर्फ पर रखा आधा तक में भारी ढाल समाधान वितरण सिकुड़नेवाला पंप तेजी से सेट की दर के साथ शेष है (३०० एमएल/
    6. बाहरी चैंबर में ३५ मिलीलीटर प्रकाश ढाल समाधान डालो (कक्ष टयूबिंग आउटलेट के बिना) । चैंबरों के बीच कनेक्शन खोलें (आधी तक काले लीवर धक्का) और समाधान धीरे मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं । चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर समाधान मिश्रण ।
    7. समाधान की अनुमति दें धीरे चलाने के लिए (६० एमएल/जब तक सभी ढाल मिश्रण के कक्षों से तिरस्कृत किया गया है दो में जिसके परिणामस्वरूप 0-४.४% (डब्ल्यू/वी) polyvinylpyrrolidone (PVP) ढाल भरा ट्यूबों । ग्रेडिएंट्स को २.१२ चरण में उपयोग करने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें.
      नोट: एक बार ढाल तैयार किया गया है, हल्का पानी के साथ 1x को 2x धो मध्यम पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखना ।

2. Homogenization और Mitochondrial अलगाव

  1. 4 सप्ताह पुराने Arabidopsis कैंची के साथ मिट्टी पर उगाया पौधों से पूरे rosette ऊतक में कटौती, कम से ८० पौधों 1 तैयारी के लिए आवश्यक हो जाएगा ।
    नोट: 10-14 दिन पुरानी जल संस्कृतियों, ंयूनतम 5 बर्तन/प्रस्तुत करने, या 2 सप्ताह पुराने Murashige और Skoog बेसल नमक मिश्रण (एमएस) पर उगाया अंकुर प्लेटों, 4 प्लेटों की ंयूनतम, भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. संयंत्र सामग्री है कि एक पूर्व में छोटे टुकड़ों में काट दिया गया है के आधे प्लेस-4 ° c पीसने मध्यम (1 टेबल) के ७५ मिलीलीटर के साथ बड़े मोर्टार और मूसल ठंडा है, और कई मिनट के लिए बड़े पैमाने पर पीसने जब तक ऊतक के कोई बड़ा टुकड़े छोड़ दिया जाता है ।
  3. निस्पंदन सामग्री की पूर्व गीला 4 परतों (22-25 µm ताकना आकार) मध्यम और फिल्टर homogenate के माध्यम से छानने का माल के 4 परतों के माध्यम से एक प्लास्टिक कीप के माध्यम से एक ५०० मिलीलीटर शंकु कुप्पी में पीसने के साथ ।
  4. पीस मध्यम के एक और ७५ मिलीलीटर के साथ ऊतक के शेष आधा पीस ।
  5. निस्पंदन सामग्री में homogenates गठबंधन और के माध्यम से संभव homogenate के रूप में के रूप में ज्यादा फिल्टर ।
  6. शेष बचे हुए ऊतक को फिर से छानने की सामग्री पर शेष १५० मिलीलीटर पीस मीडियम के साथ, फिर से ५०० मिलीलीटर शंकु कुप्पी में फ़िल्टर करें ।
  7. 5 मिनट के लिए एक निश्चित कोण रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर २,५०० x जी में 8 पूर्व ठंडा ५० मिलीलीटर प्लास्टिक केंद्रापसारक ट्यूबों में फ़िल्टर्ड homogenate केंद्रापसारक ।
  8. डालो साफ केंद्रापसारक ट्यूबों में supernatant (५० मिलीलीटर; ग्रीन गोली परेशान से बचें) और एक निश्चित कोण रोटर में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १७,५०० x g पर केंद्रापसारक ।
  9. आकांक्षा द्वारा सभी को छोड़ दें, लेकिन supernatant के < 3 मिलीलीटर (या धीरे गोली परेशान बिना बंद डालो) । धीरे अवशिष्ट supernatant में गोली एक छोटा सा ठीक तूलिका का उपयोग कर reसस्पेंड ।
  10. प्रत्येक ट्यूब के लिए 1x धोने बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1 साफ केंद्रापसारक ट्यूब में 4 ट्यूबों गठबंधन (यानी, 2 ट्यूबों में जिसके परिणामस्वरूप) ।
  11. ५० मिलीलीटर और दोहराएँ चरण २.७-२.९ के लिए 1x धो बफर के साथ इन ट्यूबों भरें ।
  12. पूल 1 ट्यूब में क्रूड mitochondrial छर्रों एक ड्रॉपर का उपयोग कर और ठीक तूलिका के साथ समान रूप से फैलाने (धोने बफर की एक छोटी राशि इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अंतिम मात्रा से कम 3 मिलीलीटर ढाल के शीर्ष पर फिट होने की जरूरत है) । धीरे 2 सतत 0-४.४% (डब्ल्यू/वी) PVP ढाल पर एक ड्रॉपर के साथ mitochondrial निलंबन परत ।
  13. वजन से संतुलन ट्यूबों (1x धो बफर का उपयोग कर) और ४० मिनट के लिए 4 ° c पर ४०,००० x g पर केंद्रापसारक । सुनिश्चित करें कि विराम बंद कर दिया गया है । Mitochondria ट्यूब के नीचे के पास एक बैंड के लिए विस्थापित हो जाएगा, या ट्यूब के नीचे भारी समाधान में मौजूद हो सकता है (एक बादल, पीले बैंड द्वारा की पहचान की; चित्र 2) ।
  14. ध्यान से आकांक्षा द्वारा mitochondrial बैंड के ऊपर समाधान के ऊपरी 5 सेमी निकालें ।
  15. 2 साफ ट्यूबों में mitochondria युक्त शेष समाधान वितरित और 1x धोने बफर के साथ भरें । समान रूप से एक प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ ट्यूब के मुंह को कवर और कई बार पलटने से कोलाइडयन घनत्व ढाल और mitochondria वितरित । 15 मिनट के लिए ३१,००० x g पर धीमी ब्रेक लगाना के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: इससे पहले कि केंद्रापसारक, सुनिश्चित करें कि mitochondria और शेष कोलाइडयन घनत्व ढाल समान रूप से वितरित कर रहे हैं । अंयथा, कोलाइडयन घनत्व ढाल ट्यूब के तल पर ध्यान केंद्रित करने और mitochondria की गोली रोक सकता है ।
  16. आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें, ५० मिलीलीटर तक 1x धोने बफर के साथ ट्यूब भरें, और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए फिर से पलटना । 15 मिनट के लिए ३१,००० x g पर धीमी ब्रेक लगाना के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए केंद्रापसारक ।
  17. महाप्राण supernatant और के रूप में छोटे एक खंड (~ ५०० µ l) में mitochondrial छर्रों इकट्ठा संभव के रूप में संशोधित २०० पिपेट एल युक्तियों के साथ एक µ का उपयोग कर (टिप कटौती अपने अंत से थोड़ा ऊपर अपनी खोलने में वृद्धि) । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में mitochondria प्लेस और तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर रखने के लिए या-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    नोट: यदि mitochondria सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ), बीएन-पृष्ठ, या immunoblot विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, अंतिम बहाकर (जैसे, चरण २.१५ और २.१६) के लिए BSA के बिना 1x वॉश बफर का उपयोग करें ।
  18. ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग कर mitochondria के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: के लिए बीएन-पृष्ठ केंद्रापसारक पर aliquots 4 ° c, और स्टोर गोली पर-८० ° c उपयोग तक । ऑक्सीजन की खपत माप के लिए, केवल हौसले से पृथक mitochondria इस्तेमाल किया जा सकता है ।

3. ऑक्सीजन की खपत माप

नोट: हौसले से अलग संयंत्र mitochondria द्वारा ऑक्सीजन की खपत एक क्लार्क प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के साथ विश्लेषण किया जा सकता है, mitochondrial अक्षुण्णता के दृढ़ संकल्प को सक्षम करने, cytochrome सी मार्ग गतिविधि, और वैकल्पिक मार्ग गतिविधि ।

  1. सॉफ़्टवेयर स्थापना
    1. ऑक्सीजन की खपत माप के लिए इस्तेमाल कंप्यूटर पर लाइसेंस प्राप्त ऑक्सीजन की निगरानी सॉफ्टवेयर स्थापित करें ।
  2. श्वसन माध्यम, सब्सट्रेट, रासायनिक स्टॉक समाधान, और क्लार्क प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की तैयारी
    1. तैयार श्वसन मध्यम (३०० मिमी सुक्रोज, 10 मिमी NaCl, 5 मिमी KH2पीओ4, 2 मिमी MgSO4, ०.१% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 10 मिमी द्वीतीय (पीएच ७.२)) ऑक्सीजन की खपत परख के लिए इस्तेमाल किया.
    2. mitochondrial श्वसन (तालिका 2) को मापने के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट, अवरोधकों, और प्रभाव तैयार करते हैं । ये पहले से तैयार किया जा सकता है और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
      नोट: इस तरह के उपयोग से पहले NaOH का उपयोग कर पीएच ७.० के लिए कार्बनिक एसिड के रूप में अंलीय समाधान के पीएच बेअसर ।
    3. परख चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) के रूप में एक ही तापमान के लिए श्वसन माध्यम गर्म ।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में क्लार्क प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड को इकट्ठा ।
    5. जगह 1 मिलीलीटर हवा-संतृप्त पानी (हवा संतृप्त पानी सख्ती से मापने कक्ष में एक बड़ी शंकु कुप्पी में पानी की एक छोटी मात्रा में मिलाते हुए प्राप्त की है) । सरगर्मी पर स्विच करने के लिए, "सरगर्मी गति" बटन पर क्लिक करें । "पर" बटन पर क्लिक करें और ६५ rpm को सरगर्मी गति सेट । जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें । 25 डिग्री सेल्सियस पर लगातार पानी हिलाओ ।
  3. ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के अंशांकन
    1. पानी कि परख चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) के रूप में एक ही तापमान के लिए अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा गर्म ।
    2. स्थिर और ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड जांचना करने के लिए वर्तमान के लिए रुको ।
    3. ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के अंशांकन शुरू करने के लिए, "जांचना" बटन पर क्लिक करें, "तरल चरण अंशांकन," चुनें और फिर "हवा संतृप्त पानी."
    4. एक नई विंडो खुलेगी (ऑक्सीजन अंशांकन (तरल चरण)-चरण 5 में से 1) । (चैनल इलेक्ट्रोड नियंत्रण बॉक्स से जुड़ा हुआ है) जांच करने के लिए चैनल का चयन करें और चर दर्ज करें (सेट "चैंबर तापमान" करने के लिए 25 ° c और "वायुमंडलीय दबाव" करने के लिए १०१.३२ केपीए). जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
    5. अगले चरण में (5 के चरण 2), सेटअप सरगर्मी गति (६५ rpm) और क्लिक करें "ठीक है" जारी रखने के लिए ।
    6. 5 के चरण 3 में, एक पठार तक पहुंचने के लिए सिग्नल के लिए प्रतीक्षा करें । शब्द "पठार तक पहुंच गया, प्रेस ठीक जारी रखने के लिए" बॉक्स में दिखाई देगा । जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
    7. 5 के चरण 4 में, 5 मिलीग्राम सोडियम dithionite जोड़कर चैंबर में शूंय ऑक्सीजन की स्थापना । जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
      नोट: ऑक्सीजन एकाग्रता में गिरावट ट्रेस में दिखाई जानी चाहिए और 0 तक पहुंच जाना चाहिए ।
    8. अंशांकन के अंतिम चरण में (5 में से 5 चरण), एक पठार तक पहुँचने के लिए सिग्नल के लिए प्रतीक्षा करें । शब्द "पठार तक पहुंच गया, प्रेस ठीक जारी रखने के लिए" बॉक्स में दिखाई देगा । जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
    9. अंशांकन को बचाने के लिए "अंशांकन सहेजें" पर क्लिक करें । एक नई विंडो खुलेगी । ऑक्सीजन नियंत्रण बॉक्स के लिए नए अंशांकन को सहेजने की पुष्टि करने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
      नोट: सफल अंशांकन के बाद, लेबलिंग "ऑक्सीजन (nmol/एमएल)" y-अक्ष पर दिखाई देगा ।
    10. अंशांकन के बाद, उचित सफाई सुनिश्चित करने के लिए पानी के साथ चैंबर धोने से मापने चैंबर साफ (कम से 5-10 बार) । मापने चैंबर में श्वसन माध्यम के 1 मिलीलीटर प्लेस और झिल्ली ऑक्सीजन की खपत का पता लगाने जब तक कुछ मिनट के लिए equilibrate करने के लिए अनुमति रैखिक है ।
    11. एक अच्छा ढलान देखने पाने के लिए ऑक्सीजन की खपत ट्रेस के पैमाने अनुकूलन । "ज़ूम XY" पर क्लिक करें और चर दर्ज ("ऑक्सीजन" 0-300 और "समय अक्ष" 0-45 मिनट के लिए सेट) ।
  4. mitochondrial अखंडता का निर्धारण
    1. सवार खुला के साथ, प्रतिक्रिया कक्ष के लिए ९७० µ l हवा संतृप्त श्वसन मध्यम जोड़ें.
    2. जोड़ें 30 µ एल अलग mitochondria या कुल mitochondrial प्रोटीन के १५० µ जी के रूप में mitochondria अलगाव के बाद निर्धारित (कुल प्रोटीन की जरूरत है गणना में बाद में शामिल होने के लिए) रिएक्शन चैंबर के लिए एक कट टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर ।
    3. mitochondrial निलंबन लगातार 25 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी बार (६५ rpm) का उपयोग हवा-संतृप्ति समाधान ।
    4. सवार के साथ चैंबर सील, ऑक्सीजन की खपत रिकॉर्ड करने के लिए "शुरू रिकॉर्डिंग" पर क्लिक करें, और ऑक्सीजन की खपत ट्रेस (1-2 मिनट) को स्थिर करने की अनुमति देते हैं ।
    5. 5 मिनट के लिए 10 mM ascorbate और 25 µ एम cytochrome सी जोड़ने के बाद ऑक्सीजन की खपत की दर का निर्धारण करने के लिए "डिटर्जेंट से पहले" दर मिलता है ।
      नोट: ट्रेस में सीधे ही सब्सट्रेट, अवरोधकों, और प्रभाव के अलावा लेबल करने के लिए, "इवेंट मार्क जोड़ें" बटन पर क्लिक करें और संबंधित लेबल पदनाम डालें. जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
    6. ऑक्सीजन की खपत की दर को मैंयुअल रूप से 3 मिनट के लिए ०.०५% (v/v) डिटर्जेंट जोड़ने के लिए "के बाद डिटर्जेंट" दर देने के लिए निर्धारित करते हैं । "रिकॉर्डिंग रोकें" क्लिक करें ।
    7. "चेंज टेबल की दरें" बटन पर क्लिक करें । 2 कर्सर ग्राफ स्क्रीन पर ऊर्ध्वाधर लाइनों के रूप में दिखाई देगा । दर अंतराल निर्धारित करने के लिए ट्रेस में आवश्यक स्थितियों के लिए दर कर्सर की जोड़ी को क्लिक करें और खींचें । दर अंतराल बाएँ दर कर्सर का उपयोग कर ट्रेस के साथ ले जाएँ । दर अंतराल स्वयं सही दर कर्सर का उपयोग कर सेट करें । ऑक्सीजन की निगरानी सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से दो कर्सर के बीच सबसे अच्छा फिट की एक पंक्ति खींचते हुए ट्रेस के साथ दर अंतराल कर्सर ले जा रहा है ।
    8. एक बार वांछित दर अंतराल और स्थिति को परिभाषित किया गया है, 2 कर्सर के 1 पर एक सही क्लिक के साथ तालिका में दर दर्ज करें, और चुनें "तालिका के लिए दर जोड़ें." मुख्य दर तालिका पर दर प्रदर्शित करने के लिए पुष्टि करने के लिए "जोड़ें" बटन क्लिक करें ।
    9. mitochondrial अखंडता की गणना "डिटर्जेंट से पहले" दर "के बाद डिटर्जेंट" दर से विभाजित करके, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है, और यह १०० से घटाना ।
  5. mitochondrial संवेदनाएं का संकल्प
    1. सवार खुला के साथ, प्रतिक्रिया कक्ष के लिए हवा संतृप्त श्वसन माध्यम के ९७० µ एल जोड़ें । जोड़ें ५०० µ एम एटीपी और 30 µ एल अलग mitochondria या १५० µ जी कुल mitochondrial प्रोटीन की प्रतिक्रिया कक्ष में श्वसन माध्यम के लिए एक कट टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर ।
    2. mitochondrial निलंबन लगातार 25 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी बार (६५ rpm) का उपयोग कर हिलाओ ।
    3. बंद सवार, ऑक्सीजन की खपत रिकॉर्ड करने के लिए "रिकॉर्डिंग शुरू" पर क्लिक करें, और ऑक्सीजन की खपत की दर के लिए 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा को स्थिर (जब ऑक्सीजन की खपत ट्रेस रैखिक है) । 5 मिमी succinate जोड़ें । के बारे में 2 मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत की दर रिकॉर्ड ।
      नोट: ट्रेस में सीधे ही सब्सट्रेट, अवरोधकों, और प्रभाव के अलावा लेबल करने के लिए, "इवेंट मार्क जोड़ें" बटन पर क्लिक करें और संबंधित लेबल पदनाम डालें. जारी रखने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
    4. 1 mM adenosine diphosphate (ADP) जोड़ें । 2 मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत की दर रिकॉर्डिंग जारी रखें ।
    5. 1 मिमी नध जोड़ें. 4-8 मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत की दर रिकॉर्ड । यह दर cytochrome oxidase के जरिए श्वसन की क्षमता है.
    6. 1 मिमी पोटेशियम साइनाइड (KCN) जोड़ें (या २.५ µ एम myxothiazol या 5 µ एम antimycin ए) cytochrome सी मार्ग को बाधित करने के लिए, और के बारे में 2 मिनट के लिए वैकल्पिक oxidase के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत का पालन करने के लिए रिकॉर्ड जारी है ।
    7. 5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) और 10 मिमी पाइरूवेट पूरी तरह से वैकल्पिक oxidase को सक्रिय करने के लिए जोड़ें । 5-7 मिनट के लिए रिकॉर्ड करने के लिए जारी रखें: यह वैकल्पिक oxidase की क्षमता है ।
    8. जोड़ें ५०० µ एम एन-propyl gallate (nPG), और रिकॉर्ड के लिए 2 मिनट । यह अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत की दर है कि रासायनिक बाधित नहीं किया जा सकता का आकलन है । दर्ज की गई अंय दरों से इस दर को घटाना, क्योंकि यह मूल में mitochondrial होने की संभावना नहीं है । ऑक्सीजन की खपत अभी भी cytochrome सी और AOX मार्ग (KCN और nPG द्वारा) के निषेध के बाद होने वाली बहुत अलग peroxidases9में संदूषण के रूप में उपस्थित mitochondria से आने की संभावना है ।
    9. "रिकॉर्डिंग रोकें" क्लिक करें ।
    10. "परिवर्तन तालिका की दर" बटन पर क्लिक करें और दो कर्सर में से एक पर एक सही क्लिक के साथ तालिका में दर दर्ज, और "तालिका में दर जोड़ें" का चयन करें । मुख्य दर तालिका पर दर प्रदर्शित करने के लिए पुष्टि करने के लिए "जोड़ें" बटन क्लिक करें ।
      नोट: जब कार्बनिक सॉल्वैंट्स में भंग प्रभाव जोड़ने (उदा, antimycin A, nPG, myxothiazol), चैंबर और सवार इथेनॉल और फिर पानी के साथ उचित सफाई सुनिश्चित करने के लिए कुल्ला किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम एसडीएस द्वारा विभिंन mitochondrial प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम थे-पृष्ठ और immunoblotting । के रूप में चित्रा 3ए में दिखाया गया है, प्रोटीन जल संस्कृति ऊतक से पृथक करने के लिए एक बेहोश बैंड का पता लगाने के लिए पर्याप्त है (2 µ g) । लोड मात्रा के अनुपात में संकेत तीव्रता बढ़ जाती है । प्लेटों (चित्र बी) पर उगाया ऊतकों से अलग mitochondria के लिए, विभिन्न पादी में उच्च प्रकाश तनाव उपचार के लिए प्रतिक्रिया वैकल्पिक oxidase एंटीबॉडी के साथ immunodetection द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

mitochondria की अक्षुण्णता, cytochrome ग मार्ग गतिविधि और वैकल्पिक मार्ग हौसले से अलग mitochondrial नमूनों का उपयोग कर मापा जा सकता है । Mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से वर्णित आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है (चित्र 4a) । अलग सब्सट्रेट, अवरोधकों और अलग mitochondria के लिए प्रभाव जोड़ने, cytochrome सी मार्ग और वैकल्पिक oxidase मार्ग के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 4B) प्रभावित है.

Figure 1
चित्र 1: ग्रेडिएंट की तैयारी के लिए सेटअप. बाएं: केंद्रापसारक ट्यूबों (५० एमएल) पीवीसी सिकुड़नेवाला टयूबिंग ट्यूबों के अंदर के लिए टेप दुकानों के साथ बर्फ पर रखा एक मामूली कोण के साथ; मध्य: सिकुड़नेवाला पंप; ठीक है: एक चुंबकीय सरगर्मी भारी ढाल (इनर चैंबर) और प्रकाश ढाल (बाहरी चैंबर) समाधान युक्त के शीर्ष पर ढाल डालना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Arabidopsis शूटिंग से mitochondria के शोधन एक सतत 0-४.४% (डब्ल्यू/वी) PVP/28% कोलाइडयन घनत्व ढाल का उपयोग कर । डार्क ग्रीन बैंड thylakoids और अंय संदूषणों के रूप में ढाल समाधान के शीर्ष में संकेत दिया है । Mitochondrial अंश एक सफेद-हरा बैंड ट्यूब के नीचे के करीब के रूप में दिखाई दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एसडीएस द्वारा mitochondrial प्रोटीन की जुदाई-पृष्ठ और विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर immunodetection. (क) Mitochondria से पृथक दो सप्ताहीय जल-संस्कृतिया Arabidopsis थालियाना वन्य प्रकार (कोलंबिया-०, कर्नल-०) संयंत्रों को एसडीएस-पृष्ठ के अधीन किया गया और नध के विरुद्ध उठाए गए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई: ubiquinone oxidoreductase उपइकाई S4 ( Ndufs4, At5g67590) । आणविक-भार दाग़ मार्करों जेल के बाहरी लेन पर लोड किया गया और दस प्रतिनिधि बैंड के आकार किलो Daltons (केडीए) में संकेत कर रहे हैं. Ndufs4 प्रोटीन का पता चला की स्पष्ट आणविक द्रव्यमान 18 केडीए का है । प्रोटीन बहुतायत 2 µ g कुल प्रोटीन के मूल्य के सापेक्ष दिखाया गया है । (ख) दो सप्ताह पुराने 3% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज और ०.८% के साथ Gamborg B5 मीडिया पर उगाया अंकुर (डब्ल्यू वी) ७५० µ ई एम-2 एस-1 हाइलाइट (एचएल) को उजागर किया गया और 6 एच के बाद काटा । Mitochondria शुद्ध थे और mitochondrial प्रोटीन थे एसडीएस द्वारा अलग-पृष्ठ और वैकल्पिक oxidase (AOX) के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ जांच की । ३४ केडीए के एक स्पष्ट आणविक द्रव्यमान के साथ एक immunodetectable AOX प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत दिया है. प्रोटीन बहुतायत नियंत्रण के मूल्य (2 µ g) के सापेक्ष दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अलग संयंत्र mitochondria द्वारा ओ2 की खपत के प्रतिनिधि निशान. (क) Mitochondria से पृथक Arabidopsis थालियाना जंगली प्रकार के पौधों (कर्नल-0) के रूप में ऊपर उल्लिखित बाहरी झिल्ली अखंडता के लिए ऑक्सीजन की खपत माप से पहले विश्लेषण किया गया । पृथक mitochondria के 30 µ l (१५० µ g कुल mitochondrial प्रोटीन) का उपयोग किया गया । Mitochondrial अखंडता ९०% के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया था । (ख) ऑक्सीजन उपभोग मापन को Arabidopsis थालियाना वन्य-प्रकार के पादपों से पृथक mitochondria (१५० µ g कुल mitochondrial प्रोटीन) के 30 µ l का प्रयोग किया गया. कुल mitochondrial संवेदनाएं और AOX मार्ग का निर्धारण किया गया । इन आंकड़ों से, cytochrome ग मार्ग और AOX मार्ग के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत का निर्धारण किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मध्यम पीस
रासायनिक एकाग्रता
सुक्रोज ०.३ मीटर
tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10 H2O) 25 एमएम
EDTA disodium नमक 2 मिमी
पोटेशियम फॉस्फेट monobasic (KH2PO4) 10 एमएम
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) 1% (w/
गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) 1% (w/
जल
७.५ को pH समायोजित करें (HCl का उपयोग करके)
नोट: ३०० एमएल पीसने के लिए मध्यम, १.०६ ग्राम सोडियम ascorbate (अंतिम एकाग्रता: १७.८४ मिमी) और ०.७४ ग्राम cysteine (अंतिम एकाग्रता: २०.३६ मिमी) बस का उपयोग करने से पहले जोड़ रहे हैं । इसके अलावा के बाद पीएच की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो 1 मीटर NaOH के साथ ७.५ करने के लिए समायोजित ।
2x धो बफर
रासायनिक एकाग्रता
सुक्रोज ०.६ मीटर
द्वीतीय 20 एमएम
गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) ०.२% (डब्ल्यू/
जल
७.५ के लिए पीएच समायोजित (NaOH का उपयोग)
gradients
भारी ढाल समाधान (४.४% (डब्ल्यू/ 2 ढाल ट्यूबों
2x धो बफर १७.५ एमएल
Colloidial घनत्व ढाल ९.८ एमएल
PVP-४० (20% (डब्ल्यू/ ७.७ एमएल
प्रकाश ढाल समाधान (0% (डब्ल्यू/ 2 ढाल ट्यूबों
2x धो बफर १७.५ एमएल
Colloidial घनत्व ढाल ९.८ एमएल
जल ७.७ एमएल

तालिका 1: mitochondria आइसोलेशन के लिए उपयोग किए गए बफ़र्स और ग्रेडिएंट्स की संरचना.

संक्षिप्त स्टॉक समाधान की एकाग्रता भंडारण अंतिम एकाग्रता 1 मिलीलीटर प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा गया वॉल्यूम
substrates
Cytochrome ग Cyt ग २.५ मिमी (एच2O में) -20 डिग्री सेल्सियस 25 माइक्रोन 10 μl
नध नध ०.१ मीटर (एच2ओ में) -20 डिग्री सेल्सियस 1 मिमी 10 μl
succinate Succ ५०० मिमी (एच2O में) -20 डिग्री सेल्सियस 5 मिमी 10 μl
inhibitors
Antimycin एक AA 1 मिमी (ेतोः में) -20 डिग्री सेल्सियस 5 माइक्रोन 5 μl
साइनाइड KCN १०० मिमी (एच2O में) 4 ° c 1 मिमी 10 μl
Myxothiazol Myxo ५०० माइक्रोन (ेतोः में) -20 डिग्री सेल्सियस २.५ माइक्रोन 5 μl
एन-Propyl gallate nPG १०० मिमी (ेतोः में) -20 डिग्री सेल्सियस ५०० माइक्रोन 5 μl
प्रभाव
adp adp १०० मिमी (एच2O में) -20 डिग्री सेल्सियस 1 मिमी 10 μl
ascorbate ए ५०० मिमी (एच2O में) उपयोग के दिन पर ताजा करें 10 एमएम 20 μl
एटीपी एटीपी १०० मिमी (एच2O में) -20 डिग्री सेल्सियस ५०० माइक्रोन 5 μl
Dithiotreitol डीटीटी 1 मीटर (एच2ओ) उपयोग के दिन पर ताजा करें 10 एमएम 10 μl
पाइरूवेट Pyr 1 मीटर (एच2ओ) -20 डिग्री सेल्सियस 10 एमएम 10 μl
डिटर्जेंट 10% (v/v) (H2O में) 4 ° c ०.०५% (वि. वि./ 5 μl

तालिका 2: ऑक्सीजन की खपत माप के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट, अवरोधकों और प्रभाव की सूची.

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Discussion

आमतौर पर, अलगाव से mitochondria के Arabidopsis पत्तियों की पैदावार 3 mitochondria से मिलीग्राम लगभग ८०-१०० ३-4 सप्ताह पुराने पौधों, हालांकि अधिक से अधिक की पैदावार 5 मिलीग्राम अक्सर पूरी तरह से पीसने के साथ प्राप्त किया जा सकता है । उपज विकास की स्थिति के साथ बदलता है और नाटकीय रूप से पत्तियों senesce के रूप में कम हो जाती है, हालांकि mitochondria संरचना वार्धक्य के दौरान अच्छी तरह से बनाए रखा लगता है9। एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण सुविधाओं में से एक mitochondria जारी करने के लिए लाइसे कोशिकाओं को पीसने की विधि है । जबकि यांत्रिक पीसने तंत्र के एक नंबर खरीद के लिए उपलब्ध हैं, एक मोर्टार में पीसने Arabidopsis के लिए और मूसल उपज के मामले में लगातार अच्छे परिणाम प्राप्त है, क्योंकि यह organelles को थोड़ा नुकसान के साथ कोशिकाओं lyses । जबकि यांत्रिक grinders तेजी से कर रहे हैं, वे अनुकूलन और आवश्यक पीसने की मात्रा ऊतक के अनुसार भिंन हो सकते है की आवश्यकता है । एक मोर्टार और मूसल के साथ, यह अक्सर सुविधाजनक और अधिक कुशल अगर ऊतक कटा हुआ है या पीसने से पहले एक चाकू या कैंची के साथ काट रहा है । के रूप में उल्लिखित, सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना चाहिए और शुद्ध mitochondria के एक धोया गोली प्राप्त करने के लिए पीसने के अंत से पूरी प्रक्रिया लगभग 4 एच ले जाना चाहिए । के रूप में डिटर्जेंट या ट्यूब या ढाल डालने वालों पर अंय एजेंट के निशान नाटकीय रूप से उपज को कम कर सकते हैं, इन प्रक्रियाओं में इस्तेमाल सभी घटकों डिटर्जेंट बिना धोया और अंय प्रक्रियाओं में इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि mitochondria पर्याप्त ढाल पर अंय भागों से अलग कर रहे है उंहें हटाने और धोया जा करने की अनुमति है । यदि वे भी ट्यूब के नीचे के पास हैं, इसका मतलब है कि प्रकाश और भारी समाधान के मिश्रण को समायोजित करने की जरूरत है, भारी समाधान की अधिक अनुमति के लिए मिश्रण से पहले डालना । इसके विपरीत, अगर बैंड फैलाना प्रतीत होता है और ट्यूब में उच्च है, मिश्रण एक छोटे से पहले होने की जरूरत है.

यहां उल्लिखित विधि आसानी से Arabidopsis फूल और रूट ऊतक11,12से mitochondria के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जड़ों के लिए, यह hydroponic संस्कृति में विकसित करने के लिए सुविधाजनक है और mitochondria के 2 मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए ताजा वजन के १०० जी की जरूरत है । पीसने जड़ों के लिए छोटे टुकड़ों में कटौती से पहले एक मोर्टार और मूसल में पीसने के लिए किया जाना चाहिए, और वृद्धि की पैदावार पुनः द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जड़ ऊतक पीसने, या तो एक मोर्टार और मूसल में या एक ब्लेंडर में । पुष्प ऊतक जहां mitochondrial समारोह अक्सर बढ़ाया है13के लिए, एक मोर्टार और मूसल के साथ पीसने अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन सामग्री की सीमित मात्रा का मतलब है कि पौधों की एक बड़ी राशि के लिए फसल के ऊतकों को उगाया जा करने की जरूरत है । Mitochondria Arabidopsis अंगों की एक किस्म से अलग किया गया है इसी तरह के तरीकों या मामूली संशोधनों का उपयोग कर14,15 और चावल (धान्य sativa)16से ।

ऊपर वर्णित विधि की सीमाएं हैं i) mitochondrial अलगाव के लिए आवश्यक बीजों की बड़ी मात्रा, ii) केवल विशिष्ट ऊतकों से Arabidopsis और इस अलगाव विधि में लागू चावल, iii) विभिन्न संदूषणों की छोटी मात्रा (जैसे peroxisomal प्रोटीन) अभी भी शुद्ध mitochondria में मौजूद । Mitochondria ऊपर वर्णित तरीकों का उपयोग कर प्राप्त अध्ययन की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं, ऑक्सीजन से अधिक अध्ययन मात्रात्मक जन प्रोटीन बहुतायत के स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण को लेकर । ग्रेडिएंट शुद्ध mitochondria में अभी भी विभिन्न दूषित पदार्थों, जैसे कि peroxisomal प्रोटीन3की छोटी मात्रा शामिल होगी । mitochondrial प्रोटीन में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए निर्धारित organelle सूचियों के साथ तुलना का उपयोग किया जा सकता है, जब तक गैर-mitochondrial प्रोटीन द्वारा संदूषण की मात्रा छोटी है (< 10%) और इसी तरह के नमूनों की तुलना की जाती है, इसलिए इस प्रकार के और अंश गैर mitochondrial प्रोटीन के समान है । एसडीएस द्वारा प्रोटीन बहुतायत का विश्लेषण-पृष्ठ या अंय जेल आधारित दृष्टिकोण mitochondria (2-20 µ जी) की अपेक्षाकृत छोटी मात्रा के साथ किया जा सकता है, mitochondria की मात्रा बदलती का उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने की रैखिकता की जांच(चित्रा 3) । जबकि porin (वोल्टेज निर्भर आयनों चैनल (VDAC)) अक्सर ठहराव के लिए एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है, हमारे अनुभव में इस प्रोटीन की अपेक्षाकृत बड़ी बहुतायत मतलब कर सकते है कि प्रतिक्रिया अक्सर रैखिक नहीं है अगर प्रोटीन की बड़ी मात्रा में जेल पर लोड कर रहे है , तो एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के रैखिकता हमेशा इस तरह के लोड हो रहा है नियंत्रण का उपयोग करते समय जाँच की जानी चाहिए. mitochondria को अलग करने के इस दृष्टिकोण का महत्व है कि ढाल के विपरीत है कि सामग्री के रूप में सुक्रोज का उपयोग करने के लिए घनत्व ढाल फार्म, कोलाइडयन घनत्व ढाल परासरणी पुनः समायोजन की आवश्यकता नहीं है के रूप में शुद्ध mitochondria के साथ की आवश्यकता है सुक्रोज. इसका मतलब यह है कि वहां rupturing शुद्ध mitochondria की कम संभावना है और धोने के बाद कोलाइडयन घनत्व सामग्री को दूर करने के लिए, वे सीधे एक किस्म की परख या अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

ऊतक दाग, जहां mitochondrial प्रोटीन पूरी पत्ती या ऊतक निष्कर्षों से पता चला रहे हैं, एक आकर्षक दृष्टिकोण है कि ऊतक में mitochondrial प्रोटीन की मात्रा को मापने के लिए कर रहे हैं । अंय organelles की तुलना में mitochondria की आम तौर पर कम मात्रा को देखते हुए, पूरे ऊतक निष्कर्षों पर mitochondrial प्रोटीन का पता लगाने के लिए कुछ सावधानी के साथ व्याख्या की जरूरत है, के रूप में mitochondrial प्रोटीन ऐसे दृष्टिकोण में पता लगाने से परे हो सकता है । सावधान नियंत्रण, जहां शुद्ध mitochondria ऊतक निष्कर्षों के साथ electrophoresed रहे है के लिए समान प्रवास और पता लगाने की रैखिकता सुनिश्चित करने के लिए बाहर किए जाने की जरूरत है इस तरह के दृष्टिकोण में विश्वास है ।

एक क्लार्क प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की मदद से, एक समाधान के ऑक्सीजन आंशिक दबाव में परिवर्तन मापा जा सकता है । वास्तविक इलेक्ट्रोड एक प्लैटिनम कैथोड और एक चांदी anode, जो एक KCl पुल से जुड़े हुए हैं और एक इलेक्ट्रोलाइट-गीला कागज (सिगरेट कागज) और एक ऑक्सीजन-पारगंय झिल्ली (polytetrafluoroethylene झिल्ली) द्वारा कवर के होते हैं । ६००-७०० एमवी की एक वोल्टेज ऑक्सीजन की कमी करने के लिए सुराग, ऑक्सीजन एकाग्रता और वोल्टेज के बीच एक रैखिक संबंध दे रही है. ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड विभिन्न कंपनियों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. प्रत्येक कंपनी के अपने स्वयं के विधानसभा और ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के सेटअप के बारे में निर्देश होगा । हालांकि, सामांय में चांदी anode और प्लेटिनम कैथोड इलेक्ट्रोड डिस्क की मदद से एक इलेक्ट्रोड सफाई किट या विधानसभा से पहले एक रबड़ कलम की सहायता से साफ किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि हवा बुलबुले विधानसभा के दौरान फार्म नहीं (जैसे polytetrafluoroethylene डायाफ्राम और सिगरेट कागज के बीच). विधानसभा के बाद, इलेक्ट्रोड डिस्क की जरूरत है प्लेटिनम कैथोड प्रतिक्रिया कक्ष के आधार पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ चैंबर से जुड़ा हुआ है । चैंबर ही तापमान नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए एक पानी की जैकेट से घिरा हुआ है । यह बहुत महत्वपूर्ण है कि चैंबर हमेशा पानी से भरा छोड़ दिया है, के बाद से झिल्ली सूख जाएगा और अंयथा दरार । इसी तरह, झिल्ली पिपेट या सीरिंज जब चैंबर के लिए यौगिकों जोड़ने से छुआ नहीं होना चाहिए, फाड़ से बचने के लिए.

परख करने से पहले, श्वसन माध्यम परख चैंबर के रूप में एक ही तापमान के लिए गर्म किया जाना चाहिए (ज्यादातर मामलों में 25 डिग्री सेल्सियस) और झिल्ली कुछ मिनट के लिए श्वसन बफर में equilibrate की अनुमति दी जानी चाहिए । ऑक्सीजन की खपत परख के लिए सवार बंद करने के बाद, प्रभाव अणुओं के अलावा या तो गैर डिस्पोजेबल microliter सीरिंज का उपयोग किया जाना चाहिए (जैसे माइक्रो सीरिंज) या डिस्पोजेबल जेल लोड हो रहा है पिपेट युक्तियाँ. यदि माइक्रो सीरिंज का उपयोग कर, यह सुनिश्चित किया जाना है कि सिरिंज अच्छी तरह से १००% इथेनॉल और अतिरिक्त के बीच पानी के साथ कुल्ला है, दूषित स्टॉक समाधान से बचने के लिए. यह भी माप के बीच चैंबर की धुलाई के लिए लागू होता है । अधिकांश ऑक्सीजन की खपत परख में इस्तेमाल किया एजेंट पानी में घुलनशील है और आसानी से पानी के साथ कई धोने द्वारा हटाया जा सकता है (लगभग पांच बार) माप के बीच । हालांकि, कुछ परख के लिए इस्तेमाल किया रसायनों केवल कार्बनिक सॉल्वैंट्स, जैसे antimycin ए, myxothiazol, और nPG में घुलनशील हैं । इसलिए, चैंबर की जरूरत है एक कार्बनिक विलायक (५०% (v/v) इथेनॉल के साथ कुल्ला करने के लिए इन अणुओं के अवशिष्ट निशान हटाने के लिए, और फिर पानी के साथ (लगभग पांच बार) के अवशेषों को चूस ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई विरोध नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद में उत्कृष्टता के केंद्र संयंत्र ऊर्जा जीवविज्ञान CE140100008, एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप (FT130100112) MWM के लिए, और एक फ़ेयोडोर Lynen रिसर्च फैलोशिप (अलेक्जेंडर वॉन पीरु द्वारा समर्थित किया गया था फाउंडेशन, जर्मनी) जे एस के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

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References

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Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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